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新高考生物一轮复习考点课件第53讲 微生物的培养技术及应用（含解析）
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这是一份新高考生物一轮复习考点课件第53讲 微生物的培养技术及应用（含解析），共60页。PPT课件主要包含了微生物的基本培养技术，微生物概述，接种环的灼烧灭菌等内容，欢迎下载使用。
第53讲微生物的培养技术及应用
1.获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。2.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的基础。3.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品和无菌区域不被微生物污染的技术。4.举例说明通过调整培养基的配方可有目的的培养某种微生物。5.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。6.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点一 微生物的基本培养技术
考点二 微生物的选择培养和计数
主要考点 必备知识
1.微生物的定义：肉眼难以看清，需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的总称。
3.微生物菌落 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
由单个微生物繁殖形成的纯培养物就是一个单菌落； 一个单菌落就是一个种群
在实验室培养微生物的要求？
提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
确保其它微生物无法混入
（1）培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
基本成分：碳源、氮源、水、无机盐
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：牛肉膏、蛋白胨等
无机氮源：NH4＋、NO3-
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素等
(2)培养基的作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
乳酸杆菌:需要在培养基中添加维生素
霉菌：需将培养基pH调至酸性
细菌：需将培养基pH调至中性或弱碱性
厌氧生物：提供无氧条件
特殊需求：在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求，培养基的成分举例如下：
（1）培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
补充说明（1）含有C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源；（2）自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源；（3）自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源，因此可以根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型；（4）无机氮源不但能给自养型微生物提供氮源，也能作为能源物质，如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）（5）无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）
培养基的配制原则(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用K2HPO4－KH2PO4。
液体培养基：扩大培养、工业生产
固体培养基：纯化（分离）、鉴定、活菌计数、保藏菌种
有无 凝固剂琼脂
实验室常用的固体培养基是琼脂固体培养基
琼脂（agar）是一种从红藻中提取的多糖。琼脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。
天然培养基：利用天然的动、植物或微生物包括其提取物制成的培养基。其营养成分复杂而丰富，难以确切了解培养基的化学成分。合成培养基：根据微生物的营养需求，将各种纯化学物质按一定比例配制而成的培养基。半合成培养基：由一部分纯化学物质、一部分天然物质配制而成的培养基。（举例：牛肉膏蛋白胨培养基）
注意：人工合成的培养基，培养基成分明确（第2个）；含化学成分不 明确的天然物质（其他2个）
拓展：培养基的类型之其他划分方式
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化。
①加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌
②不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌
①加入伊红美蓝的培养基：鉴别大肠杆菌
②加入刚果红的培养基：鉴别纤维素分解菌
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。
关键：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
常用方法：主要包括消毒和灭菌。
目的：获得纯净的微生物培养物
(1)消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。 可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：62-65℃煮30min或 80℃-90℃下处理30s-1min。 可杀死绝大多数微生物，不破坏食物的营养成分。
③化学药物消毒法：用75%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等④紫外线消毒法：对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。
概念：用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。
芽孢：某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体
孢子：某些生物的繁殖体
芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射
①做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。②为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
注意：选择无菌技术的原则：一要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；二要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
100 ℃煮沸5～6 min
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线照射30 min
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
配制培养基→灭菌→接种→分离→培养
采用划线或涂布的接种方法实现目标微生物的分离与纯化
①分散的微生物在适宜的固体培养培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见菌落。
②采用平板划线法或稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上。之后经培养得到的的单菌落一般是由单个为微生物繁殖形成的纯培养物。
通过接种环在固体培养基（平板）表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到由单个微生物繁殖而形成的单菌落。
(1)酵母菌纯培养的操作步骤
制备培养基(配制培养基、灭菌、倒平板)↓接种和分离酵母菌↓培养酵母菌(将接种后的平板和一个未接种的平板倒置、培养)
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
加葡萄糖/蔗糖(20g)
加水定容(1000mL)
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15～30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
放入高压蒸汽灭菌锅中(100kPa、121℃)
②将瓶口迅速通过火焰。
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 ~ 20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置。
防止瓶口的微生物污染培养基
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养了一段时间，这样做的目的是？
检测培养基平板灭菌是否合格
注意：平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞
3、将试管口通过火焰
.4、将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
5、将试管通过火焰，并塞上棉塞
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
8、将平板倒置放入培养箱中培养。
（1）接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次。（2）划线首尾不能相接。（3）每次划线前接种环进行灭菌。（4）划线后,培养皿倒置培养。（5）不能划破培养基，一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
思考1 为什么要将平板倒置（背诵）？
思考2 为什么要同时放入未接种的平板？
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染。
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24-48 h。
制备培养基(配制培养基、灭菌、倒平板)↓接种和分离酵母菌↓培养酵母菌(将接种后的平板和一个 的平板倒置、培养)
考向 培养基与无菌技术
1.消毒和灭菌是两个不同的概念，灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力。消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害。下列哪些事物适用于消毒处理( )①皮肤 ②饮用水 ③牛奶 ④注射器⑤培养皿 ⑥接种环 ⑦培养基 ⑧果汁⑨酱油 ⑩手术刀A．①②③⑧⑨ B．④⑤⑥⑦C．①②③④⑤⑥ D．以上全部
解析：消毒指用比较温和的方法杀死微生物的营养细胞，适用于那些不耐高温的液体，如③牛奶、⑧果汁、⑨酱油，这样可以使其中的营养成分不被破坏；对要求不是很严格的①皮肤、②饮用水也用消毒的方法处理；而对于严格要求的④注射器、⑤培养皿、⑥接种环、⑦培养基、⑩手术刀等必须进行灭菌处理。所以，①②③⑧⑨应该用消毒的方法处理，A正确，BCD错误。故选A。
对点训练1．自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题：(1)对培养基进行灭菌时，多采取_____________法，而对接种环或涂布器灭菌时则用________法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧________次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时，要从上次划线的________开始划线，最后一次划的线不能与第一次划的线________。
(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中______培养，以减少培养基中水分的挥发。其中，培养未接种的固体培养基是为了______________________________。长期保存菌种时，应将培养的菌液与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱中保存。
作为对照组，排除培养基被杂菌污染
(3)甲、乙两组同学用稀释涂布平板法测定某种微生物的数量，在同一稀释倍数下每隔一段时间记录数据(统计时间内微生物总数小于环境容纳量)，得到如表结果：
据表可知，计数时最好取培养________小时记录的菌落数作为实验结果，一方面是由于培养时间较短，会遗漏菌落数目，另一方面是由于___________________________________________。
培养时间过长，两个或多个菌落连成一个菌落
解析：(1)对培养基进行灭菌时，多采取高压蒸汽灭菌法，而对接种环或涂布器灭菌时则用灼烧灭菌法。接种环在每次接种前都要灼烧灭菌，最后一次接种完也要灭菌，所以在固体培养基表面连续进行了5次划线，需要对接种环灼烧6次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时，要从上次划线的末端开始划线，使菌体的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终获得由单个菌体形成的单个菌落。最后一次划的线不能与第一次划的线相连。(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温培养箱中倒置培养，以减少培养基中水分的挥发。培养未接种的固体培养基是为了作为对照组，排除培养基被杂菌污染。长期保存菌种时，应将培养的菌液与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱保存。(3)根据表中数据可知，甲组和乙组中的菌落数都在72小时达到最大，由此推知最好取72小时记录的菌落数作为实验结果，原因：①培养时间不足会遗落菌落数目；②培养时间过长会导致两个或多个菌落连成一个菌落，使计数不准确。
考向二 微生物的纯培养
2.如图为实验室培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列说法正确的是( )
A．步骤②中打开含菌种的试管后需将试管口通过酒精灯火焰灭菌B．步骤④中接种环共需5次灼烧处理C．将接种后的图④平板放入培养箱中培养时无须倒置D．①②③步骤操作时都不需要在酒精灯火焰旁进行
解析:打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需再次通过火焰，塞上棉塞才可以，A正确；每次接种前后都要灼烧接种环，因此完成步骤④中的5次划线操作共需灼烧接种环6次，B错误；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，这样可以防止表面的水分过快挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，C错误；①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，D错误。
对点训练2．微生物培养时常利用无菌技术避免杂菌的污染，相关叙述错误的是( )A．配制好的培养基应放入干热灭菌箱中进行干热灭菌B．实验中避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触C．接种前后的接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧D．实验结束后对实验室喷洒石碳酸同时配合紫外线照射
解析：对培养基灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法，A错误；为避免杂菌污染，实验中应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触，B正确；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭空间内的空气常采用紫外线照射消毒，喷洒石碳酸同时配合紫外线照射可提高对密闭空间的消毒效果，D正确。故选A。
1.培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( )2.消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( )3.无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌( )4.配制培养基时应先灭菌再调pH( )5.平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧( )6.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( )
1.(选择性必修3 P10)培养基的化学成分包括 等。2.(选择性必修3 P10)获得纯净的微生物培养物的关键是 ，无菌技术除了用来 外，还能___ 。3.选择性必修3 P10“旁栏思考”：培养基中加入氮源的原因是_____________________________________________ 。4.选择性必修3 P10“相关信息”：生物消毒法是指利用生物或其_____除去环境中的部分微生物的方法。
水、无机盐、碳源、氮源
防止实验室的培养物被其他外来微生物污染
有效避免操作者自身被微生物感染
培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的
5.(选择性必修3 P12)菌落是指____________________________________ 。采用_____ 法和 法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内
部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体
6.(选择性必修3 P12)平板冷凝后，要将平板倒置的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基中的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
7.选择性必修3 P13“结果分析”：如果在未接种的培养基表面有菌落，说明 。
8.(选择性必修3 P13)操作的第一步灼烧接种环是为了________________ ；每次划线前灼烧接种环是为了_________________________________________________________________________________________________，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能__________________________________________________________。9.(选择性必修3 P13)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是 。
束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端
接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
以免接种环温度太高，杀死菌种
10.(选择性必修3 P13)在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要
少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
微生物的选择培养和计数
1.区分选择培养基与鉴别培养基
对土样充分稀释后，将菌液涂布到制备好的选择培养基上，即稀释涂布平板法。
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
稀释涂布平板法:是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
注意：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。包括系列稀释（梯度稀释）和涂布平板两个步骤
稀释涂布平板法及其操作过程
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。
注意：1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；4.将涂布器从酒精中取出时，要让多于的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d； 放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d； 霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。 每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
(1)间接计数法——稀释涂布平板法
计数原则 ①一般选择菌落数为30～300的平板计数； ②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 ③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的细菌数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）。（ ） A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)直接计数法——显微镜直接计数
快速、直观，能观察微生物的形态特征。
不能区分死菌和活菌，统计结果一般是活菌数和死菌数的总和
土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作(1)分离原理
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
设置对照的方法： ①空白对照：不给对照组任何处理因素； ②条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素； ③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行； ④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
实验的具体操作：（一）土壤取样（二）配制土壤溶液和制备培养基（三）系列稀释（四）涂布平板（五）微生物的培养、观察及菌落计数（六）鉴定
①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。（细菌适宜在该环境中生长）②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。（细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。）
应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
配制土壤溶液和制备培养基
①选择培养基 以尿素为唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培养基 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。 分离不同的微生物采用不同的稀释度。
为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将细菌稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
选用1×104、1×105、1×106 、1×107倍稀释倍数进行涂布平板
实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度培养物等。 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
微生物的培养、观察及菌落计数
在本实验中，我们可以每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
倒置于30~37℃下培养1~2d
菌落的特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。
酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌，
伊红一美蓝培养基：鉴定大肠杆茵 原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→菌落呈深黑色。
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散。
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的
考向 微生物的选择培养
1.下列关于微生物培养和分离的说法中，正确的是( )A．先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，立即出现有透明圈的菌落B．筛选纤维素分解菌的实验流程中不可省略选择培养这一步C．菌落的大小、颜色、有无荚膜、隆起程度等特征都可作为菌种肉眼鉴定的依据D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌
解析:先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，此种方法需用氯化钠洗去浮色，再观察出现有透明圈的菌落，A错误；选择培养可省略，但培养分离的纤维素分解菌少，B错误；菌落的大小、颜色、隆起程度等特征都可作为菌种鉴定的依据，但是有无荚膜通过肉眼无法观察，C错误；在只含有尿素作为氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌，D正确。故选D。
[对点训练]1．进行垃圾分类收集可以减少垃圾处理时间，降低处理成本。科研小组欲分离及培养若干种微生物用于对湿垃圾(包括剩菜剩饭、骨头、菜根菜叶、果皮等食品类废物)的处理。下列有关叙述正确的是( )A．在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和操作者的双手进行灭菌B．培养过程需要向培养基通入无菌空气并进行搅拌，目的是使菌体充分接触营养物质和溶解氧，促进细菌繁殖C．科研小组若从生活垃圾中分离分解尿素的微生物，可在培养基中加入酚红指示剂，如果有尿素分解菌存在，则培养基中该菌落的周围会出现黑色D．该实验培养基为选择培养基，无需进行未接种培养基的培养
解析: 在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌处理，对操作者的双手进行消毒处理，A错误；培养过程需要向培养基通入无菌空气并进行搅拌，目的是使菌体充分接触营养物质和溶解氧，促进细菌生长繁殖，B正确；科研小组若从生活垃圾中分离分解尿素的微生物，可在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素，C错误；进行细菌培养的同时需进行未接种培养基的培养，其对照作用，D错误。故选B。
考向 微生物的分离和计数
2.某兴趣小组从校园土壤取样，进行“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验。小明从稀释度为106培养基中筛选出约120个菌落，而其他同学只筛选出约40个菌落。下列叙述错误的是( )A．小明出现这种结果的可能原因是和其他同学取样的土壤不同B．要证明培养基是否受到污染，可将小明配制的培养基不接种进行培养C．当稀释倍数太小时，可能由于菌落重叠导致计数结果偏小D．其他同学土样的细菌悬液中分解尿素的细菌数量约为4×108个
解析:小明筛选出的菌落数明显比其他同学多，出现这种结果的可能原因是和其他同学取样的土壤不同，也有可能是培养基混入其他氮源或培养基被污染，A正确；要证明培养基是否受到污染，可将小明配制的培养基不加土样进行培养，即进行空白对照，B正确；当稀释倍数太小时，两个或两个以上细菌连在一起时，培养基上看到的是一个菌落，可能会出现菌落重叠而导致计数结果偏小，C正确；其他同学选出约40个菌落，所以土样的细菌悬液中分解尿素的细菌数量约为40×106＝4×107个，D错误。故选D。
[对点训练]2．某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是( )A．可得出土壤样液中活菌数大约为5.7×107个/LB．此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低C．一般选择菌落数在30～300的平板进行计数D．显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数
解析:将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58，据此可得出每升样品中的活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×1000×100＝5.7×107个，A正确；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一处菌落，所以统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B正确；一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，C正确；显微镜直接计数法统计的都是稀释液中所有个体的数目，包括死菌，D错误。
1.选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( )2.尿素在脲酶的催化作用下分解成无机物( )3.对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法( )4.筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( )5.分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( )
6.配制培养不同微生物的培养基时都要将培养基调至中性或弱碱性( )7.统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计( )
1.(选择性必修3 P16)选择培养基是指______________________________ 。
在微生物学中，将允许特定种类的微
生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
2.（选择性必修3 P18）血细胞计数板常用于相对 的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板常用于相对 的细菌等的计数。
3.(源于选择性必修3 P18“正文”)统计某一稀释度下平板上的菌落数的要求是 。4.(选择性必修3 P18)当__________________________________________ ，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
统计3个菌落数在30～300之间的平板，计算菌落数的平均值
两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是
5.(选择性必修3 P19)检测培养物中是否有杂菌污染的方法是_________ 。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是_____________________________________________ 。
菌后的未接种的培养基，观察是否有菌落产生
配制牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，观察选择培养
基上的菌落数是否远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目
6.选择性必修3 P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________。
分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素
7.(选择性必修3 P20“拓展应用2”)在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________。
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的
环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境
1．(2020·浙江7月)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是( )A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
解析:利用尿素固体培养基，由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生长繁殖，而保留利用尿素的微生物，并非杀死，A错误；不同的微生物所需的pH不同，所以配置培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；酵母菌不能直接利用淀粉，应用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化，再用酵母菌发酵得到糯米酒，C正确；醋化醋杆菌在有氧条件下利用酒精产生醋酸，D正确。故选A。
2．(2020·江苏卷)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如下图所示。下列叙述正确的是( )
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
解析:倒平板后无需晃动，A错误；Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，C错误；刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，D错误。故选B。
3．葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣(皮渣)。目前这些皮渣主要用作饲料或肥料，同时研究者也采取多种措施拓展其利用价值。回答下列问题：(1)皮渣中含有较多的天然食用色素花色苷，可用萃取法提取。萃取前将原料干燥、粉碎的目的分别是_______________________________________，萃取效率主要取决于萃取剂的____________。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷________。研究发现，萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理可提高花色苷的提取率，原因是_______________________________________________________。
利于萃取剂溶解花色苷、使原料与萃取剂充分接触
纤维素酶、果胶酶可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率
(2)为了解皮渣中微生物的数量，取10 g皮渣加入90 mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则每克皮渣中微生物数量为________个。(3)皮渣堆积会积累醋酸菌，可从中筛选优良菌株。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至__________性，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙的目的是_______________________________________________。培养筛选得到的醋酸菌时，在缺少糖源的液体培养基中可加入乙醇作为________。
使培养基不透明，从而使醋酸菌菌落周围出现透明圈
(4)皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。(简要写出实验步骤和预期结果)。
实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落
解析:(1)天然食用色素花色苷可用萃取法提取，萃取剂与水应不混溶，萃取前将原料干燥，有利于萃取剂溶解花色苷，提高溶解率；粉碎的目的是使原料与萃取剂充分接触；萃取效率主要取决于萃取剂的性质和使用量。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷分解。萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理，可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率。(2)为了解皮渣中微生物的数量，取10 g皮渣加入90 mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则三个平板中平均菌落数为(78＋91＋95)÷3＝88，每克皮渣中微生物数量为88÷0.1×104＝8.8×106个。
第53讲微生物的培养技术及应用
1.获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。2.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的基础。3.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品和无菌区域不被微生物污染的技术。4.举例说明通过调整培养基的配方可有目的的培养某种微生物。5.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。6.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点一 微生物的基本培养技术
考点二 微生物的选择培养和计数
主要考点 必备知识
1.微生物的定义：肉眼难以看清，需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的总称。
3.微生物菌落 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
由单个微生物繁殖形成的纯培养物就是一个单菌落； 一个单菌落就是一个种群
在实验室培养微生物的要求？
提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
确保其它微生物无法混入
（1）培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
基本成分：碳源、氮源、水、无机盐
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：牛肉膏、蛋白胨等
无机氮源：NH4＋、NO3-
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素等
(2)培养基的作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
乳酸杆菌:需要在培养基中添加维生素
霉菌：需将培养基pH调至酸性
细菌：需将培养基pH调至中性或弱碱性
厌氧生物：提供无氧条件
特殊需求：在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求，培养基的成分举例如下：
（1）培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
补充说明（1）含有C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源；（2）自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源；（3）自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源，因此可以根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型；（4）无机氮源不但能给自养型微生物提供氮源，也能作为能源物质，如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）（5）无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）
培养基的配制原则(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用K2HPO4－KH2PO4。
液体培养基：扩大培养、工业生产
固体培养基：纯化（分离）、鉴定、活菌计数、保藏菌种
有无 凝固剂琼脂
实验室常用的固体培养基是琼脂固体培养基
琼脂（agar）是一种从红藻中提取的多糖。琼脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。
天然培养基：利用天然的动、植物或微生物包括其提取物制成的培养基。其营养成分复杂而丰富，难以确切了解培养基的化学成分。合成培养基：根据微生物的营养需求，将各种纯化学物质按一定比例配制而成的培养基。半合成培养基：由一部分纯化学物质、一部分天然物质配制而成的培养基。（举例：牛肉膏蛋白胨培养基）
注意：人工合成的培养基，培养基成分明确（第2个）；含化学成分不 明确的天然物质（其他2个）
拓展：培养基的类型之其他划分方式
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化。
①加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌
②不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌
①加入伊红美蓝的培养基：鉴别大肠杆菌
②加入刚果红的培养基：鉴别纤维素分解菌
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。
关键：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
常用方法：主要包括消毒和灭菌。
目的：获得纯净的微生物培养物
(1)消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。 可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：62-65℃煮30min或 80℃-90℃下处理30s-1min。 可杀死绝大多数微生物，不破坏食物的营养成分。
③化学药物消毒法：用75%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等④紫外线消毒法：对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。
概念：用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。
芽孢：某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体
孢子：某些生物的繁殖体
芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射
①做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。②为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
注意：选择无菌技术的原则：一要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；二要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
100 ℃煮沸5～6 min
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线照射30 min
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
配制培养基→灭菌→接种→分离→培养
采用划线或涂布的接种方法实现目标微生物的分离与纯化
①分散的微生物在适宜的固体培养培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见菌落。
②采用平板划线法或稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上。之后经培养得到的的单菌落一般是由单个为微生物繁殖形成的纯培养物。
通过接种环在固体培养基（平板）表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到由单个微生物繁殖而形成的单菌落。
(1)酵母菌纯培养的操作步骤
制备培养基(配制培养基、灭菌、倒平板)↓接种和分离酵母菌↓培养酵母菌(将接种后的平板和一个未接种的平板倒置、培养)
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
加葡萄糖/蔗糖(20g)
加水定容(1000mL)
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15～30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
放入高压蒸汽灭菌锅中(100kPa、121℃)
②将瓶口迅速通过火焰。
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 ~ 20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置。
防止瓶口的微生物污染培养基
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养了一段时间，这样做的目的是？
检测培养基平板灭菌是否合格
注意：平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞
3、将试管口通过火焰
.4、将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
5、将试管通过火焰，并塞上棉塞
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
8、将平板倒置放入培养箱中培养。
（1）接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次。（2）划线首尾不能相接。（3）每次划线前接种环进行灭菌。（4）划线后,培养皿倒置培养。（5）不能划破培养基，一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
思考1 为什么要将平板倒置（背诵）？
思考2 为什么要同时放入未接种的平板？
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染。
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24-48 h。
制备培养基(配制培养基、灭菌、倒平板)↓接种和分离酵母菌↓培养酵母菌(将接种后的平板和一个 的平板倒置、培养)
考向 培养基与无菌技术
1.消毒和灭菌是两个不同的概念，灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力。消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害。下列哪些事物适用于消毒处理( )①皮肤 ②饮用水 ③牛奶 ④注射器⑤培养皿 ⑥接种环 ⑦培养基 ⑧果汁⑨酱油 ⑩手术刀A．①②③⑧⑨ B．④⑤⑥⑦C．①②③④⑤⑥ D．以上全部
解析：消毒指用比较温和的方法杀死微生物的营养细胞，适用于那些不耐高温的液体，如③牛奶、⑧果汁、⑨酱油，这样可以使其中的营养成分不被破坏；对要求不是很严格的①皮肤、②饮用水也用消毒的方法处理；而对于严格要求的④注射器、⑤培养皿、⑥接种环、⑦培养基、⑩手术刀等必须进行灭菌处理。所以，①②③⑧⑨应该用消毒的方法处理，A正确，BCD错误。故选A。
对点训练1．自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题：(1)对培养基进行灭菌时，多采取_____________法，而对接种环或涂布器灭菌时则用________法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧________次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时，要从上次划线的________开始划线，最后一次划的线不能与第一次划的线________。
(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中______培养，以减少培养基中水分的挥发。其中，培养未接种的固体培养基是为了______________________________。长期保存菌种时，应将培养的菌液与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱中保存。
作为对照组，排除培养基被杂菌污染
(3)甲、乙两组同学用稀释涂布平板法测定某种微生物的数量，在同一稀释倍数下每隔一段时间记录数据(统计时间内微生物总数小于环境容纳量)，得到如表结果：
据表可知，计数时最好取培养________小时记录的菌落数作为实验结果，一方面是由于培养时间较短，会遗漏菌落数目，另一方面是由于___________________________________________。
培养时间过长，两个或多个菌落连成一个菌落
解析：(1)对培养基进行灭菌时，多采取高压蒸汽灭菌法，而对接种环或涂布器灭菌时则用灼烧灭菌法。接种环在每次接种前都要灼烧灭菌，最后一次接种完也要灭菌，所以在固体培养基表面连续进行了5次划线，需要对接种环灼烧6次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时，要从上次划线的末端开始划线，使菌体的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终获得由单个菌体形成的单个菌落。最后一次划的线不能与第一次划的线相连。(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温培养箱中倒置培养，以减少培养基中水分的挥发。培养未接种的固体培养基是为了作为对照组，排除培养基被杂菌污染。长期保存菌种时，应将培养的菌液与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱保存。(3)根据表中数据可知，甲组和乙组中的菌落数都在72小时达到最大，由此推知最好取72小时记录的菌落数作为实验结果，原因：①培养时间不足会遗落菌落数目；②培养时间过长会导致两个或多个菌落连成一个菌落，使计数不准确。
考向二 微生物的纯培养
2.如图为实验室培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列说法正确的是( )
A．步骤②中打开含菌种的试管后需将试管口通过酒精灯火焰灭菌B．步骤④中接种环共需5次灼烧处理C．将接种后的图④平板放入培养箱中培养时无须倒置D．①②③步骤操作时都不需要在酒精灯火焰旁进行
解析:打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需再次通过火焰，塞上棉塞才可以，A正确；每次接种前后都要灼烧接种环，因此完成步骤④中的5次划线操作共需灼烧接种环6次，B错误；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，这样可以防止表面的水分过快挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，C错误；①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，D错误。
对点训练2．微生物培养时常利用无菌技术避免杂菌的污染，相关叙述错误的是( )A．配制好的培养基应放入干热灭菌箱中进行干热灭菌B．实验中避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触C．接种前后的接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧D．实验结束后对实验室喷洒石碳酸同时配合紫外线照射
解析：对培养基灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法，A错误；为避免杂菌污染，实验中应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触，B正确；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭空间内的空气常采用紫外线照射消毒，喷洒石碳酸同时配合紫外线照射可提高对密闭空间的消毒效果，D正确。故选A。
1.培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( )2.消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( )3.无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌( )4.配制培养基时应先灭菌再调pH( )5.平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧( )6.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( )
1.(选择性必修3 P10)培养基的化学成分包括 等。2.(选择性必修3 P10)获得纯净的微生物培养物的关键是 ，无菌技术除了用来 外，还能___ 。3.选择性必修3 P10“旁栏思考”：培养基中加入氮源的原因是_____________________________________________ 。4.选择性必修3 P10“相关信息”：生物消毒法是指利用生物或其_____除去环境中的部分微生物的方法。
水、无机盐、碳源、氮源
防止实验室的培养物被其他外来微生物污染
有效避免操作者自身被微生物感染
培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的
5.(选择性必修3 P12)菌落是指____________________________________ 。采用_____ 法和 法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内
部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体
6.(选择性必修3 P12)平板冷凝后，要将平板倒置的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基中的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
7.选择性必修3 P13“结果分析”：如果在未接种的培养基表面有菌落，说明 。
8.(选择性必修3 P13)操作的第一步灼烧接种环是为了________________ ；每次划线前灼烧接种环是为了_________________________________________________________________________________________________，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能__________________________________________________________。9.(选择性必修3 P13)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是 。
束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端
接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
以免接种环温度太高，杀死菌种
10.(选择性必修3 P13)在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要
少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
微生物的选择培养和计数
1.区分选择培养基与鉴别培养基
对土样充分稀释后，将菌液涂布到制备好的选择培养基上，即稀释涂布平板法。
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
稀释涂布平板法:是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
注意：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。包括系列稀释（梯度稀释）和涂布平板两个步骤
稀释涂布平板法及其操作过程
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。
注意：1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；4.将涂布器从酒精中取出时，要让多于的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d； 放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d； 霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。 每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
(1)间接计数法——稀释涂布平板法
计数原则 ①一般选择菌落数为30～300的平板计数； ②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 ③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的细菌数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）。（ ） A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)直接计数法——显微镜直接计数
快速、直观，能观察微生物的形态特征。
不能区分死菌和活菌，统计结果一般是活菌数和死菌数的总和
土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作(1)分离原理
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
设置对照的方法： ①空白对照：不给对照组任何处理因素； ②条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素； ③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行； ④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
实验的具体操作：（一）土壤取样（二）配制土壤溶液和制备培养基（三）系列稀释（四）涂布平板（五）微生物的培养、观察及菌落计数（六）鉴定
①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。（细菌适宜在该环境中生长）②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。（细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。）
应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
配制土壤溶液和制备培养基
①选择培养基 以尿素为唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培养基 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。 分离不同的微生物采用不同的稀释度。
为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将细菌稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
选用1×104、1×105、1×106 、1×107倍稀释倍数进行涂布平板
实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度培养物等。 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
微生物的培养、观察及菌落计数
在本实验中，我们可以每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
倒置于30~37℃下培养1~2d
菌落的特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。
酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌，
伊红一美蓝培养基：鉴定大肠杆茵 原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→菌落呈深黑色。
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散。
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的
考向 微生物的选择培养
1.下列关于微生物培养和分离的说法中，正确的是( )A．先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，立即出现有透明圈的菌落B．筛选纤维素分解菌的实验流程中不可省略选择培养这一步C．菌落的大小、颜色、有无荚膜、隆起程度等特征都可作为菌种肉眼鉴定的依据D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌
解析:先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，此种方法需用氯化钠洗去浮色，再观察出现有透明圈的菌落，A错误；选择培养可省略，但培养分离的纤维素分解菌少，B错误；菌落的大小、颜色、隆起程度等特征都可作为菌种鉴定的依据，但是有无荚膜通过肉眼无法观察，C错误；在只含有尿素作为氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌，D正确。故选D。
[对点训练]1．进行垃圾分类收集可以减少垃圾处理时间，降低处理成本。科研小组欲分离及培养若干种微生物用于对湿垃圾(包括剩菜剩饭、骨头、菜根菜叶、果皮等食品类废物)的处理。下列有关叙述正确的是( )A．在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和操作者的双手进行灭菌B．培养过程需要向培养基通入无菌空气并进行搅拌，目的是使菌体充分接触营养物质和溶解氧，促进细菌繁殖C．科研小组若从生活垃圾中分离分解尿素的微生物，可在培养基中加入酚红指示剂，如果有尿素分解菌存在，则培养基中该菌落的周围会出现黑色D．该实验培养基为选择培养基，无需进行未接种培养基的培养
解析: 在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌处理，对操作者的双手进行消毒处理，A错误；培养过程需要向培养基通入无菌空气并进行搅拌，目的是使菌体充分接触营养物质和溶解氧，促进细菌生长繁殖，B正确；科研小组若从生活垃圾中分离分解尿素的微生物，可在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素，C错误；进行细菌培养的同时需进行未接种培养基的培养，其对照作用，D错误。故选B。
考向 微生物的分离和计数
2.某兴趣小组从校园土壤取样，进行“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验。小明从稀释度为106培养基中筛选出约120个菌落，而其他同学只筛选出约40个菌落。下列叙述错误的是( )A．小明出现这种结果的可能原因是和其他同学取样的土壤不同B．要证明培养基是否受到污染，可将小明配制的培养基不接种进行培养C．当稀释倍数太小时，可能由于菌落重叠导致计数结果偏小D．其他同学土样的细菌悬液中分解尿素的细菌数量约为4×108个
解析:小明筛选出的菌落数明显比其他同学多，出现这种结果的可能原因是和其他同学取样的土壤不同，也有可能是培养基混入其他氮源或培养基被污染，A正确；要证明培养基是否受到污染，可将小明配制的培养基不加土样进行培养，即进行空白对照，B正确；当稀释倍数太小时，两个或两个以上细菌连在一起时，培养基上看到的是一个菌落，可能会出现菌落重叠而导致计数结果偏小，C正确；其他同学选出约40个菌落，所以土样的细菌悬液中分解尿素的细菌数量约为40×106＝4×107个，D错误。故选D。
[对点训练]2．某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是( )A．可得出土壤样液中活菌数大约为5.7×107个/LB．此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低C．一般选择菌落数在30～300的平板进行计数D．显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数
解析:将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58，据此可得出每升样品中的活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×1000×100＝5.7×107个，A正确；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一处菌落，所以统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B正确；一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，C正确；显微镜直接计数法统计的都是稀释液中所有个体的数目，包括死菌，D错误。
1.选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( )2.尿素在脲酶的催化作用下分解成无机物( )3.对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法( )4.筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( )5.分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( )
6.配制培养不同微生物的培养基时都要将培养基调至中性或弱碱性( )7.统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计( )
1.(选择性必修3 P16)选择培养基是指______________________________ 。
在微生物学中，将允许特定种类的微
生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
2.（选择性必修3 P18）血细胞计数板常用于相对 的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板常用于相对 的细菌等的计数。
3.(源于选择性必修3 P18“正文”)统计某一稀释度下平板上的菌落数的要求是 。4.(选择性必修3 P18)当__________________________________________ ，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
统计3个菌落数在30～300之间的平板，计算菌落数的平均值
两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是
5.(选择性必修3 P19)检测培养物中是否有杂菌污染的方法是_________ 。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是_____________________________________________ 。
菌后的未接种的培养基，观察是否有菌落产生
配制牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，观察选择培养
基上的菌落数是否远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目
6.选择性必修3 P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________。
分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素
7.(选择性必修3 P20“拓展应用2”)在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________。
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的
环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境
1．(2020·浙江7月)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是( )A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
解析:利用尿素固体培养基，由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生长繁殖，而保留利用尿素的微生物，并非杀死，A错误；不同的微生物所需的pH不同，所以配置培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；酵母菌不能直接利用淀粉，应用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化，再用酵母菌发酵得到糯米酒，C正确；醋化醋杆菌在有氧条件下利用酒精产生醋酸，D正确。故选A。
2．(2020·江苏卷)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如下图所示。下列叙述正确的是( )
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
解析:倒平板后无需晃动，A错误；Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，C错误；刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，D错误。故选B。
3．葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣(皮渣)。目前这些皮渣主要用作饲料或肥料，同时研究者也采取多种措施拓展其利用价值。回答下列问题：(1)皮渣中含有较多的天然食用色素花色苷，可用萃取法提取。萃取前将原料干燥、粉碎的目的分别是_______________________________________，萃取效率主要取决于萃取剂的____________。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷________。研究发现，萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理可提高花色苷的提取率，原因是_______________________________________________________。
利于萃取剂溶解花色苷、使原料与萃取剂充分接触
纤维素酶、果胶酶可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率
(2)为了解皮渣中微生物的数量，取10 g皮渣加入90 mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则每克皮渣中微生物数量为________个。(3)皮渣堆积会积累醋酸菌，可从中筛选优良菌株。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至__________性，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙的目的是_______________________________________________。培养筛选得到的醋酸菌时，在缺少糖源的液体培养基中可加入乙醇作为________。
使培养基不透明，从而使醋酸菌菌落周围出现透明圈
(4)皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。(简要写出实验步骤和预期结果)。
实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落
解析:(1)天然食用色素花色苷可用萃取法提取，萃取剂与水应不混溶，萃取前将原料干燥，有利于萃取剂溶解花色苷，提高溶解率；粉碎的目的是使原料与萃取剂充分接触；萃取效率主要取决于萃取剂的性质和使用量。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷分解。萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理，可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率。(2)为了解皮渣中微生物的数量，取10 g皮渣加入90 mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则三个平板中平均菌落数为(78＋91＋95)÷3＝88，每克皮渣中微生物数量为88÷0.1×104＝8.8×106个。
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