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新高考生物二轮复习讲练测第18讲 基因工程（讲义）（2份，原卷版+解析版）
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考点01 基因工程
★ 考向1 基因工程的理论基础
1、基因工程的理论基础
外源基因在受体细胞内表达
理论
基础
①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能的基本单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
重组DNA：
载体+目的基因
复
制
转录
RNA
翻译
蛋白质
基因拼接
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②DNA分子都遵循碱基互补配对原则。
③双链DNA分子的空间结构都是双螺旋结构。
基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
易错警示：辨析农杆菌转化法中的两次拼接与两次导入
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
DNA的粗提取与鉴定
原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2ml/L的NaCl溶液。
鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色
实验流程：研磨→过滤→离心→加冷酒精→鉴定
★ 考向2 PCR
1、PCR的原理与条件等
PCR反应过程
第一步：加热至90～95℃DNA解链；
第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
★ 考向3 蛋白质工程
1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2、基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
3、蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质（如下图）。
1、（2023·广东）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【解析】DNA粗提取和鉴定的原理：
1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14ml/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
A.裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；
B.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2ml/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；
C.DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；
D.将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
故选D。
2．（2023·湖北）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
【答案】D
【解析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。
A.若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。
B.若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
C.DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
D.SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
故选D。
3、（2023·山东）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2 a链
(3) J-V5融合蛋白 不是
【解析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
4．（2023·湖北）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
（1）与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
（4）构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
【答案】(1) 不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
（3）通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【解析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原－抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。
故选④。
5、（2023·全国）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
【答案】(1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
(2) 终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
（3）密码子具有简并性
（4）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【解析】有关密码子，考生可从以下几方面把握：
①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。
②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。
（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
（3）正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
基因工程和蛋白质工程代表了生物科学技术的前沿，体现了生物科学的应用性和创新性，因此在高考命题中基因工程是高频考点，也是必考点，试题情境专业性较强，常涉及PCR技术、电泳技术和基因表达的调控机制等，结合生活、生产、临床实践，探究科技前沿，渗透生命观念和社会责任。
题型01 基因工程的基本操作
1、伯格首先在体外进行了 DNA 改造的研究，成功地构建了第一个体外重组 DNA 分子。下列相关叙述正确的是（ ）
A．不同的DNA分子必须用同一种限制酶切割，才能产生相同的黏性末端
B．DNA连接酶、DNA聚合酶，RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键
C．当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是平末端
D．E·cliDNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端
【答案】B
【解析】
A、有些不同的限制酶切割后也可能会产生相同的黏性末端，A错误；
B、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键，B正确；
C、当限制酶在它识别的序列的中心轴两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，C错误；
D、E•cliDNA连接酶只能“缝合”黏性末端，不能“缝合”平末端，D错误。
2、限制酶、DNA连接酶等的发现为DNA分子的切割，连接及基因表达载体的构建创造了条件。下列关于重组DNA技术基本工具的叙述，正确的是（ ）
A．限制酶在原核细胞内的主要作用是切割修剪自身的DNA
B．噬菌体、动植物病毒均可作为载体将外源基因导入受体细胞
C．用作载体的质粒DNA分子上可以不含有限制酶切割位点
D．DNA 连接酶可连接DNA分子两条链中碱基对之间的氢键
【答案】B
【分析】1、基因工程又叫作重组DNA技术，是指按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，具有特异性，即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
【详解】A、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，其在原核细胞中的主要作用是切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的，A错误；
B、将外源基因导入受体细胞，常常需要将目的基因与运载体结合构建基因基因表达载体，常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒，B正确；
C、作为载体的质粒上有限制酶的切割位点，这是质粒作为运载体的条件之一， C错误；
D、DNA 连接酶是连接的磷酸二酯键，D错误；
3、CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列
C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。
【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。
4、将溶葡球菌酶基因转入奶牛基因组中获得转基因牛，在其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎，使感染率下降。下列叙述错误的是（ ）
A．上述操作至少需要三种分子工具：限制酶、DNA聚合酶、载体
B．可以通过PCR以及构建基因文库等方法来获取溶葡球菌酶基因
C．构建基因表达载体时，需加入乳腺中特异表达的基因的启动子
D．溶葡球菌酶基因与奶牛DNA都为双螺旋结构是二者拼接的基础
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建： 是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、上述操作采用了基因工程技术，该技术至少需要三种分子工具：限制酶、DNA连接酶、载体，A错误；
B、葡球菌酶基因为目的基因，获取目的基因的方法有PCR、构建基因文库等，B正确；
C、要使目的基因只在乳腺组织中特异性表达，在构建基因表达载体时，需加入乳腺中特异表达的基因的启动子，C正确；
D、不同DNA能相互拼接的基础是它们具有相同的化学组成（都是由脱氧核苷酸组成）和结构 （双螺旋结构），D正确。
5、用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D 用HindⅢ酶切后,目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而转录的方向是不变的,故目的基因转录的产物可能不同,A正确;用PvuⅠ酶切后,TetR未被破坏,无论该质粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培养基中存活,B正确;插入目的基因的重组质粒比空质粒大,故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同,故可以用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的质粒上的TetR被破坏,受体菌不能在含Tet的培养基上存活,D错误。
6、科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'到5'端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
7、种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
图1
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
图2
图3
答案 (1)野生型 (2)基因表达载体(或质粒,或载体) 启动子、终止子 (3)①T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因) ②75 ③自交100
(4)
解析 (1)野生型DA1基因为显性基因,若导入成功,转基因植株的种子大小应与野生型的一致。(2)用农杆菌转化法进行转基因需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,所以需将二者用同种限制酶切割再用DNA连接酶连接。如要目的基因正常表达,其上游要有启动子驱动转录开始,下游要有终止子终止转录。(3)①能在选择培养基上萌发并生长的阳性个体说明其基因组中成功插入含有DA1基因的T-DNA片段。②T0代植株自交后所得的T1代种子若能在选择培养基上存活,则为导入了DA1基因和卡那霉素抗性基因的阳性种子,但导入的数量未知,故用T1代植株继续自交,若某T1代植株为基因组单一位点插入,则其产生的T2代种子在选择培养基上的存活率(阳性率)为75%。③目标转基因植株应为纯合阳性子代,T2代植株中存在杂合阳性和纯合阳性子代,应该用自交的方法筛选,若后代不再出现性状分离,即阳性率为100%,说明培养基中的幼苗为目标转基因植株。(4)野生型基因和突变型基因长度均为150 bp,野生型基因内部无限制酶X的酶切位点,突变型基因在50 bp处有一个限制酶X的酶切位点,所以酶切后野生型出现1个150 bp的条带,而突变型出现100 bp和50 bp两个条带。
题型02 PCR和凝胶电泳
8、RT-PCR是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。目前国际均以RT-PCR检测呈阳性作为感染新型冠状病毒肺炎的“金标准”相关叙述错误的是（ ）
A．RT-PCR反应体系中需要添加逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
B．RT-PCR也需要经过高温变性、低温复性和中温延伸
C．RT-PCR模拟了新冠病毒在人体细胞内增殖的主要过程
D．标本保存与运输不当可能导致RT-PCR检测呈假阴性
【答案】C
【解析】
A、逆转录酶在RNA的逆转录过程中发挥作用，耐高温的DNA聚合酶在cDNA的聚合酶链式扩增中发挥作用，故该反应体系中需加入逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，A正确；
B、该技术包括cDNA的聚合酶链式扩增过程，故需要经过高温变性、低温复性和中温延伸，B正确；
C、新冠病毒属于自我复制型的RNA病毒，其在宿主细胞内不进行逆转录过程，C错误；
D、若在标本运输、保存中出现了损坏和污染，导致新冠病毒核酸破坏而无法检测，可能导致RT-PCR检测呈假阴性，D正确。
9、抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B 94 ℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72 ℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;72 ℃ ,1 min的后延伸过程可使目的基因的扩增更充分,B正确;由于Taq DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与,C错误;为防基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全后才可推广上市,D错误。
10、纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
图Ⅰ
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 ml/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcRⅤ位点插入片段)。请完成下表。
图Ⅱ
图Ⅲ
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
答案 (1)脂质和蛋白质 发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④蛋白X定位于纤毛基部 (4)逆转录 32
解析 (1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 ml/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚合酶提供3'-OH,使该酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:
用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正确连接,则上游连接处含有Hind Ⅲ+EcR Ⅴ的识别序列,即5'…AAGCTT…GATATC…3',即Q4,下游含有EcR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,即5'…GATATC…GGATCC…3',即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,x×215=y×220,PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220)÷(x×215)=25=32倍。
11、.核酸检测阳性是确诊新冠肺炎的重要标准，新冠病毒是RNA病毒，核酸检测是通过荧光定量PCR检测受测者体内是否有病毒的核酸。以下是核酸检测过程图：
由图可知，具体检测过程是：
(1)首先采集受测者的痰液、咽拭子、血液等样本，从中提取病毒的________，通过_______过程得到cDNA，再在体外利用________技术对cDNA进行扩增，该技术包括________三个步骤。
(2)PCR 技术扩增目的基因的前提是______________________。
(3)诱导动物细胞融合的过程中常用到灭活的病毒，灭活是指用物理或化学手段使病毒失去________， 但并不破坏病毒的________________结构。
(4)除核酸检测外，抗体检测也是筛查新冠肺炎患者的重要手段，其原理是：____________。如果检测结果为阳性，则表明：_________________（答出两种可能的原因）。
(5)有报道称，某荷兰学者获得了一种能特异中和新冠病毒的单克隆抗体，该抗体通过结合冠状病毒刺突蛋白，改变其结构，使得其无法结合宿主细胞，理论上具有防止多种冠状病毒感染的潜力，也可用于新冠病毒感染者的检测与治疗。单克隆抗体具有____________的优点，但目前科学家并没有大规模生产新冠病毒的单克隆抗体用于临床疗，请分析可能的原因是________________________________。
【答案】(1) RNA 逆（反）转录 PCR 变性、复性、延伸
(2)要有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这个序列合成引物
(3) 感染能力 抗原
(4) 抗原抗体特异性结合 被检测个体现在感染了新冠病毒或曾经感染过新冠病毒或注射过新冠疫苗
(5) 特异性强、灵敏度高，并可大量制备 新冠病毒的遗传物质为RNA，容易发生变异
【解析】
PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。2、原理：DNA复制。3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。5、过程：高温变性，DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；低温：复性，引物结合到互补链DNA上；中温延伸，合成子链；可根据抗原抗体特异性结合这一原理利用抗体检测筛查新冠病毒，为了获得灵敏度更高的抗体，可以采用单克隆抗体制备技术。
(1)PCR技术的原理是DNA双链复制，而新冠病毒的遗传物质是RNA，为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻痰液、咽拭子等样本，获取病毒RNA，通过逆转录将RNA逆转录成cDNA，然后再利用PCR技术进行DNA的扩增；PCR技术一般包括变性、复性（退火）、延伸三个步骤。
(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提条件是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(3)可以用灭活的病毒来诱导细胞融合，灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构，类似于疫苗的处理。
(4)病原体进入机体内，激发机体的特异性免疫，机体产生特异性抗体，因此可以根据抗原抗体特异性结合这一原理进行抗体检测；如果检测结果为阳性，则表明该人体内已经存在新冠病毒特异性抗体，可能被检测个体现在感染了新冠病毒或曾经感染过新冠病毒或注射过新冠疫苗。
(5)研究人员将冠状病毒刺突蛋白注入动物体内，一段时间后从脾脏中获取浆细胞，与骨髓瘤细胞融合，并利用选择培养基筛选出既能分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，接着经过多次筛选获得针对S蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体最主要优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备；因为新冠病毒的遗传物质为单链RNA，结构不稳定，容易发生变异，制备单克隆抗体难度较大。
12、金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过 获得 用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ,而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表 ,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但 的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有 (填序号:①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。
答案 (8分)(1)逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性 (4)引物与模板 GC含量高 (5)②③
解析 本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。
知识归纳 关于引物的几个问题:①引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为20~30个核苷酸。②由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。③结合DNA结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。
题型03 基因工程和蛋白质工程的综合应用
13、挽救终末期心脏病患者需要心脏移植，但移植过程中会发生缺血再灌注损伤（IRI），导致心脏坏死。研究发现，IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官坏死。Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤，如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．重组质粒除了包含目的基因、标记基因外，还必须有启动子和终止子
B．细胞凋亡中会发生Casepase8DNA→Casepase8RNA→Casepase8蛋白的过程
C．基因沉默复合物，抑制基因表达的翻译过程，使Caspase8基因沉默
D．为提高器官成活率，供者应与受者的主要HLA（组织相容性抗原）完全一致
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、重组质粒包含目的基因，标记基因，启动子和终止子，A正确；
B、凋亡基因Casepase8基因表达形成Casepase8蛋白质，导致细胞凋亡，B正确；
C、基因沉默复合物作用于Casepase8mRNA，影响基因表达的翻译过程，C正确；
D、研究表明，只要供者与受者的主要HLA有一半以上相同就可进器官移植，D错误。
14、腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D 根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
15、为利用链霉菌生产药物A，研究者构建重组DNA并导入链霉菌。重组DNA含启动子P、药物A基因和Ne基因（卡那霉素抗性基因）。培养和筛选过程如下图所示。
下列叙述不正确的是（ ）
A．导入成功的链霉菌细胞内可能发生基因重组
B．诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变
C．卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量
D．应选用培养基b上的菌株进一步鉴定以生产药物A
【答案】D
【分析】基因工程的原理是基因重组，基因工程的基本操作程序为：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、重组DNA含启动子P、药物A基因和Ne基因（卡那霉素抗性基因），导入受体细胞中，目的基因会插入到受体细胞的基因组中，发生的可遗传变异类型为基因重组，A正确；
B、诱变处理所依据的原理是基因突变，基因突变是不定向的，所以诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变，B正确；
C、药物A基因和Ne基因（卡那霉素抗性基因）共用一个启动子，二者共同表达，所以卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量，C正确；
D、诱变处理后将菌液稀释后涂布，在含不同浓度卡那霉素的培养基上各接种等量同一稀释度的培养液，应该选择含卡那霉素浓度最高的培养基（即d）上所长出的菌落，其生产药物A的能力也较强，D错误。
16、猪胰岛素用于人体时，降低血糖效果不明显，原因是猪胰岛素分子中有一个氨基酸与人的不同。为了使猪胰岛素能用于治疗人类的糖尿病，以下操作中最佳方案是（ ）
A．修饰和改造猪胰岛素中的氨基酸种类与序列
B．将猪胰岛素和人胰岛素进行拼接组成新的胰岛素
C．将猪和人的胰岛素混合在一起治疗人体糖尿病
D．根据人胰岛素氨基酸排列顺序设计制造一种全新的胰岛素
【答案】A
【解析】
由于猪胰岛素分子中只有一个氨基酸与人胰岛素不同，所以蛋白质工程中蛋白质的分子设计，只需替换这一个不同的氨基酸即可。就是修饰和改造猪胰岛素中的氨基酸种类与序列，虽然根据人胰岛素分子的结构设计一种全新的胰岛素也可以用于临床治疗，但分子设计和胰岛素的生产方面都存在很多困难，所以不是最佳方案。
17、已知新冠病毒的S抗原基因编码的S蛋白在感染人体细胞的过程中起到关键作用，S蛋白与人细胞膜上ACE2受体结合后，新冠病毒入侵人体细胞。我国陈薇院士团队成功开发了一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒基因疫苗，目前已获批上市。回答下列问题：
(1)制备腺病毒载体新冠疫苗时，首先需在_____的作用下，以新冠病毒的遗传物质RNA为模板经过逆转录得到S抗原基因后，利用PCR技术扩增S抗原基因的体系中需加入_____酶。
(2)腺病毒DNA上有_____，便于S抗原基因插入，S抗原基因整合进腺病毒基因组时，需将S抗原基因插在腺病毒载体的启动子和终止子之间，使S抗原基因能_____，从而激发人体产生抵抗新冠病毒的抗体和记忆细胞。
(3)研究人员还可将S蛋白注入动物体内，一段时间后从其脾脏中获取浆细胞，与骨髓瘤细胞融合，并利用选择培养基筛选出_____的杂交瘤细胞。接着经过多次筛选并在体外培养，获得针对S蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体最主要优点是_____。
(4)将新冠病毒灭活制成的灭活疫苗对预防新冠肺炎也有很好的效果，这种疫苗免疫程序是两针免疫，接种间隔为3-8周，间隔时间过长、过短都可能影响免疫预防的效果，原因可能是_____。
【答案】(1) 逆（或反）转录酶 热稳定DNA聚合（或Taq）
(2) 一个或多个限制酶的切割位点 表达出S蛋白
(3) 既能分泌抗体又能无限增殖 特异性强、灵敏度高、可大量制备
(4)间隔时间太短，前一次产生的抗体水平较高，会将后一次接种的疫苗中和，降低疫苗的作用效果：间隔时间太长，前一次的记忆细胞减少，使得后一次接种的疫苗产生的免疫加强效果下降
【解析】(1)已知新冠病毒的S抗原基因编码的S蛋白在感染人体细胞的过程中起到关键作用。制备腺病毒载体新冠病毒疫苗时，首先需要在逆转录酶的作用下，以新冠病毒的遗传物质RNA为模板经过逆转录得到S抗原基因。利用PCR技术扩增S抗原基因，体系中需加入热稳定DNA聚合酶。
(2)腺病毒DNA上有一个或多个限制酶的切割位点，便于S抗原基因插入，S抗原基因整合进腺病毒基因组时，需将S抗原基因插在腺病毒载体的启动子和终止子之间，启动子是RNA聚台酶结合位点，从而驱动转录的发生，终止子让转录终止，从而能正确表达出S蛋白使S抗原基因能表达出S蛋白，从而激发人体产生抵抗新冠病毒的抗体和记忆细胞。
(3)研究人员还可将S蛋白注入动物体内，一段时间后从脾脏中获取浆细胞，与骨髓瘤细胞融合，并利用选择培养基筛选出既能分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，接着经过多次筛选获得针对S蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体最主要优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备。
(4)将新冠病毒灭活制成的灭活疫苗对预防新冠肺炎也有很好的效果，这种疫苗免疫程序是两针免疫，接种间隔为3-8周，若间隔时间太短，前一次产生的抗体水平较高，会将后一次接种的疫苗中和，降低疫苗的作用效果；若间隔时间太长，前一次的记忆细胞减少，使得后一次接种的疫苗产生的免疫加强效果下降。
18、已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶的催化活性。回答下列问题:
(1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的 进行改造。
(2)以P基因序列为基础,获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中心法则的全部内容包括 的复制;以及遗传信息在不同分子之间的流动,即: 。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过 和 ,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列,据此获得基因,再经表达、纯化获得蛋白质,之后还需要对蛋白质的生物 进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构)(1分,其他合理答案也给分)
(2)P P1(每空2分,共4分) DNA和RNA(或遗传物质)(2分) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3分)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列(每空2分,共4分) 功能(1分)
解析 (1)蛋白质的功能与结构相关,若要改变蛋白质的功能,需要对其结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后,可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。中心法则的内容包括遗传信息的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
19、据报道，研究人员提取了重症联合免疫缺陷患儿的骨髓， 插入目的基因拷贝， 将修饰 的细胞重新输回患者体内。最终结果令人惊叹：经过治疗，16 名患儿中有 14 名免疫系统 得到了修复，还有很多基本治愈。这是基因治疗的典型成功案例。理论上， 基因治疗可以 治愈很多人类遗传疾病。但实际上， 科研人员实施安全有效的基因治疗却并非易事，他们 面临许多挑战， 首先要明确疾病的遗传基础， 其次要寻找合适的载体作用于机体的发病组 织，同时还要能避免意外的后果。经过科研人员的不懈努力和探索，基因治疗技术进步明显，终于顺利地获得了临床批准。根据以上材料， 回答以下问题：
(1)基因治疗属于_______（生物技术）的应用范畴，这种技术的生物学原理是________________________。
(2)对遗传病患者实施基因治疗，获得目的基因后，需构建包括_____________ （至少答三个）的基因表达载体。
(3)基因治疗常选用逆转录病毒作为目的基因载体， 但需敲除病毒的包装蛋白基因，原因 是____________________________________________。
(4)构建基因表达载体后， 可______________________ ；也可在体外将基因表达载体导入 受体细胞， 形成______________________ ，体外培养后再输回患者体内。
(5)从遗传物质变化和免疫调节角度看，基因治疗可能导致的意外后果分别是___________。
【答案】(1) 基因工程 基因重组
(2)目的基因、启动子、终止子、复制原点
(3)防止病毒合成包装蛋白进行繁殖
(4) 直接将其送入患者体内受体细胞 重组细胞
(5)细胞癌变（基因突变）、免疫排斥（并发症）
【解析】
(1)基因治疗属于基因工程的应用范畴，这种技术的生物学原理是基因重组。
(2)基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点。
(3)基因治疗过程中，获得目的基因后，需构建基因表达载体，以保证目的基因在受体细胞内顺利表达并发挥作用。以病毒作为基因的载体，需使目的基因高效转移并有效表达，而其不断繁殖的特性必须消除。敲除病毒的包装蛋白基因，就是不让病毒合成相应蛋白进行繁殖。
(4)基因表达载体构建后，可通过两种途径发挥作用：一是直接将表达载体导入患者体内的受体细胞，二是在体外将基因表达载体导入受体细胞，形成重组细胞，在体外进行细胞培养后输入患者体内。
(5)基因治疗可能导致的意外后果很可能包括，基因表达载体整合时引起相关基因突变或细胞癌变，重组细胞输入患者体内时有可能引发机体产生免疫排斥反应产生并发症。
种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
以农杆菌转化法为例：
将目的基因插入Ti质粒的TDNA上
↓
转入农杆菌中
↓
导入植物细胞
↓
整合到受体细胞的DNA上
提纯含目的基
因的表达载体
↓
显微注射
↓
受精卵发育
↓
具有新性
状的个体
Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
考点02 生物技术的安全性与伦理问题
★ 考向1 理性看待转基因技术
1、理性看待转基因技术
（1）需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
（2）应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
（3）要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
2、禁止生物武器
（1）种类：致病菌类、病毒类、生化毒剂类等
（2）我国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
★ 考向2 克隆技术的应用
1、生殖性克隆和治疗性克隆的比较
1（2023·浙江）以哺乳动物为研究对象的生物技术已取得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是（ ）
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
【答案】D
【解析】生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。两者有着本质的区别。
A.我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，但治疗性克隆可在有效监控和严格审查下实施，A错误；
B.我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查，B错误；
C.生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，C错误；
D.我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，D正确。
基因工程和蛋白质工程代表了生物科学技术的前沿，体现了生物科学的应用性和创新性，基因工程在应用过程中涉及的安全问题和伦理问题是社会关注的热点问题，探究科技前沿的同时，渗透生命观念和社会责任。
题型01 生物技术的安全性与伦理问题
1、社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是( )
A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒
D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的
答案 A 高温加热可能会破坏食物中的一些维生素,A有科学依据;转基因抗虫棉能产生Bt抗虫蛋白,杀死害虫,但对人畜无害,B没有科学依据;消毒液能杀死人体皮肤表面的微生物,但不能用来清除人体内的新冠病毒,可通过药物增强人体的免疫能力,通过细胞免疫等清除人体内的新冠病毒,C没有科学依据;孩子的血型和父母都不一样,也可能是亲生的,如父母的血型分别为A型(IAi)、B型(IBi),孩子是O型(ii),D没有科学依据。
2、生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述,错误的是( )
A.应严格选择转基因植物的目的基因,避免产生对人类有害的物质
B.当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验,但不反对治疗性克隆
C.反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D.生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
答案 D 在获得转基因植物时,要严格选择目的基因,避免产生对人类有害的毒性蛋白或过敏蛋白等物质,A正确;当今社会的普遍观点是禁止有关人类的生殖性克隆,但不反对治疗性克隆,B正确;反对设计试管婴儿的原因之一是有人将此技术用于设计婴儿性别,C正确;生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂及经过基因重组的致病菌等,干扰素不属于生物武器,D错误。
3、下列关于转基因生物安全性的叙述中,错误的是( )
A.我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B.国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C.开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D.目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
答案 B 本题考查了转基因生物安全性的有关知识。目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性两个方面;因对转基因生物的安全性还处于争论阶段,故不可能在转基因食品标签上警示性注明可能的危害;但我国已对转基因食品和农产品强制实施了产品标识制度,以维护消费者对转基因产品的知情权和选择权;开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提。
4、嵌合病毒是一种基因工程重组病毒，即利用一些已知特性的病毒株作为受体，以另一病毒株作为供体提供结构蛋白基因，替换掉受体株的相应位置的基因，从而构建出一种新型病毒。作为重组病毒，嵌合病毒在安全性上有一定的风险，其可能被制成生物武器。下列相关叙述错误的是（ ）
A．嵌合病毒的生物特性由受体病毒株和供体病毒株共同决定
B．由嵌合病毒制成的生物武器可能具有目前人类难以预防和治疗的特点
C．由嵌合病毒制成的生物武器可能使受害国居民感染而施放国的人不易感染
D．人体对嵌合病毒不能产生免疫反应，这导致嵌合病毒具有极大的危害性
【答案】D
【分析】生物武器种类：包括致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌等。把这些病原体直接或者通过食物、生活必需品等散布到敌方，可以对军队和平民造成大规模杀伤后果。
【详解】A、分析题意可知，嵌合病毒是利用一些已知特性的病毒株作为受体，以另一病毒株作为供体提供结构蛋白基因，替换掉受体株的相应位置的基因，从而构建出一种新型病毒，故嵌合病毒的生物特性由受体病毒株和供体病毒株共同决定，A正确；
B、由于嵌合病毒可能在改造过程中发生新的组合，故由嵌合病毒制成的生物武器可能具有目前人类难以预防和治疗的特点，B正确；
C、经过基因重组的生物武器，是经过定向改造之后产生的，因此可能使受害国居民感染而施放者不易感染，C正确；
D、病毒可作为抗原，进入机体后可以引发机体的免疫反应，D错误。
6、下列关于生物技术的应用理解不正确的是（ ）
A．“设计试管婴儿”属于生殖性克隆，故引发了关于伦理道德的讨论
B．利用基因工程培养工程菌，是因为微生物具有结构和遗传物质简单，生长繁殖快等优点
C．保护野生动物的目的就是要不只是要保留物种，更重要的是保留基因
D．制备单克隆抗体的过程中有细胞培养的过程，但是培养基成分与细胞培养可以有差异
【答案】AC
【分析】动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
【详解】A、“设计试管婴儿”不属于生殖性克隆，A错误；
B、微生物具有生理结构和遗传物质简单和遗传物质简单，生长繁殖快等优点，便于研究，B正确；
C、保护野生动物的目的既要保留物种又要保留基因，更重要的是保留物种，C错误；
D、制备单克隆抗体的过程中有细胞培养的过程，需要对细胞进行筛选，则不同时期的培养基成分与细胞培养有差异，D正确。考点要求
考题统计
考情分析
基因工程
2023湖北卷（2分）
2023广东卷（9分）
2023山东卷（7分）
2023 湖北（7分）
2022湖南卷（12分）
2022重庆卷（2分）
【命题规律】
基因工程是高考考査的热点、重点和难点。近几年考查的内容比例和难度均有所增加，各种题型均有，以非选择题为主，对能力要求较高，与最新理论和技术联系密切，题目信息量大，情境新颖，大多来自大学教材和最新科研论文，核心素养侧重对科学思维和科学探究的考查。
【命题预测】
此部分内容会以选择题和非选择题的形式出现在高考试题中，试题的情境专业性较强，涉及PCR技术、电泳技术和基因表达的调控机制，可结合生活、生产、临床实践，探究科技前沿，渗透生命观念和社会责任。
生物技术的安全性与伦理问题
2023浙江卷（2分）
2023北京卷（2分）
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M
①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确
③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
类型
生殖性克隆
治疗性克隆
目的
产生独立生存的新个体
治疗疾病
水平
个体水平
细胞水平
联系
都属于无性生殖；产生新个体或新组织，遗传信息相同
1、理性看待转基因技术
（1）需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
（2）应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
（3）要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
限制酶的选择技巧
（1）根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙)
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
例1、科学家从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，进行克隆，复制了2400年前的DNA。兴趣小组同学模拟了其中部分研究过程，设计了如下实验(MspⅠ、BamHⅠ、MbⅠ、SmaⅠ为4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG，如图所示)。请回答以下问题：
(1)从解旋过程进行分析，PCR扩增木乃伊基因与体内DNA复制过程不相同的地方是______________________________________________________________(答出两点)。
(2)若将图乙中质粒和图甲中木乃伊基因通过同种限制酶处理后，构建重组质粒，应选用的限制酶是________，选择理由是_______________________________________________________
(3)经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能正确表达，最可能的原因是___________________________________________________________
(4)据图丙分析，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A、B还应分别含有________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________菌落中的细菌。
答案：(1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋 (2)BamH Ⅰ 用BamH Ⅰ 来切割目的基因和质粒，切割后能保留完整的目的基因和标记基因(合理即可) (3)同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
(4)青霉素、四环素 4和6
解析 (1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋。(2)能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为G↓GATCC的BamHⅠ和识别序列为↓GATC的MbⅠ，若使用MbⅠ会同时破坏质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因，所以要用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的青霉素抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)因为目的基因和载体是用同种限制酶切割的，同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接，导致目的基因不能正确表达。(4)用限制酶BamHⅠ对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素的培养基上生存。所以图丙培养基A和培养基B还应分别含有青霉素、四环素。从检测筛选的结果分析，培养基A中含有菌落4和6，培养基B中不含菌落4和6，故含目的基因的是4和6菌落中的细菌。
例2、利用枯草芽孢杆菌的发酵可以生产亮氨酸脱氢酶。在启动子和亮氨酸脱氢酶基因之间插入信号肽（SPN）基因并将重组质粒导入枯草芽孢杆菌构建工程菌，可提高亮氨酸脱氢酶的生产水平。重组质粒的构建如图所示，KmR为卡那霉素抗性基因，ApR为氨苄青霉素抗性基因，图中各限制酶切割产生的黏性末端不同。下列叙述正确的是（ ）
A．重组质粒pMA5-SPN-leudh除图中标注外还应具有终止子、复制原点等结构
B．构建重组质粒用Nde I和BamHI两种酶有助于正确插入目的基因
C．图中KmR和ApR存在于质粒中的作用是便于重组DNA分子的筛选
D．图中各限制酶切开的是氢键和磷酸二酯键，切下的DNA片段拼接需依靠DNA连接酶
【答案】ABC
【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。
【详解】A、重组质粒pM5-SPN-leudh中除图中标注外，还应该具有终止子，复制原点等结构，A正确；
B、NdeI和BamHI两种酶切割形成的黏性末端不同，构建重组质粒用NdeI和BamHI两种酶切有助于目的基因正确插入，B正确；
C、KmR和A_pR为标记基因，图中KmR和A_pR存在于质粒中的作用是便于重组DNA分子的筛选，C正确；
D、限制酶和DNA连接酶的作用部位为磷酸二酯键，D错误。
例3、某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. cli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. cli DNA连接酶连接
【答案】C
【分析】DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.cliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；
B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；
D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
故选C。
PCR技术
（1）原理：DNA半保留复制
（2）反应场所：PCR扩增仪
（3）条件：Mg2+缓冲仪、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶
（4）过程：变性→复性→延伸
例1、DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。在PCR反应的早期10～15个循环中，扩增产物主要是双链DNA，当后期数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。
(1)若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物____________；PCR反应缓冲体系中一般要添加________以激活耐高温的DNA聚合酶。
(2)进行最初10～15个循环的目的是________________________________。如果体系中原模板DNA的数量为a，最初10次循环产物为双链，后15次循环产物为单链，则最终获得的单链探针数为________。因为DNA单链与双链的分子量不同，可通过________将单链探针DNA分离出来。
(3)为精确控制产物生成量，科学家尝试设计了较长的非限制性引物与较短的限制性引物，在进行一定的循环次数后，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合。高复性温度条件下限制性引物不能结合模板链的原因是_________________________________________。
答案：(1)Ⅳ Mg2＋ (2)增加模板DNA的量 15×210·a (琼脂糖凝胶)电泳 (3)引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏
解析 (1)由于A链是所需分子探针，需要大量扩增，因此所选数量较多的非限制性引物应与B链的3′端配对，即为引物Ⅳ。耐高温的DNA聚合酶需要Mg2＋作为其激活剂。(2)在早期循环中，两种引物数量足够，双链DNA分子数呈指数增长，可为后期只扩增单链提供更多的模板。10次早期扩增过程中，每个DNA分子可产生210个子代DNA，而后期只有非限制性引物参与扩增，每次循环一个DNA分子只能合成一条链，且只有B链能作为模板，A链数呈线性增加，15次循环后可得15×210条A链，现有a个模板DNA，故可得15×210·a条单链DNA。对分子量不同的DNA常用的分离方法为琼脂糖凝胶电泳。(3)在不考虑碱基种类差异的情况下，引物越短，其与模板结合时可形成的氢键数越少，越容易被高温破坏。
例2、下图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是（ ）
A．②链从 L 到 R 的方向为 3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B．PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C．以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环需消耗 8 个引物③
D．物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得该序列的双链产物
【答案】D
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）：过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶高温条件下氢键可自动解开）：低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误；
B、PCR 过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度是子链沿着引物的3’端延伸，B错误；
C、以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环产生的DNA分子数目为23=8，则需消耗 引物③的数目为（8×2-2）÷2=7，C错误；
D、物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D正确。
考点01 基因工程
★ 考向1 基因工程的理论基础
1、基因工程的理论基础
外源基因在受体细胞内表达
理论
基础
①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能的基本单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
重组DNA：
载体+目的基因
复
制
转录
RNA
翻译
蛋白质
基因拼接
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②DNA分子都遵循碱基互补配对原则。
③双链DNA分子的空间结构都是双螺旋结构。
基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
易错警示：辨析农杆菌转化法中的两次拼接与两次导入
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
DNA的粗提取与鉴定
原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2ml/L的NaCl溶液。
鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色
实验流程：研磨→过滤→离心→加冷酒精→鉴定
★ 考向2 PCR
1、PCR的原理与条件等
PCR反应过程
第一步：加热至90～95℃DNA解链；
第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
★ 考向3 蛋白质工程
1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2、基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
3、蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质（如下图）。
1、（2023·广东）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【解析】DNA粗提取和鉴定的原理：
1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14ml/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
A.裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；
B.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2ml/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；
C.DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；
D.将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
故选D。
2．（2023·湖北）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
【答案】D
【解析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。
A.若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。
B.若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
C.DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
D.SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
故选D。
3、（2023·山东）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2 a链
(3) J-V5融合蛋白 不是
【解析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
4．（2023·湖北）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
（1）与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
（4）构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
【答案】(1) 不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
（3）通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【解析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原－抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。
故选④。
5、（2023·全国）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
【答案】(1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
(2) 终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
（3）密码子具有简并性
（4）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【解析】有关密码子，考生可从以下几方面把握：
①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。
②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。
（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
（3）正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
基因工程和蛋白质工程代表了生物科学技术的前沿，体现了生物科学的应用性和创新性，因此在高考命题中基因工程是高频考点，也是必考点，试题情境专业性较强，常涉及PCR技术、电泳技术和基因表达的调控机制等，结合生活、生产、临床实践，探究科技前沿，渗透生命观念和社会责任。
题型01 基因工程的基本操作
1、伯格首先在体外进行了 DNA 改造的研究，成功地构建了第一个体外重组 DNA 分子。下列相关叙述正确的是（ ）
A．不同的DNA分子必须用同一种限制酶切割，才能产生相同的黏性末端
B．DNA连接酶、DNA聚合酶，RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键
C．当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是平末端
D．E·cliDNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端
【答案】B
【解析】
A、有些不同的限制酶切割后也可能会产生相同的黏性末端，A错误；
B、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键，B正确；
C、当限制酶在它识别的序列的中心轴两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，C错误；
D、E•cliDNA连接酶只能“缝合”黏性末端，不能“缝合”平末端，D错误。
2、限制酶、DNA连接酶等的发现为DNA分子的切割，连接及基因表达载体的构建创造了条件。下列关于重组DNA技术基本工具的叙述，正确的是（ ）
A．限制酶在原核细胞内的主要作用是切割修剪自身的DNA
B．噬菌体、动植物病毒均可作为载体将外源基因导入受体细胞
C．用作载体的质粒DNA分子上可以不含有限制酶切割位点
D．DNA 连接酶可连接DNA分子两条链中碱基对之间的氢键
【答案】B
【分析】1、基因工程又叫作重组DNA技术，是指按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，具有特异性，即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
【详解】A、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，其在原核细胞中的主要作用是切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的，A错误；
B、将外源基因导入受体细胞，常常需要将目的基因与运载体结合构建基因基因表达载体，常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒，B正确；
C、作为载体的质粒上有限制酶的切割位点，这是质粒作为运载体的条件之一， C错误；
D、DNA 连接酶是连接的磷酸二酯键，D错误；
3、CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列
C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。
【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。
4、将溶葡球菌酶基因转入奶牛基因组中获得转基因牛，在其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎，使感染率下降。下列叙述错误的是（ ）
A．上述操作至少需要三种分子工具：限制酶、DNA聚合酶、载体
B．可以通过PCR以及构建基因文库等方法来获取溶葡球菌酶基因
C．构建基因表达载体时，需加入乳腺中特异表达的基因的启动子
D．溶葡球菌酶基因与奶牛DNA都为双螺旋结构是二者拼接的基础
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建： 是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、上述操作采用了基因工程技术，该技术至少需要三种分子工具：限制酶、DNA连接酶、载体，A错误；
B、葡球菌酶基因为目的基因，获取目的基因的方法有PCR、构建基因文库等，B正确；
C、要使目的基因只在乳腺组织中特异性表达，在构建基因表达载体时，需加入乳腺中特异表达的基因的启动子，C正确；
D、不同DNA能相互拼接的基础是它们具有相同的化学组成（都是由脱氧核苷酸组成）和结构 （双螺旋结构），D正确。
5、用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D 用HindⅢ酶切后,目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而转录的方向是不变的,故目的基因转录的产物可能不同,A正确;用PvuⅠ酶切后,TetR未被破坏,无论该质粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培养基中存活,B正确;插入目的基因的重组质粒比空质粒大,故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同,故可以用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的质粒上的TetR被破坏,受体菌不能在含Tet的培养基上存活,D错误。
6、科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'到5'端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
7、种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
图1
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
图2
图3
答案 (1)野生型 (2)基因表达载体(或质粒,或载体) 启动子、终止子 (3)①T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因) ②75 ③自交100
(4)
解析 (1)野生型DA1基因为显性基因,若导入成功,转基因植株的种子大小应与野生型的一致。(2)用农杆菌转化法进行转基因需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,所以需将二者用同种限制酶切割再用DNA连接酶连接。如要目的基因正常表达,其上游要有启动子驱动转录开始,下游要有终止子终止转录。(3)①能在选择培养基上萌发并生长的阳性个体说明其基因组中成功插入含有DA1基因的T-DNA片段。②T0代植株自交后所得的T1代种子若能在选择培养基上存活,则为导入了DA1基因和卡那霉素抗性基因的阳性种子,但导入的数量未知,故用T1代植株继续自交,若某T1代植株为基因组单一位点插入,则其产生的T2代种子在选择培养基上的存活率(阳性率)为75%。③目标转基因植株应为纯合阳性子代,T2代植株中存在杂合阳性和纯合阳性子代,应该用自交的方法筛选,若后代不再出现性状分离,即阳性率为100%,说明培养基中的幼苗为目标转基因植株。(4)野生型基因和突变型基因长度均为150 bp,野生型基因内部无限制酶X的酶切位点,突变型基因在50 bp处有一个限制酶X的酶切位点,所以酶切后野生型出现1个150 bp的条带,而突变型出现100 bp和50 bp两个条带。
题型02 PCR和凝胶电泳
8、RT-PCR是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。目前国际均以RT-PCR检测呈阳性作为感染新型冠状病毒肺炎的“金标准”相关叙述错误的是（ ）
A．RT-PCR反应体系中需要添加逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
B．RT-PCR也需要经过高温变性、低温复性和中温延伸
C．RT-PCR模拟了新冠病毒在人体细胞内增殖的主要过程
D．标本保存与运输不当可能导致RT-PCR检测呈假阴性
【答案】C
【解析】
A、逆转录酶在RNA的逆转录过程中发挥作用，耐高温的DNA聚合酶在cDNA的聚合酶链式扩增中发挥作用，故该反应体系中需加入逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，A正确；
B、该技术包括cDNA的聚合酶链式扩增过程，故需要经过高温变性、低温复性和中温延伸，B正确；
C、新冠病毒属于自我复制型的RNA病毒，其在宿主细胞内不进行逆转录过程，C错误；
D、若在标本运输、保存中出现了损坏和污染，导致新冠病毒核酸破坏而无法检测，可能导致RT-PCR检测呈假阴性，D正确。
9、抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B 94 ℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72 ℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;72 ℃ ,1 min的后延伸过程可使目的基因的扩增更充分,B正确;由于Taq DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与,C错误;为防基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全后才可推广上市,D错误。
10、纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
图Ⅰ
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 ml/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcRⅤ位点插入片段)。请完成下表。
图Ⅱ
图Ⅲ
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
答案 (1)脂质和蛋白质 发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④蛋白X定位于纤毛基部 (4)逆转录 32
解析 (1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 ml/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚合酶提供3'-OH,使该酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:
用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正确连接,则上游连接处含有Hind Ⅲ+EcR Ⅴ的识别序列,即5'…AAGCTT…GATATC…3',即Q4,下游含有EcR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,即5'…GATATC…GGATCC…3',即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,x×215=y×220,PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220)÷(x×215)=25=32倍。
11、.核酸检测阳性是确诊新冠肺炎的重要标准，新冠病毒是RNA病毒，核酸检测是通过荧光定量PCR检测受测者体内是否有病毒的核酸。以下是核酸检测过程图：
由图可知，具体检测过程是：
(1)首先采集受测者的痰液、咽拭子、血液等样本，从中提取病毒的________，通过_______过程得到cDNA，再在体外利用________技术对cDNA进行扩增，该技术包括________三个步骤。
(2)PCR 技术扩增目的基因的前提是______________________。
(3)诱导动物细胞融合的过程中常用到灭活的病毒，灭活是指用物理或化学手段使病毒失去________， 但并不破坏病毒的________________结构。
(4)除核酸检测外，抗体检测也是筛查新冠肺炎患者的重要手段，其原理是：____________。如果检测结果为阳性，则表明：_________________（答出两种可能的原因）。
(5)有报道称，某荷兰学者获得了一种能特异中和新冠病毒的单克隆抗体，该抗体通过结合冠状病毒刺突蛋白，改变其结构，使得其无法结合宿主细胞，理论上具有防止多种冠状病毒感染的潜力，也可用于新冠病毒感染者的检测与治疗。单克隆抗体具有____________的优点，但目前科学家并没有大规模生产新冠病毒的单克隆抗体用于临床疗，请分析可能的原因是________________________________。
【答案】(1) RNA 逆（反）转录 PCR 变性、复性、延伸
(2)要有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这个序列合成引物
(3) 感染能力 抗原
(4) 抗原抗体特异性结合 被检测个体现在感染了新冠病毒或曾经感染过新冠病毒或注射过新冠疫苗
(5) 特异性强、灵敏度高，并可大量制备 新冠病毒的遗传物质为RNA，容易发生变异
【解析】
PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。2、原理：DNA复制。3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。5、过程：高温变性，DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；低温：复性，引物结合到互补链DNA上；中温延伸，合成子链；可根据抗原抗体特异性结合这一原理利用抗体检测筛查新冠病毒，为了获得灵敏度更高的抗体，可以采用单克隆抗体制备技术。
(1)PCR技术的原理是DNA双链复制，而新冠病毒的遗传物质是RNA，为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻痰液、咽拭子等样本，获取病毒RNA，通过逆转录将RNA逆转录成cDNA，然后再利用PCR技术进行DNA的扩增；PCR技术一般包括变性、复性（退火）、延伸三个步骤。
(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提条件是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(3)可以用灭活的病毒来诱导细胞融合，灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构，类似于疫苗的处理。
(4)病原体进入机体内，激发机体的特异性免疫，机体产生特异性抗体，因此可以根据抗原抗体特异性结合这一原理进行抗体检测；如果检测结果为阳性，则表明该人体内已经存在新冠病毒特异性抗体，可能被检测个体现在感染了新冠病毒或曾经感染过新冠病毒或注射过新冠疫苗。
(5)研究人员将冠状病毒刺突蛋白注入动物体内，一段时间后从脾脏中获取浆细胞，与骨髓瘤细胞融合，并利用选择培养基筛选出既能分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，接着经过多次筛选获得针对S蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体最主要优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备；因为新冠病毒的遗传物质为单链RNA，结构不稳定，容易发生变异，制备单克隆抗体难度较大。
12、金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过 获得 用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ,而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表 ,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但 的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有 (填序号:①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。
答案 (8分)(1)逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性 (4)引物与模板 GC含量高 (5)②③
解析 本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。
知识归纳 关于引物的几个问题:①引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为20~30个核苷酸。②由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。③结合DNA结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。
题型03 基因工程和蛋白质工程的综合应用
13、挽救终末期心脏病患者需要心脏移植，但移植过程中会发生缺血再灌注损伤（IRI），导致心脏坏死。研究发现，IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官坏死。Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤，如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．重组质粒除了包含目的基因、标记基因外，还必须有启动子和终止子
B．细胞凋亡中会发生Casepase8DNA→Casepase8RNA→Casepase8蛋白的过程
C．基因沉默复合物，抑制基因表达的翻译过程，使Caspase8基因沉默
D．为提高器官成活率，供者应与受者的主要HLA（组织相容性抗原）完全一致
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、重组质粒包含目的基因，标记基因，启动子和终止子，A正确；
B、凋亡基因Casepase8基因表达形成Casepase8蛋白质，导致细胞凋亡，B正确；
C、基因沉默复合物作用于Casepase8mRNA，影响基因表达的翻译过程，C正确；
D、研究表明，只要供者与受者的主要HLA有一半以上相同就可进器官移植，D错误。
14、腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D 根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
15、为利用链霉菌生产药物A，研究者构建重组DNA并导入链霉菌。重组DNA含启动子P、药物A基因和Ne基因（卡那霉素抗性基因）。培养和筛选过程如下图所示。
下列叙述不正确的是（ ）
A．导入成功的链霉菌细胞内可能发生基因重组
B．诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变
C．卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量
D．应选用培养基b上的菌株进一步鉴定以生产药物A
【答案】D
【分析】基因工程的原理是基因重组，基因工程的基本操作程序为：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、重组DNA含启动子P、药物A基因和Ne基因（卡那霉素抗性基因），导入受体细胞中，目的基因会插入到受体细胞的基因组中，发生的可遗传变异类型为基因重组，A正确；
B、诱变处理所依据的原理是基因突变，基因突变是不定向的，所以诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变，B正确；
C、药物A基因和Ne基因（卡那霉素抗性基因）共用一个启动子，二者共同表达，所以卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量，C正确；
D、诱变处理后将菌液稀释后涂布，在含不同浓度卡那霉素的培养基上各接种等量同一稀释度的培养液，应该选择含卡那霉素浓度最高的培养基（即d）上所长出的菌落，其生产药物A的能力也较强，D错误。
16、猪胰岛素用于人体时，降低血糖效果不明显，原因是猪胰岛素分子中有一个氨基酸与人的不同。为了使猪胰岛素能用于治疗人类的糖尿病，以下操作中最佳方案是（ ）
A．修饰和改造猪胰岛素中的氨基酸种类与序列
B．将猪胰岛素和人胰岛素进行拼接组成新的胰岛素
C．将猪和人的胰岛素混合在一起治疗人体糖尿病
D．根据人胰岛素氨基酸排列顺序设计制造一种全新的胰岛素
【答案】A
【解析】
由于猪胰岛素分子中只有一个氨基酸与人胰岛素不同，所以蛋白质工程中蛋白质的分子设计，只需替换这一个不同的氨基酸即可。就是修饰和改造猪胰岛素中的氨基酸种类与序列，虽然根据人胰岛素分子的结构设计一种全新的胰岛素也可以用于临床治疗，但分子设计和胰岛素的生产方面都存在很多困难，所以不是最佳方案。
17、已知新冠病毒的S抗原基因编码的S蛋白在感染人体细胞的过程中起到关键作用，S蛋白与人细胞膜上ACE2受体结合后，新冠病毒入侵人体细胞。我国陈薇院士团队成功开发了一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒基因疫苗，目前已获批上市。回答下列问题：
(1)制备腺病毒载体新冠疫苗时，首先需在_____的作用下，以新冠病毒的遗传物质RNA为模板经过逆转录得到S抗原基因后，利用PCR技术扩增S抗原基因的体系中需加入_____酶。
(2)腺病毒DNA上有_____，便于S抗原基因插入，S抗原基因整合进腺病毒基因组时，需将S抗原基因插在腺病毒载体的启动子和终止子之间，使S抗原基因能_____，从而激发人体产生抵抗新冠病毒的抗体和记忆细胞。
(3)研究人员还可将S蛋白注入动物体内，一段时间后从其脾脏中获取浆细胞，与骨髓瘤细胞融合，并利用选择培养基筛选出_____的杂交瘤细胞。接着经过多次筛选并在体外培养，获得针对S蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体最主要优点是_____。
(4)将新冠病毒灭活制成的灭活疫苗对预防新冠肺炎也有很好的效果，这种疫苗免疫程序是两针免疫，接种间隔为3-8周，间隔时间过长、过短都可能影响免疫预防的效果，原因可能是_____。
【答案】(1) 逆（或反）转录酶 热稳定DNA聚合（或Taq）
(2) 一个或多个限制酶的切割位点 表达出S蛋白
(3) 既能分泌抗体又能无限增殖 特异性强、灵敏度高、可大量制备
(4)间隔时间太短，前一次产生的抗体水平较高，会将后一次接种的疫苗中和，降低疫苗的作用效果：间隔时间太长，前一次的记忆细胞减少，使得后一次接种的疫苗产生的免疫加强效果下降
【解析】(1)已知新冠病毒的S抗原基因编码的S蛋白在感染人体细胞的过程中起到关键作用。制备腺病毒载体新冠病毒疫苗时，首先需要在逆转录酶的作用下，以新冠病毒的遗传物质RNA为模板经过逆转录得到S抗原基因。利用PCR技术扩增S抗原基因，体系中需加入热稳定DNA聚合酶。
(2)腺病毒DNA上有一个或多个限制酶的切割位点，便于S抗原基因插入，S抗原基因整合进腺病毒基因组时，需将S抗原基因插在腺病毒载体的启动子和终止子之间，启动子是RNA聚台酶结合位点，从而驱动转录的发生，终止子让转录终止，从而能正确表达出S蛋白使S抗原基因能表达出S蛋白，从而激发人体产生抵抗新冠病毒的抗体和记忆细胞。
(3)研究人员还可将S蛋白注入动物体内，一段时间后从脾脏中获取浆细胞，与骨髓瘤细胞融合，并利用选择培养基筛选出既能分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，接着经过多次筛选获得针对S蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体最主要优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备。
(4)将新冠病毒灭活制成的灭活疫苗对预防新冠肺炎也有很好的效果，这种疫苗免疫程序是两针免疫，接种间隔为3-8周，若间隔时间太短，前一次产生的抗体水平较高，会将后一次接种的疫苗中和，降低疫苗的作用效果；若间隔时间太长，前一次的记忆细胞减少，使得后一次接种的疫苗产生的免疫加强效果下降。
18、已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶的催化活性。回答下列问题:
(1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的 进行改造。
(2)以P基因序列为基础,获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中心法则的全部内容包括 的复制;以及遗传信息在不同分子之间的流动,即: 。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过 和 ,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列,据此获得基因,再经表达、纯化获得蛋白质,之后还需要对蛋白质的生物 进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构)(1分,其他合理答案也给分)
(2)P P1(每空2分,共4分) DNA和RNA(或遗传物质)(2分) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3分)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列(每空2分,共4分) 功能(1分)
解析 (1)蛋白质的功能与结构相关,若要改变蛋白质的功能,需要对其结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后,可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。中心法则的内容包括遗传信息的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
19、据报道，研究人员提取了重症联合免疫缺陷患儿的骨髓， 插入目的基因拷贝， 将修饰 的细胞重新输回患者体内。最终结果令人惊叹：经过治疗，16 名患儿中有 14 名免疫系统 得到了修复，还有很多基本治愈。这是基因治疗的典型成功案例。理论上， 基因治疗可以 治愈很多人类遗传疾病。但实际上， 科研人员实施安全有效的基因治疗却并非易事，他们 面临许多挑战， 首先要明确疾病的遗传基础， 其次要寻找合适的载体作用于机体的发病组 织，同时还要能避免意外的后果。经过科研人员的不懈努力和探索，基因治疗技术进步明显，终于顺利地获得了临床批准。根据以上材料， 回答以下问题：
(1)基因治疗属于_______（生物技术）的应用范畴，这种技术的生物学原理是________________________。
(2)对遗传病患者实施基因治疗，获得目的基因后，需构建包括_____________ （至少答三个）的基因表达载体。
(3)基因治疗常选用逆转录病毒作为目的基因载体， 但需敲除病毒的包装蛋白基因，原因 是____________________________________________。
(4)构建基因表达载体后， 可______________________ ；也可在体外将基因表达载体导入 受体细胞， 形成______________________ ，体外培养后再输回患者体内。
(5)从遗传物质变化和免疫调节角度看，基因治疗可能导致的意外后果分别是___________。
【答案】(1) 基因工程 基因重组
(2)目的基因、启动子、终止子、复制原点
(3)防止病毒合成包装蛋白进行繁殖
(4) 直接将其送入患者体内受体细胞 重组细胞
(5)细胞癌变（基因突变）、免疫排斥（并发症）
【解析】
(1)基因治疗属于基因工程的应用范畴，这种技术的生物学原理是基因重组。
(2)基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点。
(3)基因治疗过程中，获得目的基因后，需构建基因表达载体，以保证目的基因在受体细胞内顺利表达并发挥作用。以病毒作为基因的载体，需使目的基因高效转移并有效表达，而其不断繁殖的特性必须消除。敲除病毒的包装蛋白基因，就是不让病毒合成相应蛋白进行繁殖。
(4)基因表达载体构建后，可通过两种途径发挥作用：一是直接将表达载体导入患者体内的受体细胞，二是在体外将基因表达载体导入受体细胞，形成重组细胞，在体外进行细胞培养后输入患者体内。
(5)基因治疗可能导致的意外后果很可能包括，基因表达载体整合时引起相关基因突变或细胞癌变，重组细胞输入患者体内时有可能引发机体产生免疫排斥反应产生并发症。
种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
以农杆菌转化法为例：
将目的基因插入Ti质粒的TDNA上
↓
转入农杆菌中
↓
导入植物细胞
↓
整合到受体细胞的DNA上
提纯含目的基
因的表达载体
↓
显微注射
↓
受精卵发育
↓
具有新性
状的个体
Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
考点02 生物技术的安全性与伦理问题
★ 考向1 理性看待转基因技术
1、理性看待转基因技术
（1）需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
（2）应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
（3）要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
2、禁止生物武器
（1）种类：致病菌类、病毒类、生化毒剂类等
（2）我国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
★ 考向2 克隆技术的应用
1、生殖性克隆和治疗性克隆的比较
1（2023·浙江）以哺乳动物为研究对象的生物技术已取得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是（ ）
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
【答案】D
【解析】生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。两者有着本质的区别。
A.我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，但治疗性克隆可在有效监控和严格审查下实施，A错误；
B.我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查，B错误；
C.生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，C错误；
D.我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，D正确。
基因工程和蛋白质工程代表了生物科学技术的前沿，体现了生物科学的应用性和创新性，基因工程在应用过程中涉及的安全问题和伦理问题是社会关注的热点问题，探究科技前沿的同时，渗透生命观念和社会责任。
题型01 生物技术的安全性与伦理问题
1、社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是( )
A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒
D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的
答案 A 高温加热可能会破坏食物中的一些维生素,A有科学依据;转基因抗虫棉能产生Bt抗虫蛋白,杀死害虫,但对人畜无害,B没有科学依据;消毒液能杀死人体皮肤表面的微生物,但不能用来清除人体内的新冠病毒,可通过药物增强人体的免疫能力,通过细胞免疫等清除人体内的新冠病毒,C没有科学依据;孩子的血型和父母都不一样,也可能是亲生的,如父母的血型分别为A型(IAi)、B型(IBi),孩子是O型(ii),D没有科学依据。
2、生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述,错误的是( )
A.应严格选择转基因植物的目的基因,避免产生对人类有害的物质
B.当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验,但不反对治疗性克隆
C.反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D.生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
答案 D 在获得转基因植物时,要严格选择目的基因,避免产生对人类有害的毒性蛋白或过敏蛋白等物质,A正确;当今社会的普遍观点是禁止有关人类的生殖性克隆,但不反对治疗性克隆,B正确;反对设计试管婴儿的原因之一是有人将此技术用于设计婴儿性别,C正确;生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂及经过基因重组的致病菌等,干扰素不属于生物武器,D错误。
3、下列关于转基因生物安全性的叙述中,错误的是( )
A.我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B.国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C.开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D.目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
答案 B 本题考查了转基因生物安全性的有关知识。目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性两个方面;因对转基因生物的安全性还处于争论阶段,故不可能在转基因食品标签上警示性注明可能的危害;但我国已对转基因食品和农产品强制实施了产品标识制度,以维护消费者对转基因产品的知情权和选择权;开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提。
4、嵌合病毒是一种基因工程重组病毒，即利用一些已知特性的病毒株作为受体，以另一病毒株作为供体提供结构蛋白基因，替换掉受体株的相应位置的基因，从而构建出一种新型病毒。作为重组病毒，嵌合病毒在安全性上有一定的风险，其可能被制成生物武器。下列相关叙述错误的是（ ）
A．嵌合病毒的生物特性由受体病毒株和供体病毒株共同决定
B．由嵌合病毒制成的生物武器可能具有目前人类难以预防和治疗的特点
C．由嵌合病毒制成的生物武器可能使受害国居民感染而施放国的人不易感染
D．人体对嵌合病毒不能产生免疫反应，这导致嵌合病毒具有极大的危害性
【答案】D
【分析】生物武器种类：包括致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌等。把这些病原体直接或者通过食物、生活必需品等散布到敌方，可以对军队和平民造成大规模杀伤后果。
【详解】A、分析题意可知，嵌合病毒是利用一些已知特性的病毒株作为受体，以另一病毒株作为供体提供结构蛋白基因，替换掉受体株的相应位置的基因，从而构建出一种新型病毒，故嵌合病毒的生物特性由受体病毒株和供体病毒株共同决定，A正确；
B、由于嵌合病毒可能在改造过程中发生新的组合，故由嵌合病毒制成的生物武器可能具有目前人类难以预防和治疗的特点，B正确；
C、经过基因重组的生物武器，是经过定向改造之后产生的，因此可能使受害国居民感染而施放者不易感染，C正确；
D、病毒可作为抗原，进入机体后可以引发机体的免疫反应，D错误。
6、下列关于生物技术的应用理解不正确的是（ ）
A．“设计试管婴儿”属于生殖性克隆，故引发了关于伦理道德的讨论
B．利用基因工程培养工程菌，是因为微生物具有结构和遗传物质简单，生长繁殖快等优点
C．保护野生动物的目的就是要不只是要保留物种，更重要的是保留基因
D．制备单克隆抗体的过程中有细胞培养的过程，但是培养基成分与细胞培养可以有差异
【答案】AC
【分析】动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
【详解】A、“设计试管婴儿”不属于生殖性克隆，A错误；
B、微生物具有生理结构和遗传物质简单和遗传物质简单，生长繁殖快等优点，便于研究，B正确；
C、保护野生动物的目的既要保留物种又要保留基因，更重要的是保留物种，C错误；
D、制备单克隆抗体的过程中有细胞培养的过程，需要对细胞进行筛选，则不同时期的培养基成分与细胞培养有差异，D正确。考点要求
考题统计
考情分析
基因工程
2023湖北卷（2分）
2023广东卷（9分）
2023山东卷（7分）
2023 湖北（7分）
2022湖南卷（12分）
2022重庆卷（2分）
【命题规律】
基因工程是高考考査的热点、重点和难点。近几年考查的内容比例和难度均有所增加，各种题型均有，以非选择题为主，对能力要求较高，与最新理论和技术联系密切，题目信息量大，情境新颖，大多来自大学教材和最新科研论文，核心素养侧重对科学思维和科学探究的考查。
【命题预测】
此部分内容会以选择题和非选择题的形式出现在高考试题中，试题的情境专业性较强，涉及PCR技术、电泳技术和基因表达的调控机制，可结合生活、生产、临床实践，探究科技前沿，渗透生命观念和社会责任。
生物技术的安全性与伦理问题
2023浙江卷（2分）
2023北京卷（2分）
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M
①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确
③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
类型
生殖性克隆
治疗性克隆
目的
产生独立生存的新个体
治疗疾病
水平
个体水平
细胞水平
联系
都属于无性生殖；产生新个体或新组织，遗传信息相同
1、理性看待转基因技术
（1）需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
（2）应该看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
（3）要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
限制酶的选择技巧
（1）根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙)
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
例1、科学家从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，进行克隆，复制了2400年前的DNA。兴趣小组同学模拟了其中部分研究过程，设计了如下实验(MspⅠ、BamHⅠ、MbⅠ、SmaⅠ为4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG，如图所示)。请回答以下问题：
(1)从解旋过程进行分析，PCR扩增木乃伊基因与体内DNA复制过程不相同的地方是______________________________________________________________(答出两点)。
(2)若将图乙中质粒和图甲中木乃伊基因通过同种限制酶处理后，构建重组质粒，应选用的限制酶是________，选择理由是_______________________________________________________
(3)经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能正确表达，最可能的原因是___________________________________________________________
(4)据图丙分析，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A、B还应分别含有________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________菌落中的细菌。
答案：(1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋 (2)BamH Ⅰ 用BamH Ⅰ 来切割目的基因和质粒，切割后能保留完整的目的基因和标记基因(合理即可) (3)同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
(4)青霉素、四环素 4和6
解析 (1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋。(2)能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为G↓GATCC的BamHⅠ和识别序列为↓GATC的MbⅠ，若使用MbⅠ会同时破坏质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因，所以要用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的青霉素抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)因为目的基因和载体是用同种限制酶切割的，同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接，导致目的基因不能正确表达。(4)用限制酶BamHⅠ对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素的培养基上生存。所以图丙培养基A和培养基B还应分别含有青霉素、四环素。从检测筛选的结果分析，培养基A中含有菌落4和6，培养基B中不含菌落4和6，故含目的基因的是4和6菌落中的细菌。
例2、利用枯草芽孢杆菌的发酵可以生产亮氨酸脱氢酶。在启动子和亮氨酸脱氢酶基因之间插入信号肽（SPN）基因并将重组质粒导入枯草芽孢杆菌构建工程菌，可提高亮氨酸脱氢酶的生产水平。重组质粒的构建如图所示，KmR为卡那霉素抗性基因，ApR为氨苄青霉素抗性基因，图中各限制酶切割产生的黏性末端不同。下列叙述正确的是（ ）
A．重组质粒pMA5-SPN-leudh除图中标注外还应具有终止子、复制原点等结构
B．构建重组质粒用Nde I和BamHI两种酶有助于正确插入目的基因
C．图中KmR和ApR存在于质粒中的作用是便于重组DNA分子的筛选
D．图中各限制酶切开的是氢键和磷酸二酯键，切下的DNA片段拼接需依靠DNA连接酶
【答案】ABC
【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。
【详解】A、重组质粒pM5-SPN-leudh中除图中标注外，还应该具有终止子，复制原点等结构，A正确；
B、NdeI和BamHI两种酶切割形成的黏性末端不同，构建重组质粒用NdeI和BamHI两种酶切有助于目的基因正确插入，B正确；
C、KmR和A_pR为标记基因，图中KmR和A_pR存在于质粒中的作用是便于重组DNA分子的筛选，C正确；
D、限制酶和DNA连接酶的作用部位为磷酸二酯键，D错误。
例3、某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. cli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. cli DNA连接酶连接
【答案】C
【分析】DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.cliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；
B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；
D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
故选C。
PCR技术
（1）原理：DNA半保留复制
（2）反应场所：PCR扩增仪
（3）条件：Mg2+缓冲仪、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶
（4）过程：变性→复性→延伸
例1、DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。在PCR反应的早期10～15个循环中，扩增产物主要是双链DNA，当后期数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。
(1)若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物____________；PCR反应缓冲体系中一般要添加________以激活耐高温的DNA聚合酶。
(2)进行最初10～15个循环的目的是________________________________。如果体系中原模板DNA的数量为a，最初10次循环产物为双链，后15次循环产物为单链，则最终获得的单链探针数为________。因为DNA单链与双链的分子量不同，可通过________将单链探针DNA分离出来。
(3)为精确控制产物生成量，科学家尝试设计了较长的非限制性引物与较短的限制性引物，在进行一定的循环次数后，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合。高复性温度条件下限制性引物不能结合模板链的原因是_________________________________________。
答案：(1)Ⅳ Mg2＋ (2)增加模板DNA的量 15×210·a (琼脂糖凝胶)电泳 (3)引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏
解析 (1)由于A链是所需分子探针，需要大量扩增，因此所选数量较多的非限制性引物应与B链的3′端配对，即为引物Ⅳ。耐高温的DNA聚合酶需要Mg2＋作为其激活剂。(2)在早期循环中，两种引物数量足够，双链DNA分子数呈指数增长，可为后期只扩增单链提供更多的模板。10次早期扩增过程中，每个DNA分子可产生210个子代DNA，而后期只有非限制性引物参与扩增，每次循环一个DNA分子只能合成一条链，且只有B链能作为模板，A链数呈线性增加，15次循环后可得15×210条A链，现有a个模板DNA，故可得15×210·a条单链DNA。对分子量不同的DNA常用的分离方法为琼脂糖凝胶电泳。(3)在不考虑碱基种类差异的情况下，引物越短，其与模板结合时可形成的氢键数越少，越容易被高温破坏。
例2、下图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是（ ）
A．②链从 L 到 R 的方向为 3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B．PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C．以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环需消耗 8 个引物③
D．物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得该序列的双链产物
【答案】D
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）：过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶高温条件下氢键可自动解开）：低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误；
B、PCR 过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度是子链沿着引物的3’端延伸，B错误；
C、以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环产生的DNA分子数目为23=8，则需消耗 引物③的数目为（8×2-2）÷2=7，C错误；
D、物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D正确。
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