高中生物专题5 DNA和蛋白质技术课题3 血红蛋白的提取和分离试讲课课件ppt

这是一份高中生物专题5 DNA和蛋白质技术课题3 血红蛋白的提取和分离试讲课课件ppt，共53页。PPT课件主要包含了实验过程，实验原理，实验装置，第2组实验实验结论等内容，欢迎下载使用。
生活情境：一张血常规化验单
资料1贫血是指人体外周血红细胞容量减少，低于正常范围下限的一种常见临床症状。由于红细胞容量测定较复杂，临床上常以血红蛋白浓度来代替。
资料31951 年，鲍林在研究血红蛋白结构的基础上，结合他对肽链和肽平面化学结构的理论，提出了α螺旋和β折叠的蛋白质二级结构的理论。（鲍林凭此杰出的贡献荣获了 1954 年的诺贝尔化学奖）。 血红蛋白也是人类最早较系统地阐明结构和功能的生命类重要化合物， 最早人类分子病发生的原因阐明即是基于对血红蛋白的研究。
资料21825年，化学家恩格尔哈德发现动物血红蛋白中铁的比例总是恒定的。根据铁原子的质量， 他计算出血红蛋白的分子量为 4×16000。这是历史上首次确定的蛋白质分子量。1925 年，英国科学家代尔用 渗透压测定大分子量的方法证实了恩格尔哈德的结果。
重走血红蛋白提取和分离之路
SteP1 兔血样品处理与粗分离
（1）用Na2HPO4和NaH2PO4配制磷酸缓冲液（20mml/L）
实验准备-实验步骤-实验评价
生物体内的进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外溶液的pH 与体内环境中的pH基本一致。
取100ml烧杯，加入溶有3g柠檬酸钠的50ml的生理盐水，再加入50ml的血，搅拌、稀释。4℃冰箱保存。
样品处理（红细胞洗涤-血红蛋白的释放-分离血红蛋白溶液-）-粗分离
吸取15ml兔血稀释液到25ml离心管，低速短时间离心。再用胶头滴管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入25ml烧杯，加入5倍体积的生理盐水，用磁力搅拌器缓慢搅拌10min。
500r/min离心2min
2500r/min离心10min
将洗涤好的红细胞约（2ml）+5倍体积的蒸馏水+3倍体积的甲苯混合，磁力搅拌器搅拌10min 。
将上述混合液2000r/min离心10min。溶液将分为4层
透析：去掉液体中的小分子物质。
取2ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mml/L的磷酸缓冲液中（PH=7.0），透析12h。4℃冰箱保存。
习题反馈1 将经处理破裂后的红细胞混合液以2000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是(　　 )A．血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层B．甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层C．脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D．甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层
六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术
SteP2 凝胶色谱法纯化血红蛋白
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
凝胶色谱柱的制作-交联葡聚糖凝胶的预处理-凝胶色谱柱的装填-平衡-样品的加入和洗脱-收集
一种方法是用蒸馏水浸泡24h溶胀；另一种方法是用20mml/L的磷酸缓冲液（PH为7.0）加热2-3小时溶胀。第二种方法不仅时间短，还能除去凝胶中可能带有的微生物，排除凝胶内的空气。
1、将色谱柱垂直固定在铁架台上2、关闭色谱柱下端出口，打开色谱柱上端入口3、将预处理好的凝胶自柱顶部管内壁缓 缓加入柱中4、待底部凝胶沉积1cm高时，打开出口，继续加入凝胶至一定高度5、色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装
1、装填完毕后的凝胶色谱柱，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下进行洗脱2、用300mL的物质的量浓度为20mml/L的磷酸缓冲溶液（pH为7.0）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密3、装填时可以轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀
（PS：磷酸缓冲溶液的作用为在一定范围内，能对抗外来大量强酸、强碱对pH的影响，维持pH基本不变）
待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集
习题反馈2 用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质(　　)A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快
SteP3 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（纯度鉴定）
电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
带电性质、分子大小和形状
分离大分子核酸、大的蛋白质
分离蛋白质、测定蛋白质分子量
SDS作用: 使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链。 SDS与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
实验过程：配置试剂-灌胶、插入梳子-点样-电泳-染色-脱色
配制各种试剂(30%的凝胶混合液、10%SDS、10%过硫酸铵溶液、配制电泳缓冲液)
把分离胶液灌入玻璃制胶板内距梳齿底端0.5-1cm处，缓慢加入蒸馏水进行液封，待蛋白胶凝固后倒出蒸馏水用吸水纸吸干残留的水，加入浓缩胶液，插入梳子，待浓缩胶凝固即可。
电泳时先调电压80V进行电泳，待溴酚蓝指示带进入分离胶后调电压120V电泳至指示带距下端约1-2cm处停止电泳。
电泳结束后小心取出凝胶放入盛有已配置好染色液的培养皿中，置于蛋白染色震荡摇床中染色2h。
染色结束后取出凝胶放于脱色液中，震荡脱色4～8h，中间可更换脱色液2～3次。
习题反馈3 下列关于电泳的说法不正确的是(　　)A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁 移的过程B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极 移动C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的 电泳迁移率完全取决于分子的大小
资料4 1961 年，德国科学家布劳恩 在《 Hpp-Seyler 生理化学杂志》上，详尽列出血红蛋白A的α链(141 个氨基酸）、 β链（146 个氨基酸）和肌红蛋白（ 155 个氨基酸）等一级结构的全部氨基酸顺序。由此阐明血红蛋白 A（α2β2）含有574个氨基酸，分子量为 64450 。1967 年，佩鲁茨完成了对血红蛋白的高分率测定。 这项工作从开始到完成历时 30 年，终于画上了圆满句号 。 血红蛋白空间结构的测定， 使科学家对血红蛋白功能的了解更加深入。
资料5血红蛋白研究的历史是生物化学和分子生物学发展的一个微观缩影。 有关它的每一项研究， 都见证了生物化学和分子生物学的进步，折射了近、现代生物学的发展历程。
SteP4 探究血红蛋白运输O2和CO2的功能
制取氧气并通入样本（高锰酸钾加热 固固加热型）
制取二氧化碳并通入样本（碳酸钠与盐酸 固液型）
2KMnO4===K2MnO4+O2+MnO2
Na2CO3+2HCl===2NaCl+H2O+CO2
利用血红蛋白可以结合氧并显红色（动脉血）的性质，将制得的氧气通入血红蛋白样品观察显色。
实质上血红蛋白的这种性质是由于其中的血红素含有亚铁离子，其易与氧气、二氧化碳、一氧化碳以及氰离子等结合（结合紧密程度不同）所以可以起到运输氧气、二氧化碳的作用
利用血红蛋白可以结合二氧化碳并显暗红色（静脉血）的性质，将制得的二氧化碳通入血红蛋白样品观察显色。
第1组实验：步骤1：将Na2CO3固体和8％HCl溶液混合并将产生的CO2通入实验组兔血红蛋白溶液，与对照组兔血 红蛋白溶液比较，观察颜色变化；
第1组实验：步骤2：用Fe3+催化H2O2并将产生的O2通入步骤1处理后的实验组兔血红蛋白溶液，观察颜色变化。
该实验在经多次重复试验后，血红蛋白都倾向与通入氧气时变为深红，在通入二氧化碳时偏红或无现象，这与预测相反。假设一：血红蛋白真的能携带氧气和二氧化碳吗？
修改实验方案：将血红蛋白溶液换成血液，再进行实验探究。
第2组实验：步骤1：将Na2CO3固体和8％HCl溶液混合并将产生的CO2通入实验组兔血溶液，与对照组兔血溶液比较，观察颜色变化；
第2组实验：步骤2：加热KMnO4固体并将产生的O2通入步骤1处理后的实验组兔血溶液，观察颜色变化。
实验现象证明，血液中血红蛋白可以与氧气结合显鲜红色。同时血液中血红蛋白也可以与二氧化碳结合显暗红色。
该实验在经多次重复试验后，血红蛋白都倾向与通入氧气时变为深红，在通入二氧化碳时偏红或无现象，这与预测相反。假设二：血红蛋白在制造氧气和二氧化碳时因氧化还原或高温失活，丧失其运载氧气与二氧化碳的性质。
修改实验方案：在盛放血红蛋白的试管和氧气发生装置之间增加了冷却装置，但是血红蛋白仍然会变黑。
假设三：血红蛋白在过量、过纯的氧气作用下生成高铁血红蛋白（MetHb）。资料：血红蛋白每一血红蛋白分子由四分子的珠蛋白和四分子亚铁血红素组成，每个血红素又由4个吡咯环组成，在环中央有一个铁原子。血红蛋白中的铁在二价状态时，可与氧呈可逆性结合(氧合血红蛋白)，如果铁氧化为三价状态。血红蛋白则转变为高铁血红蛋白，就失去了载氧能力。高铁血红蛋白成暗褐色或暗红色，并且不与氧气、二氧化碳结合。要验证假说三，我们还得再探究。。。
部分蛋白质研究方面获得诺贝奖情况