2024届高三生物专项复习课件：PCR技术

这是一份2024届高三生物专项复习课件：PCR技术，共48页。PPT课件主要包含了PCR技术基础知识，PCR的计算，实时荧光定量PCR等内容，欢迎下载使用。
1.全称： ； 2.原理： ； 3.条件：①缓冲液：含有 ，目的是 ；②模板：DNA双链；③原料：4种 ，既作为 又作为 ；④酶： 的 酶；⑤引物： 种，使DNA聚合酶能从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。
（1）子代DNA分子等长的DNA分子数为：_________个（2）子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：_________个（3）子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__________个（4）子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：____个（5）复制过程中共需引物________个（6）第n次复制需要引物_________个
PCR的应用——引物的设计与选择
3.设计引物的前提是 。若要在引物中添加限制酶酶切位点，应添加在引物的 端。
已知目的基因两端的脱氧核苷酸序列
4.用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（ ）
题型：利用PCR获取目的基因
“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(　　)
A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
反向PCR之扩增未知序列
反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。
若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
重叠延伸PCR（融合PCR）之应用
重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。
PCR的应用——利用重叠延伸PCR进行定点诱变
6.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是（      ）A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链DNA)。 (3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_____________________________________________。
(3)3　引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用
(3) T－A或C－G　A或G　
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变需进行两轮PCR反应即可获得,过程如图所示。下列叙述不正确的是( )。
A.第一轮PCR过程中复性所用的温度与第二轮PCR复性的温度不一样B. PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状,该定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链D.将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),属于蛋白质工程
重叠延伸PCR（融合PCR）之连接基因
融合PCR技术是采用具有互补末端的引物,将不同来源的扩增片段连接起来构建融合基因的方法,其过程如下图9所示。
PCR的应用——利用融合PCR技术连接两个基因
7.图1表示融合PCR技术的过程示意图（P1～P4表示引物），请回答下列问题：
（1）图1第一阶段中PCR至少进行______次循环，才能获得步骤1中的产物，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。（2）若通过融合PCR技术将启动子、目的基因、终止子拼接起来，需要设计________种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有________种。
（3）图1所示的步骤2的2次PCR应该分别如何选择引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）。
（4）融合PCR步骤2中基因A、B融合形成一个基因的机制是 ， 此过程是不需要引物的，可能是因为 ，但需要加入 酶，若融合基因第二次PCR最终扩增出64个融合基因，理论上该过程消耗了 个引物.
引物1和引物3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在耐高温的DNA聚合酶的作用下向两边延伸，基因AB完成融合
两条链重叠部位互为另一条链的引物
（5）图2中电泳图中___________号条带最可能表示融合后片段，若PCR反应没有扩增出任何产物，则可能的原因是________________________（至少两点）。
复性温度太高；引物设计不合理，无法与目的基因结合
通常涉及两轮连续PCR反应，需要设计两对引物，第一轮PCR是用一对外引物扩增得到包含目的片段的较长产物，将其经过稀释以后作为第二轮PCR的模板，再用另一对内引物进行第二轮PCR，得到的产物为目的片段。
使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。因此，巢式PCR的扩增特异性很强。
为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR技术进行改良，发明了巢式PCR，原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物（外引物）对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物（内引物或巢式引物）结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段（即目的基因），最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如图所示。下列叙述错误的是（ ）A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低D．普通PCR与巢式PCR相比，特异性更强，错误率更高
是扩增单链 DNA的一种方法，基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA，常见的为引物浓度不对称PCR。
两引物的浓度不同，其中浓度低的为限制性引物，起决定性作用，只有当限制性引物耗尽后才会开始大量产生单链DNA；浓度高的为非限制性引物。前10-15循环为双链产物，而后为单链。
目的基因表达检测过程中需要大量探针,若仅扩增探针这段单链,需要利用不对称PCR,即采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物被耗尽,以后的探针循环只产生高浓度引物的延伸产物,结果产生大量的单链 DNA。这两种引物分别引物1引物2,为限制性引物与非限制性引物,其最佳比例一般为1:50~1:100。据此分析,图3中的引物_____应该为非限制性引物。假设反应体系中原来有1个模板DNA分子,最初25个循环扩增产生双链 DNA,后15个循环均只扩增一条链,则需要非限制性引物 个。
前25次需要非限制性引物和需要限制性引物一样,也是=225一1个,后15次,需要利用前25次扩增到的DNA为模板,需要非限制性引物= 225 ×15,所以一共需要非限制性引物为225一1 ＋ 225 ×15 =225×16-1=229—1(个)。
一、荧光定量PCR原理荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以探针法荧光定量PCR为例：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
PCR的应用——实时荧光定量RT－PCR技术
（1）探针带着淬灭基团可吸收荧光基团发出的光，此时是没有荧光的。根据图所示可知，DNA单链合成的过程中，________ 酶会“消化”掉探针，使荧光基团游离出来。每扩增一条DNA链，就有________荧光分子产生。
荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当热稳定DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是（）
检测是否有新冠病毒RNA
新冠病毒RNA的量太少无法检测出来
PCR只能扩增双链DNA
将新冠病毒的RNA通过逆转录后形成DNA
PCR扩增逆转录后的DNA
实时荧光定量PCR可以在扩增DNA的同时进行检测。
所谓“实时荧光定量PCR” 是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序及信号强弱的变化来即时分析模板DNA的拷贝数目，通过与加入已知量的标准品进行比较较，可实现实时定量。
一、PCR扩增过程中荧光信号强度变化的变化规律
1.用荧光标记扩增产物，随着循环次数的增加，荧光信号逐渐增强，如图所示。
①早期:扩增产物较少，荧光信号不易检测到
②指数期:荧光值随循环次数增加呈指数增加。
③线性期:荧光值随循环次数增加呈线性增加。
④平台期:荧光值随循环次数增加几乎不增加。
Taq酶活性下降引物浓度下降原料P浓度下降
二、相同DNA模板，在同一台PCR仪器上重复扩增曲线图
通过重复扩增曲线发现，在指数期的早期，重复实验的结果是一致。
在荧光扩增曲线的指数增长期的早期，认为设定一个荧光强度标准，称为荧光阈值。如图所示。
荧光阈值是人为设定的，可以设定在指数扩增期早期的任意位置上。该位置上，在重复实验中，荧光值是相同的。
四、Ct值(循环阈值)
PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光值时所经过的扩增循环次数。
如图，两个不同样品(样品1和2)DNA经过PCR扩增，得到的Ct值为Ct1和Ct2。
样品中DNA的含量越多，其Ct值就越小。
因此，样品1中的DNA含量较样品2中的DNA含量多。
样品中DNA(模板DNA)的量与Ct值呈线性关系(负相关)
根据样品扩增的Ct值就可以计算出样品所含的模板DNA量。
我国新冠肺炎防治最新诊疗方案(第9版)规定
奥密克戎变异病毒毒力降低
习题：新型冠状病毒是一种单链RNA病毒，新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经__________酶作用生成cDNA。然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图1）。
① 当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因退火时，通过______________________ 原则而特异性结合。②在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈_________（正相关或反相关反）关系。
(3)通过实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有_________。
Taq酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降等。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就_________。
③某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为_________。