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新高考生物二轮复习热点专题专项突破课件 专题一0二+基因工程(含PCR和电泳视频)（含答案）
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这是一份新高考生物二轮复习热点专题专项突破课件 专题一0二+基因工程(含PCR和电泳视频)（含答案），共46页。PPT课件主要包含了磷酸二酯，④②③①，显微注射法，Ca2＋处理法，原核细胞，农杆菌转化法，体细胞或受精卵，受精卵，害虫死亡，未出现病斑等内容，欢迎下载使用。
熟记基因工程的四个操作程序
1．载体必须具备的条件：①能在受体细胞中保存下来并能自我复制；②具有1个或多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有标记基因。（P72）2．PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（P77）3．PCR反应过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。（P79）4．基因表达载体要包括以下四个基本的结构：目的基因、启动子、终止子、标记基因。（P80）5．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（P80）
6．启动子位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。（P80）7．标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（或供重组DNA的鉴定和选择）。8．检查转基因抗虫棉是否培育成功，首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。（P82）9.PCR反应需提供分别与DNA两条链结合的两种引物，引物的作用是：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。（P77）
Ⅰ.基因工程的理论基础
Ⅱ.基因工程的基本工具
能力训练：1.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，ner表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是( )A．图甲中的质粒用BamH Ⅰ切割后，含有4个游离的磷酸基团B．在构建重组质粒时，可用Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒和外源DNAC．用Pst Ⅰ和Hind Ⅲ酶切，可以保证目的基因与质粒正确连接D．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
2.研究人员利用一种从鱼体内分离出的抗冻基因，培育出抗冻番茄植株，使得其幼苗的致死低温下降了2 ℃。具体研发过程如下图(其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因)。回答下列问题：
(1)不用限制酶Alu Ⅰ切割鱼抗冻基因的原因是 ，选择Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割鱼抗冻基因和质粒，而不是只选择Pst Ⅰ一种酶切割抗冻基因和质粒的优点是 。
Alu Ⅰ酶会破坏鱼抗冻基因
可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基因、质粒自身环化
(2)研究人员用Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割抗冻基因和质粒，获得含抗冻基因的重组质粒后，又用不同的限制酶对原质粒和重组质粒进行酶切，获得片段大小如下表：(1 kb＝1 000 bp，1 bp为一个碱基对，注意：DNA片段大小与图中所画比例一致)
由表中数据可知，鱼抗冻基因的长度为________，若不考虑终止密码子，抗冻基因合成的抗冻蛋白最多由________个氨基酸组成
难点突破：1.限制酶的选择原则
（1）根据目的基因确定限制酶①应选择位于目的基因两端的限制酶；②不能选择目的基因内部的限制酶。
Ⅲ.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
（1）筛选：一般从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（3）PCR技术及应用
体内DNA复制引物是RNA
结果：① n次复制后含有引物A的_______个。含有引物B的_______个。同时含有引物A和B的_______个。②从第____次扩增开始能够获得单纯的目的基因。
PCR扩增目的基因的过程：
视频讲解：PCR原理及其反应过程
如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是：
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物
能力训练：4.(2021·高考全国卷甲改编)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是____________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________________________。(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与______________特异性结合。(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指_______________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
引物通过碱基互补配对与单链DNA结合
根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
在受体细胞中稳定存在，
特别注意：①启动子、终止子a.启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。b.终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
[提醒] 若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：①目的基因与目的基因的连接；②目的基因与质粒的连接；③质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
3.将目的基因导入受体细胞
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中。
能力训练：5. 下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是( )A. 将目的基因导入植物细胞时，农杆菌转化法适用于大多数单子叶植物B. 显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C. 大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变D. 农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
6.为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是
A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株D．愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素
难点突破：2.农杆菌转化法
特别注意：两次拼接和两次导入
第一次拼接 是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接 指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。
第一次导入 是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入 是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
7．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子等。
能自我复制、具有标记基因
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是____________________________________________________________；并且______________和____________________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自_____________。
二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长
含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)
二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长
难点突破：3.四类受体细胞的筛选与判定
当用相应的限制酶切割了目的基因与载体后，可将二者混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化受体细胞，其结果有如下四种：
左边四类受体细胞中通过“标记基因”(制备的培养基)可区分出(1)(2)与(3)(4)，而通过PCR等技术，可进一步区分(3)与(4)。
4.目的基因的检测与鉴定
①目的：检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译成蛋白质
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
视频讲解：PCR产物的鉴定---琼脂糖凝胶电泳法
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
第四步：目的基因的检测与鉴定
（2）个体生物学水平鉴定
能力训练：8.（2023·广东·校联考二模）我国的生猪产量约占世界的一半。2018年8月，我国首次报告非洲猪瘟疫情（由ASFV病毒感染猪肺泡巨噬细胞引起的一种急性、高度致死性传染病，全世界尚未研制出安全有效的疫苗）：截至2021年，我国累计扑杀非洲猪瘟感染生猪超过100万头一我国科研人员在ASFV病毒的K基因（大小为790bp）中间插入荧光素酶基因（Gluc）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP），构建了可观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）体系，如左图所示，实现了ASFV病毒的快捷高效检测
回答下列问题：(1)左图中的HindID和I能切开两个核苷酸之间的磷酸二酯键，它们属于基因工程的 （工具酶）Gluc基因和EGFP基因有助于重组病毒的筛选，起到基因表达载体中 （填结构）的作用。(2)为初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员对ASFV病毒和重组病毒进行PCR扩增和电泳鉴定扩增过程中，引物的作用是 。电泳得到右图中的1号和2号两种条带，其中属于重组病毒PCR产物的条带是______号。
限制酶（限制性核酸内切酶） 标记基因
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(3)为进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将重组病毒接种到 细胞并培养一段时间，培养过程中所需的气体主要有 。要分别检测Gluc和EGFP两种基因是否成功表达，前者需要采用的方法有 ，后者则可通过观察有无绿色荧光进行判断。
抗原-抗体杂交技术，检测荧光素酶的活性
9.甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切位点示意图。回答下列相关问题：
(1) 利用转基因技术获得超甜番茄的核心步骤是 ，该过程需要选择 限制酶切割甜蛋白基因。(2)Ti质粒上的启动子是 识别和结合的位点，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为 。(3)农杆菌转化番茄细胞时，T-DNA的作用是 ， 该过程发生的变异类型为 。然后在添加 物质的培养幕中培养番茄细胞，筛选转化成功的愈伤组织。
构建基因表达载体
番茄细胞中能表达的基因的启动子
携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受
体细胞的染色体DNA上
与DNA有关的几种酶的比较
10. 如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图,请回答：（1） A→B利用的技术称为______，其中②过程需要耐高温的__________酶才能完成。（2） 图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。（3） 上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是____________法，该方法一般________（填“适宜”或“不适宜”）用于将目的基因导入单子叶植物。（4） 欲确定抗虫基因在 G 体内是否表达，在个体水平上需要做__________实验。如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的 DNA 整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占___________。
BamHⅠ和BclⅠ酶切形成的粘性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
12.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
逆转录酶(或反转录酶)
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______________________________________________。(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是__________________________________________________________。
曾感染新冠病毒，已康复
已感染新冠病毒，是患者
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
13.(2022·华师一附中调研)加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA顺序的PCR，加端PCR的引物被设计成除与模板配对的那一部分以外再加上若干碱基，以便能使扩增产物的末端加上额外的一段DNA。hIGF－1 cDNA编码成熟蛋白的序列两端无起始密码子和终止密码子的对应位置，也没有合适的限制酶割切位点，实验人员为了在枯草杆菌中表达hIGF－1，应用加端PCR技术对hIGF－1 cDNA进行改造，以期获得含有hIGF－1成熟蛋白79个氨基酸编码序列，并在两端分别带有Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点。加端PCR技术示意图如下，回答下列问题：
(1)加端PCR时应选用的引物是____________。每一个PCR循环要经过________________三个阶段。
(2)在目的基因的两端添加限制酶切割位点的目的是_________________________________________________，将含有改造后的hIGF－1基因导入枯草杆菌的常用方法是用Ca2＋处理枯草杆菌，其目的是___________________________________________________________________________________________________；原核细胞作为基因工程的受体细胞的优点有_____________________________________________________________________________________________________________________________(答出3点)。
使目的基因经限制酶切割后能
产生黏性末端和质粒相连
使枯草杆菌成为感受态细胞(或使枯草杆菌处于
一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)
原核细胞为单细胞；细胞繁殖速度快；
遗传物质相对较少；易培养；代谢速度快
14．CEA癌胚抗原是在1965年首先从结肠癌和胚胎组织中提取出的一种肿瘤相关抗原，是一种酸性糖蛋白。常用CEA抗体检测血清中的CEA含量，进行相关疾病的临床诊断。下图是CEA单克隆抗体的制备流程示意图，请据图回答下列问题：
(1)如果用某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫这种生物的cDNA文库。①表示从cDNA文库中扩增获取大量目的基因的过程，那么A和人体内的CEA基因的结构上的区别是_________________________________________________________________。制备重组质粒过程时，为确保目的基因与质粒准确连接，应采用图示中的__________________酶的切割位点。过程②常用____________法。
cDNA文库中扩增获得的目的基因中无启动子、终止子、内含子
Asc Ⅰ和BamHⅠ
(2)诱导融合成为杂交瘤细胞时，常用的诱导方法有________________________________________(写出三种)。细胞培养过程中需要的气体条件是___________________________________。
PEG融合法、电融合法
95%的空气和5%的CO2的混合气体
(3)③表示______________________过程，获得的C细胞的特点是_________________________________。
既能无限增殖，又能分泌专一抗体
(4)应用获得的单克隆抗体搭载抗癌药物制成“生物导弹”治疗癌症，单克隆抗体具有的优点是_________________________________________________________________________。
能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
回答下列问题。(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是_________________。(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是________________。
15．(2021·高考海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
熟记基因工程的四个操作程序
1．载体必须具备的条件：①能在受体细胞中保存下来并能自我复制；②具有1个或多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有标记基因。（P72）2．PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（P77）3．PCR反应过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。（P79）4．基因表达载体要包括以下四个基本的结构：目的基因、启动子、终止子、标记基因。（P80）5．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（P80）
6．启动子位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。（P80）7．标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（或供重组DNA的鉴定和选择）。8．检查转基因抗虫棉是否培育成功，首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。（P82）9.PCR反应需提供分别与DNA两条链结合的两种引物，引物的作用是：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。（P77）
Ⅰ.基因工程的理论基础
Ⅱ.基因工程的基本工具
能力训练：1.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，ner表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是( )A．图甲中的质粒用BamH Ⅰ切割后，含有4个游离的磷酸基团B．在构建重组质粒时，可用Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒和外源DNAC．用Pst Ⅰ和Hind Ⅲ酶切，可以保证目的基因与质粒正确连接D．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
2.研究人员利用一种从鱼体内分离出的抗冻基因，培育出抗冻番茄植株，使得其幼苗的致死低温下降了2 ℃。具体研发过程如下图(其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因)。回答下列问题：
(1)不用限制酶Alu Ⅰ切割鱼抗冻基因的原因是 ，选择Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割鱼抗冻基因和质粒，而不是只选择Pst Ⅰ一种酶切割抗冻基因和质粒的优点是 。
Alu Ⅰ酶会破坏鱼抗冻基因
可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基因、质粒自身环化
(2)研究人员用Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割抗冻基因和质粒，获得含抗冻基因的重组质粒后，又用不同的限制酶对原质粒和重组质粒进行酶切，获得片段大小如下表：(1 kb＝1 000 bp，1 bp为一个碱基对，注意：DNA片段大小与图中所画比例一致)
由表中数据可知，鱼抗冻基因的长度为________，若不考虑终止密码子，抗冻基因合成的抗冻蛋白最多由________个氨基酸组成
难点突破：1.限制酶的选择原则
（1）根据目的基因确定限制酶①应选择位于目的基因两端的限制酶；②不能选择目的基因内部的限制酶。
Ⅲ.基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
（1）筛选：一般从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（3）PCR技术及应用
体内DNA复制引物是RNA
结果：① n次复制后含有引物A的_______个。含有引物B的_______个。同时含有引物A和B的_______个。②从第____次扩增开始能够获得单纯的目的基因。
PCR扩增目的基因的过程：
视频讲解：PCR原理及其反应过程
如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是：
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物
能力训练：4.(2021·高考全国卷甲改编)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是____________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________________________。(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与______________特异性结合。(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指_______________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
引物通过碱基互补配对与单链DNA结合
根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
在受体细胞中稳定存在，
特别注意：①启动子、终止子a.启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。b.终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
[提醒] 若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：①目的基因与目的基因的连接；②目的基因与质粒的连接；③质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
3.将目的基因导入受体细胞
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中。
能力训练：5. 下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是( )A. 将目的基因导入植物细胞时，农杆菌转化法适用于大多数单子叶植物B. 显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C. 大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变D. 农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
6.为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是
A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株D．愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素
难点突破：2.农杆菌转化法
特别注意：两次拼接和两次导入
第一次拼接 是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接 指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。
第一次导入 是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入 是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
7．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子等。
能自我复制、具有标记基因
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是____________________________________________________________；并且______________和____________________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自_____________。
二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长
含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)
二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长
难点突破：3.四类受体细胞的筛选与判定
当用相应的限制酶切割了目的基因与载体后，可将二者混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化受体细胞，其结果有如下四种：
左边四类受体细胞中通过“标记基因”(制备的培养基)可区分出(1)(2)与(3)(4)，而通过PCR等技术，可进一步区分(3)与(4)。
4.目的基因的检测与鉴定
①目的：检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译成蛋白质
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
视频讲解：PCR产物的鉴定---琼脂糖凝胶电泳法
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
第四步：目的基因的检测与鉴定
（2）个体生物学水平鉴定
能力训练：8.（2023·广东·校联考二模）我国的生猪产量约占世界的一半。2018年8月，我国首次报告非洲猪瘟疫情（由ASFV病毒感染猪肺泡巨噬细胞引起的一种急性、高度致死性传染病，全世界尚未研制出安全有效的疫苗）：截至2021年，我国累计扑杀非洲猪瘟感染生猪超过100万头一我国科研人员在ASFV病毒的K基因（大小为790bp）中间插入荧光素酶基因（Gluc）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP），构建了可观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）体系，如左图所示，实现了ASFV病毒的快捷高效检测
回答下列问题：(1)左图中的HindID和I能切开两个核苷酸之间的磷酸二酯键，它们属于基因工程的 （工具酶）Gluc基因和EGFP基因有助于重组病毒的筛选，起到基因表达载体中 （填结构）的作用。(2)为初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员对ASFV病毒和重组病毒进行PCR扩增和电泳鉴定扩增过程中，引物的作用是 。电泳得到右图中的1号和2号两种条带，其中属于重组病毒PCR产物的条带是______号。
限制酶（限制性核酸内切酶） 标记基因
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(3)为进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将重组病毒接种到 细胞并培养一段时间，培养过程中所需的气体主要有 。要分别检测Gluc和EGFP两种基因是否成功表达，前者需要采用的方法有 ，后者则可通过观察有无绿色荧光进行判断。
抗原-抗体杂交技术，检测荧光素酶的活性
9.甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切位点示意图。回答下列相关问题：
(1) 利用转基因技术获得超甜番茄的核心步骤是 ，该过程需要选择 限制酶切割甜蛋白基因。(2)Ti质粒上的启动子是 识别和结合的位点，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为 。(3)农杆菌转化番茄细胞时，T-DNA的作用是 ， 该过程发生的变异类型为 。然后在添加 物质的培养幕中培养番茄细胞，筛选转化成功的愈伤组织。
构建基因表达载体
番茄细胞中能表达的基因的启动子
携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受
体细胞的染色体DNA上
与DNA有关的几种酶的比较
10. 如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图,请回答：（1） A→B利用的技术称为______，其中②过程需要耐高温的__________酶才能完成。（2） 图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。（3） 上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是____________法，该方法一般________（填“适宜”或“不适宜”）用于将目的基因导入单子叶植物。（4） 欲确定抗虫基因在 G 体内是否表达，在个体水平上需要做__________实验。如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的 DNA 整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占___________。
BamHⅠ和BclⅠ酶切形成的粘性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
12.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
逆转录酶(或反转录酶)
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______________________________________________。(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是__________________________________________________________。
曾感染新冠病毒，已康复
已感染新冠病毒，是患者
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
13.(2022·华师一附中调研)加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA顺序的PCR，加端PCR的引物被设计成除与模板配对的那一部分以外再加上若干碱基，以便能使扩增产物的末端加上额外的一段DNA。hIGF－1 cDNA编码成熟蛋白的序列两端无起始密码子和终止密码子的对应位置，也没有合适的限制酶割切位点，实验人员为了在枯草杆菌中表达hIGF－1，应用加端PCR技术对hIGF－1 cDNA进行改造，以期获得含有hIGF－1成熟蛋白79个氨基酸编码序列，并在两端分别带有Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点。加端PCR技术示意图如下，回答下列问题：
(1)加端PCR时应选用的引物是____________。每一个PCR循环要经过________________三个阶段。
(2)在目的基因的两端添加限制酶切割位点的目的是_________________________________________________，将含有改造后的hIGF－1基因导入枯草杆菌的常用方法是用Ca2＋处理枯草杆菌，其目的是___________________________________________________________________________________________________；原核细胞作为基因工程的受体细胞的优点有_____________________________________________________________________________________________________________________________(答出3点)。
使目的基因经限制酶切割后能
产生黏性末端和质粒相连
使枯草杆菌成为感受态细胞(或使枯草杆菌处于
一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)
原核细胞为单细胞；细胞繁殖速度快；
遗传物质相对较少；易培养；代谢速度快
14．CEA癌胚抗原是在1965年首先从结肠癌和胚胎组织中提取出的一种肿瘤相关抗原，是一种酸性糖蛋白。常用CEA抗体检测血清中的CEA含量，进行相关疾病的临床诊断。下图是CEA单克隆抗体的制备流程示意图，请据图回答下列问题：
(1)如果用某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫这种生物的cDNA文库。①表示从cDNA文库中扩增获取大量目的基因的过程，那么A和人体内的CEA基因的结构上的区别是_________________________________________________________________。制备重组质粒过程时，为确保目的基因与质粒准确连接，应采用图示中的__________________酶的切割位点。过程②常用____________法。
cDNA文库中扩增获得的目的基因中无启动子、终止子、内含子
Asc Ⅰ和BamHⅠ
(2)诱导融合成为杂交瘤细胞时，常用的诱导方法有________________________________________(写出三种)。细胞培养过程中需要的气体条件是___________________________________。
PEG融合法、电融合法
95%的空气和5%的CO2的混合气体
(3)③表示______________________过程，获得的C细胞的特点是_________________________________。
既能无限增殖，又能分泌专一抗体
(4)应用获得的单克隆抗体搭载抗癌药物制成“生物导弹”治疗癌症，单克隆抗体具有的优点是_________________________________________________________________________。
能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
回答下列问题。(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是_________________。(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是________________。
15．(2021·高考海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
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