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新高考生物一轮复习课件：第34讲 微生物的培养技术及应用（含解析）
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这是一份新高考生物一轮复习课件：第34讲 微生物的培养技术及应用（含解析），共60页。PPT课件主要包含了素养目标，营养物质，生长繁殖，加凝固剂如琼脂，②按化学成分分类，化学成分不明确，培养基成分明确，③按功能分类，青霉素，指示剂等内容，欢迎下载使用。
一、微生物的基本培养技术1.培养基(1)概念:人们按照微生物对 的不同需求,配制出的供其 的营养基质。 (2)培养基的种类、特点及用途分析①按物理状态分类
微生物分离、鉴定,活菌计数
从众多微生物中分离所需的微生物
(3)培养基营养成分的含义、作用、主要来源分析
2.无菌技术(1)目的:获得纯净培养物。(2)关键:防止外来杂菌的入侵。(3)常用方法:灭菌和消毒。 杀灭所有微生物
3.微生物的纯培养(1)微生物纯培养的操作步骤
(2)倒平板操作方法①倒平板操作流程: 。 ②乙中的灭菌方法是 。 ③丁操作需要等待 后才能进行。
(3)倒平板操作的注意事项
(4)平板划线法操作步骤
(5)平板划线操作的注意事项
旁栏边角1.(选择性必修3,第10页,旁栏思考)为什么培养基需要氮源?
2.(选择性必修3,第10页,旁栏思考)无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还有什么作用?
提示 微生物细胞内有蛋白质、核酸、磷脂等多种含氮的营养物质或代谢产物,培养基中的氮源可以作为合成这些营养物质及代谢产物的原料。
提示 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
易错辨析基于对微生物的基本培养技术的理解,判断下列表述是否正确。(1)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物,又减少消毒剂对细胞的伤害。( )(2)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。( )(3)倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。( )(4)平板划线法中每一次划线前要将接种环灼烧。( )(5)配制培养基时应先灭菌再调pH。( )(6)为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。( )
二、微生物的选择培养和计数1.筛选菌株(1)寻找目的菌株的方法:根据 ,到相应的环境中去寻找。 (2)实验室中微生物的筛选①原理:人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。②选择培养基:在生物学中,允许特定类型的微生物生长,同时 的培养基。
微生物对生存环境的要求
抑制或阻止其他种类微生物生长
2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释后,将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面,进行培养。(1)系列稀释操作,移液管需要经过灭菌。操作时,试管口和移液管应离火焰1~2 cm处。操作过程如下:
(3)培养:待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板 ,放入30~37 ℃的 中培养1~2 d。 (4)稀释涂布平板法计数的4个注意事项
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作(1)实验原理
(3)统计细菌数目的方法①显微镜直接计数法 较实际值偏高
②间接计数法——活菌计数法 较实际值偏低原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(4)实验结果分析与评价
旁栏边角1.(选择性必修3,第12页,“探究·实践”改编)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法?
提示 由于在所划的线中,一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落,而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成,而在计数时一个菌落对应着一个细菌,这样在划线所得的平板中,菌落数目远低于活菌的实际数值,所以不能用平板划线法测定活菌数量。
2.(选择性必修3,第30页,“复习与提高”改编)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图。(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么?
提示 获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法,获得图B效果的接种方法为平板划线法。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是什么?应当怎样操作才可避免此种现象?
提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌;采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
易错辨析基于对微生物的选择培养和计数的理解,判断下列表述是否正确。(1)对细菌进行计数能采用稀释涂布平板法,也能用平板划线法。( )(2)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中,尿素是唯一的氮源。( )(3)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的酸碱度降低。( )(4)刚果红可以与纤维素形成透明复合物,所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。( )(5)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中,选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度。( )
考向探究考向1培养基的配制1.(2022四川南充二模)甲、乙、丙是3种微生物,下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的3种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖;甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,而乙和丙都不能;乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,甲、丙都不能。注:“+”表示培养基中加入了这种物质,“-”表示培养基中没有加入这种物质。
下列说法正确的是( )A.甲、乙、丙都是异养型微生物B.甲、乙都是自养型微生物,丙是异养型微生物C.甲是异养型微生物,乙是固氮微生物,丙是自养型微生物D.甲是固氮微生物,乙是自养型微生物,丙是异养型微生物
答案 D 解析 根据题意可知,甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,而乙和丙都不能,而Ⅰ培养基缺少氮源,说明甲能够固氮,属于固氮微生物;乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,而甲和丙都不能,Ⅱ培养基中没有有机碳源,说明乙能够合成有机物,属于自养型微生物;而丙不能在Ⅰ培养基中生长,说明其不能固氮,又不能在Ⅱ培养基中生长,说明其不能合成有机物,只能在Ⅲ培养基中生长,说明丙属于异养型微生物。
考向2无菌技术2.下列关于微生物实验操作的叙述,错误的是( )A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌B.接种前后,接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧C.接种后的培养皿要倒置,以防培养污染D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
答案 A 解析 接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理,接种环等常用灼烧灭菌法处理,吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理,培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理,A项错误;为了防止杂菌污染,每次接种前后,接种环都要进行灼烧灭菌,B项正确;接种后,培养皿需要倒置,以防皿盖上水珠落入培养基造成污染,C项正确;分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法,后者还可以用于微生物的计数,所用培养基为固体培养基,D项正确。
考向3微生物的纯培养3.(2022山东济南一模)随着石油危机的出现,乙醇作为可再生资源中比较理想的液态燃料正受到人们越来越多的关注。自然界中可再生的木质纤维素资源极为丰富,其主要成分之一是半纤维素。半纤维素容易被酸或者酶水解,其水解产物中的85%~90%为木糖。因此利用木糖发酵生产乙醇具有重要的应用研究价值。酵母菌是传统的乙醇生产菌株,因其缺乏转化木糖的酶系而不能很好地利用木糖。自然界中某些酿酒酵母能利用木糖进行酒精发酵,某研究小组欲从土壤中分离这种酵母菌并对产酶活性进行测定,实验基本流程为:取土样→制取土壤悬液→扩大培养→选择培养→菌种分离→酶活性鉴定。
请回答下列问题。(1)扩大培养又称富集培养,可增加 ,以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。 (2)分离纯化微生物的关键是 。该研究小组将扩大培养后的混合菌液适当稀释后接种于 的选择培养基,倒置放入培养箱培养。常用的接种方法有 两种。若划线的某个平板培养后,第一划线区域的划线上都长满了菌落,第二划线区域的第一条线上无菌落,其他划线上有菌落。第二划线区城的第一条线上无菌落的原因是 。
(3)为进一步确定目的菌株的最佳产酶条件,该研究小组选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量4个因素实验。其中,培养基初始pH、培养温度会影响菌株产酶主要是因为 ;摇床转速因影响 进而影响菌株产酶。
答案 (1)目的菌株数量 (2)逐渐将聚集的菌体分散,以得到由单个细胞增殖而形成的单个菌落 以木糖为唯一碳源 平板划线法和稀释涂布平板法 接种环灼烧灭菌后未冷却即进行划线操作、未从上次划线末端开始划线(3)培养基初始pH、培养温度会影响酶活性 溶氧量、菌种与营养物质的接触
解析 (1)扩大培养又称富集培养,其目的是增加目的菌株数量,以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。(2)分离纯化微生物的关键是逐渐将聚集的菌体分散,以得到由单个细胞增殖而形成的单个菌落。为了分离这种能利用木糖进行酒精发酵的酵母菌,将扩大培养后的混合菌液适当稀释后接种于以木糖为唯一碳源的选择培养基,倒置放入培养箱培养。常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法2种。在平板划线的过程中,若接种环灼烧灭菌后未冷却即进行划线操作或未从上次划线末端开始划线等会导致第二划线区域的第一条线上无菌落。(3)选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量4个因素进行实验进一步确定目的菌株的最佳产酶条件:主要是因为培养基初始pH、培养温度会影响酶活性从而会影响菌株产酶;而摇床转速因影响溶氧量、菌种与营养物质的接触进而影响菌株产酶。
考向4分离微生物的方法4.(2022广东惠州三模)敌敌畏是一种有机磷农药,使用后残留严重且难以降解,对环境造成危害。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解敌敌畏的细菌(目标菌),具体流程如下图所示。
(1)研究人员应从 中采集土样,取土样用的小铁铲和盛土用的信封在使用前都要 。 (2)称取5 g土壤样品,加入装有45 mL无菌生理盐水的锥形瓶中,振荡培养制成菌悬液,吸取1 mL菌悬液加入含有9 mL无菌生理盐水的试管中,制成稀释 倍的菌悬液,按此方法依次系列稀释;取0.1 mL各浓度梯度的菌悬液分别接种到固体培养基上,该接种方法为 。 (3)由流程图可推测“目标菌”的呼吸类型为 ;培养微生物的锥形瓶及保藏菌种的试管均使用到棉塞,推测棉塞的作用为 。 (4)分离纯化后的微生物最初不一定具有降解敌敌畏的能力,所以要对菌株进行驯化,使其具有较高的速率来降解目标农药敌敌畏,从而筛选出耐药菌株。驯化的实质是在特定条件下,将耐药的微生物定向富集的过程。请你结合题意,简述驯化的实施方案: 。
答案 (1)长期喷洒敌敌畏农药的农田 灭菌 (2)100 稀释涂布平板法 (3)有氧呼吸 阻止外界微生物进入造成污染、保持一定的通气性 (4)配制好固体培养基,加入较大剂量(或浓度)的敌敌畏农药,将分离纯化得到的菌株接种在此平板上培养解析 (1)根据生物与环境相适应的特点,欲从土壤中筛选出能降解敌敌畏的细菌,应从长期喷洒敌敌畏农药的农田中采集土样,取土样用的小铁铲和盛土用的信封在使用前都要灭菌,以避免杂菌污染。
(2)称取5 g土壤样品,加入装有45 mL无菌生理盐水的锥形瓶中,样品被稀释了10倍,振荡培养制成菌悬液,吸取1 mL菌悬液加入含有9 mL无菌生理盐水的试管中,样品又被稀释了10倍,制成共稀释100倍的菌悬液,按此方法依次系列稀释;取0.1 mL各浓度梯度的菌悬液分别接种到固体培养基上,可得到分布均匀的菌落,该接种方法为稀释涂布平板法。(3)振荡培养可增加培养液中氧气含量,由此可推测“目标菌”的呼吸类型为有氧呼吸;培养微生物的锥形瓶及保藏菌种的试管均使用到棉塞,棉塞可阻止外界微生物进入造成污染,同时保持一定的通气性。(4)分离纯化后的微生物最初不一定具有降解敌敌畏的能力,故对菌株进行驯化,使其具有较高的速率来降解目标农药敌敌畏,可配制好固体培养基,加入较大剂量(或浓度)的敌敌畏农药,将分离纯化得到的菌株接种在此平板上培养。
方法突破1.“碳源”与“自养生物”“异养生物”的辨析(1)自养型微生物与异养型微生物的划分主要依据是能否以CO2作为碳源。需根据微生物的代谢特点去选择相应的培养基。如自养型微生物可以利用空气中的CO2,缺碳培养基可以培养自养型微生物。(2)自养型微生物所需的碳源来自含碳的无机物,而异养型微生物需要的碳源来自有机物,因此可根据培养基中的营养物质判断微生物的代谢类型。含氮无机物不但能给自养型微生物提供氮源,也能作为能源物质提供能量,如NH3既为硝化细菌提供氮源,也可作为能源物质。
2.消毒、灭菌的方法及适用对象(1)消毒方法及适用对象
(2)灭菌方法及适用对象
3.鉴别培养基的举例
考向探究考向1选择培养基1.(2022四川成都外国语学校模拟)莠去津是一种含氮农药,在土壤中不易被降解,为修复被其污染的土壤,可按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。已知莠去津在水中溶解度低,含过量莠去津的固体培养基不透明。请据下图回答下列问题。
(1)由图推断,从A瓶到C瓶液体培养的过程称为 。图中固体培养基比培养瓶中的培养基多添加了 作为凝固剂,从功能上讲,这两种培养基都属于 培养基。 (2)在将C瓶菌种接种到固体培养基之前通常要进行 。图中将菌种接种到固体培养基的方法是 ,对所用接种工具常采用的灭菌方法是 。 (3)一段时间后,培养基出现无透明带和有透明带两种菌落,我们筛选的目的菌是 (填“有透明带”或“无透明带”)菌落中的细菌,该菌落生长所需的氮元素主要来源于 。
答案 (1)选择培养 琼脂 选择 (2)梯度稀释 稀释涂布平板法 灼烧灭菌 (3)有透明带 莠去津
解析 (1)通过题图可以看出A瓶到C瓶中的培养液中除莠去津外没有其他氮源,而本实验的目的是选择降解莠去津的细菌,所以该过程是通过选择培养基选择能够降解莠去津的细菌。通常情况下,固体培养基比液体培养基中多加入的凝固剂是琼脂。从功能上讲,这两种培养基目的都是筛选出能降解莠去津的细菌,都属于选择培养基。(2)从培养液中选取细菌进行涂布培养,如果直接进行接种,培养基中的菌落将会很密,无法进行纯化,通过梯度稀释后再接种,培养基中菌落将会分开,这时就可以进行纯化和分离了。通过培养基上的菌落分布特征可以判断接种方式为稀释涂布平板法。涂布平板操作所用的接种工具是涂布器,常用灼烧灭菌法对涂布器进行灭菌。(3)莠去津在水中溶解度低,含过量莠去津的固体培养基是不透明的,能够降解培养基中的莠去津的菌落周围会形成透明带,所以选择的目的菌是有透明带菌落中的细菌,即该菌落生长所需的氮元素主要来源于莠去津。
考向2稀释涂布平板法2.(2022山东威海期末)氰化物是指含有CN基团的化合物,许多氰化物有剧毒,极少量就会使生物在短时间内中毒死亡。世界卫生组织《饮用水水质标准》规定,必须严格控制水中氰化物的含量,含有氰化物的废水要经过处理才能排放。采用生物法降解氰化物是减轻水中氰化物污染的有效途径之一。自然界中对氰化物有降解能力的微生物约有50种,它们能产生氰(腈)水合酶和氰(腈)水解酶等,最终将氰化物中的C和N转变为CO2和NH3。
(1)欲从水体中分离出能够降解氰化物的微生物,首先应制备两种培养基,一种是牛肉膏蛋白胨培养基,另一种是以 作为唯一氮源的选择培养基。然后将两种培养基倒平板,设置如下表所示的对照组和实验组:
对照组①②分别为 。若对照组的平板上没有菌落生长,说明培养基在使用前未被杂菌污染;若实验组③平板上的菌落数显著多于同一稀释度的④平板上的菌落数,说明 。
(2)用稀释涂布平板法计数能够降解氰化物的微生物时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是 。计数时,同一个稀释浓度下应至少对 个平板进行重复计数。若某同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的菌液0.1 mL,培养后菌落数分别为155、160、176、149个,则每毫升原菌液中上述目的菌的数量约为 个。经实验统计出的菌落数往往比活菌的实际数目少,原因是 。实验结束后,使用过的培养基应进行 处理才能倒掉,以防造成环境污染。 (3)脱除污水中氰化物的方法有多种,目前采用较多的是化学氧化法,但该处理过程中易产生毒性比HCN更大的挥发性气体CNCl。与化学氧化法相比,生物降解法具有更好的应用前景,原因是 。
答案 (1)氰化物 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和未接种的选择培养基平板 选择培养基具有选择作用 (2)平板上的一个菌落一般来源于稀释液中的一个活菌 3 1.6×109 当两个或多个细胞形成的菌落连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 灭菌 (3)生物降解法能将氰化物彻底分解成CO2和NH3等产物,比化学方法更安全
解析 (1)欲从水体中分离出能够降解氰化物的微生物,首先应制备2种培养基,一种是牛肉膏蛋白胨培养基,另一种是以氰化物作为唯一氮源的选择培养基。然后将2种培养基倒平板,设置对照组是为了说明培养基是否合格,因此,对照组①②分别为未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和未接种的选择培养基平板,若相同的时间内,对照组培养基上无菌落出现,则说明实验组的数据具有说服力,④的处理是接种了等量菌种的选择培养基(以氰化物作为唯一氮源的选择培养基);若实验组③平板上的菌落数显著多于同一稀释度的④平板上的菌落数,说明选择培养基具有选择作用。
(2)用稀释涂布平板法计数能够降解氰化物的微生物时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,因为当稀释倍数足够高时,就可以在平板上获得由一个活菌长成的菌落,因此,此时的菌落数可代表稀释液中的活菌数。计数时,同一个稀释浓度下应至少对3个平板进行重复计数,然后求平均值,这样可以减小实验误差。若某同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的菌液0.1 mL,培养后菌落数分别为155、160、176、149个,则每毫升原菌液中目的菌的数量为(155+160+176+149)÷4÷0.1×106= 1.6×109(个)。培养时,两个或多个细胞形成的菌落连在一起时会形成一个菌落,因此统计的菌落数往往比活菌少。实验结束后,使用过的培养基应灭菌处理才能倒掉,这样可避免微生物对环境造成污染。
(3)脱除污水中氰化物的方法有多种,目前采用较多的是化学氧化法,但该处理过程中易产生毒性比HCN更大的挥发性气体CNCl。而对氰化物有降解能力的微生物能产生氰(腈)水合酶和氰(腈)水解酶等,在这些酶的催化下,最终将氰化物中的C和N转变为CO2和NH3,CO2和NH3可被植物吸收利用,不会造成污染,因此,与化学氧化法相比,生物降解法具有更好的应用前景。
考向3土壤中分解尿素的细菌的分离与计数3.(2022河南月考)尿素适用于作基肥和追肥,有时也用作种肥,因为不能被土壤吸附,易随水流失,所以使用时需要深施覆土,但经微生物分解后能更好地被植物利用。科研人员设计实验从土壤微生物中筛选出能分解尿素的微生物,并成功筛选到能高效分解尿素的尿素分解菌。请回答下列问题。(1)科研人员在筛选尿素分解菌时,应选择 (填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”)作为氮源,不选择其他两组的原因是 。
(2)科研人员从经常使用尿素的农田中取得土样制成土壤悬液,并用蒸馏水定容到100 mL。具体操作过程如图1所示。
①图1中,通常接种到每一个培养基上的菌液量不超过 mL。在接种后用涂布器涂布之前,需先将沾有少量酒精的涂布器放在 ,待酒精燃尽后,冷却8~10 s。 ②若某一稀释度的菌液接种的3个培养皿中菌落数分别为23个、40个、86个,则出现这种结果的可能原因是 。若接种了某一稀释度菌液的一个平板经培养后,菌落分布如图2所示,则出现这种现象的可能原因是 。 (3)初步筛选出来的菌种还需要进一步的鉴定,具体的鉴定方法是:在培养基中加入 指示剂,并接种初步筛选的菌种,培养一段时间,若指示剂变成 色,则可说明该菌种能够分解尿素。
答案 (1)尿素 其他两组都含有NH4NO3,能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3,不能起到筛选作用(2)①0.1 酒精灯火焰上引燃 ②吸取菌液进行涂布之前没有振荡;吸取菌液时的位置不同 涂布不均匀(3)酚红 红解析 (1)尿素分解菌可合成脲酶分解尿素,从中获得氮源,而不能利用尿素的微生物在只含尿素为唯一氮源的培养基上不能生长,所以在筛选尿素分解菌时,应选择尿素为唯一氮源。其他两组都含有NH4NO3,能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3,不能起到筛选作用。
(2)①图1为稀释涂布平板法,通常接种到每一个培养基上的菌液量不超过0.1 mL。在接种后用涂布器涂布之前,需先将沾有少量酒精的涂布器放在酒精灯火焰上引燃,目的是杀菌,防止外来微生物的污染,待酒精燃尽后,冷却8~10 s。②若某一稀释度的菌液接种的3个培养皿中菌落数分别为23个、40个、86个,则出现这种结果的可能原因是吸取菌液进行涂布之前没有振荡;吸取菌液时的位置不同,导致菌体分布不均匀。图2中菌体分布不均匀,可能是涂布不均匀。(3)根据分析可知,尿素分解菌的鉴定需要在培养基中加入酚红指示剂;细菌合成的脲酶可以将尿素分解为氨,导致pH升高,指示剂变为红色。故鉴定尿素分解菌的方法为:在培养基中加入酚红指示剂,并接种初步筛选的菌种,培养一段时间,若指示剂变成红色,则可说明该菌种能够分解尿素。
考向4微生物的其他分离、计数方法4.(不定项选择)某学者利用“影印培养法”研究大肠杆菌抗链霉素性状产生的原因,先将原始菌种接种到1号培养基上,培养出菌落后,将灭菌绒布在1号上印模,绒布沾上菌落并进行转印,使绒布上的菌落按照原位接种到2号和3号培养基上。待3号上长出菌落后,在2号上找到对应的菌落,然后接种到不含链霉素的4号培养液中,培养后再接种到5号培养基上,并重复以上操作。实验过程如下图所示。
下列相关叙述正确的是( )A.大肠杆菌抗链霉素的突变是发生在与链霉素接触之前B.1号和5号采用平板划线法将菌种接种在相应选择培养基上C.4号和8号培养液中,大肠杆菌抗链霉素菌株的比例逐渐增大D.该实验缺乏对照实验,无法确定抗链霉素性状属于可遗传变异
答案 AC 解析 大肠杆菌是原核生物,其可遗传变异只有基因突变,大肠杆菌抗链霉素的性状是由基因突变引起的,该突变发生在与链霉素接触之前,链霉素是对其起选择作用,A项正确;1号和5号采用稀释涂布平板法将菌种接种在相应选择培养基上,B项错误;3号与2号、7号与6号培养基中的菌落数的比值,是抗性菌落占全部菌落的比例,观察实验结果可知,4号与8号培养液中,抗链霉素菌株的比例在逐渐增大,C项正确;本实验有对照实验,无链霉素的培养基作为对照,可以确定抗链霉素性状属于可遗传的变异,D项错误。
方法突破选择培养基的应用举例
微生物筛选实例分析知识必备在生产和生活中,需要优良的菌种生产发酵食品或分解废物垃圾等,而获取途径往往从环境中筛选和鉴别优良菌种。微生物的筛选与鉴别方法如下。1.微生物的筛选方法
2.微生物的鉴别方法
3.选择培养基4种常见制备方法或实例(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
专项突破典例.(2020全国Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解,会对环境造成污染,只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基,甲的组分为无机盐、水和S,乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题。(1)实验时,盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、 乙培养基均属于 培养基。 (2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL,若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液,且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个,则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。 (3)在步骤⑤的筛选过程中,发现当培养基中的S超过某一浓度时, 某菌株对S的降解量反而下降,其原因可能是 (答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数,请写出主要实验步骤: 。 (5)上述实验中,甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同,但都能为细菌的生长提供4类营养物质,即 。
答案 (1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择 (2)104 (3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长 (4)取淤泥加入无菌水中,涂布(或稀释涂布)到乙培养基上,培养后计数 (5)水、碳源、氮源和无机盐解析 本题主要考查微生物的培养、筛选与计数的相关知识,旨在考查考生对微生物相关基础知识及应用的理解能力。(1)培养基的灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法。由图可知,乙培养基用来挑选单菌落,菌种分离培养所用的培养基为固体培养基,因此需要添加凝固剂——琼脂。甲、乙两培养基都起筛选作用,因此甲、乙培养基都属于选择培养基。(2)根据1 mL=1 000 μL,可将100 μL转化为0.1 mL,设菌液的稀释倍数为x倍,可得(2×107/x)×0.1≤200,解得x≥104。
(3)当培养基中的S超过某一浓度时,某菌株对S的降解量反而下降,说明该浓度的S抑制菌株的正常生命活动,导致菌株对S的降解量下降。(4)对微生物进行计数时,一般将菌液稀释后涂布到固体培养基上,培养后进行计数。测定淤泥中能降解S的细菌细胞数时,应取淤泥加入无菌水中,然后涂布(或稀释涂布)到乙培养基上,培养后计数。(5)不同微生物的培养基的配方不完全相同,但一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐。
专项训练1.营养缺陷型菌株是指缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素)的能力,必须在基本培养基中补充特殊营养物质才能正常生长的一类菌株,可自然产生或人工诱导获得。用一定方法诱变大肠杆菌并将其接种到甲培养皿上,一段时间后将菌落影印接种(不改变菌落位置)到乙、丙两培养皿中,进一步培养一段时间可筛选出营养缺陷型菌株,结果如下图所示。
下列说法正确的是( )A.将大肠杆菌接种到甲培养皿的方法为平板划线法B.甲、丙两种培养基中均添加了特殊营养物质C.乙培养皿中能生长的为所需的营养缺陷型菌株D.甲中的部分大肠杆菌发生了基因突变或染色体变异
答案 B 解析 由菌落的分布情况可知,将大肠杆菌接种到甲培养皿的方法为稀释涂布平板法,A项错误;根据甲、丙两种培养基中菌落位置可知,甲中的菌种在丙培养基中均能生长,再结合乙培养基中菌落的生长情况,可推测甲培养基和丙培养基都添加了某种特殊营养物质,B项正确;乙培养皿中不能生长的为所需的营养缺陷型菌株,C项错误;甲中的部分大肠杆菌发生了基因突变,不可能发生染色体变异,因为大肠杆菌不含染色体,D项错误。
2.“纸片扩散法”测定病原菌对抗生素敏感性的实验是在某病原菌均匀分布的平板上,铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养。右图示为某测定实验的结果,其中抑菌圈是在纸片周围出现的透明区域。下列叙述正确的是( )A.在图示固体培养基上可用平板划线法接种病原菌B.形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感C.未出现抑菌圈可能是病原菌与抗生素接触后发生抗性变异D.“纸片扩散法”实验中的自变量是不同种的抗生素
答案 D 解析 根据题干“某病原菌均匀分布的平板上”可知,图示固体培养基上采用的接种方法是稀释涂布平板法,A项错误;形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物敏感程度较低,B项错误;未出现抑菌圈可能是病原菌对该抗生素不敏感,C项错误;根据题干“铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养”判断,“纸片扩散法”实验中的自变量是不同种的抗生素,D项正确。
3.(2022重庆模拟)随着人们生活质量的提高,餐饮含油脂废水的排放量大量增加,合理处置油脂废水也成为新的课题。已知芽孢杆菌中有多种分解油脂并产酸的菌种,科研人员欲采用下列流程筛选出能高效分解油脂的微生物。菌种取样→分离培养→菌株的筛选→形态特征观察和生理生化反应鉴定。请回答下列问题。(1)选取饭店附近排污渠的含油脂废水为样本,采样约0.2 mL,立即装于试管内,此试管使用前需要经过 处理。 (2)样品分离培养前,一般需要将菌液进行 处理,然后吸取0.2 mL菌液涂布到营养琼脂培养基平板上,置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h,记录菌落总数。将分离出的菌株按照菌落 (至少答3点)等表观特征初步分类。
(3)上述步骤筛选的菌株分别接种到含“花生油”的琼脂培养基中,37 ℃恒温培养箱中培养24 h,筛选出油脂降解菌,培养基中“花生油”主要为菌种繁殖提供 。在该培养基还需加入中性红染料(中性红为脂溶性染料,遇酸为红色,遇碱为黄色),挑选菌株要挑选显 降解圈的菌株,并且选颜色较 (填“深”或“浅”)的为宜。 (4)实际操作中,由于油脂易聚集成液滴,常在培养基中加入2~3滴乳化剂使油脂分散均匀,鉴定效果更好,试分析原因。
一、微生物的基本培养技术1.培养基(1)概念:人们按照微生物对 的不同需求,配制出的供其 的营养基质。 (2)培养基的种类、特点及用途分析①按物理状态分类
微生物分离、鉴定,活菌计数
从众多微生物中分离所需的微生物
(3)培养基营养成分的含义、作用、主要来源分析
2.无菌技术(1)目的:获得纯净培养物。(2)关键:防止外来杂菌的入侵。(3)常用方法:灭菌和消毒。 杀灭所有微生物
3.微生物的纯培养(1)微生物纯培养的操作步骤
(2)倒平板操作方法①倒平板操作流程: 。 ②乙中的灭菌方法是 。 ③丁操作需要等待 后才能进行。
(3)倒平板操作的注意事项
(4)平板划线法操作步骤
(5)平板划线操作的注意事项
旁栏边角1.(选择性必修3,第10页,旁栏思考)为什么培养基需要氮源?
2.(选择性必修3,第10页,旁栏思考)无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还有什么作用?
提示 微生物细胞内有蛋白质、核酸、磷脂等多种含氮的营养物质或代谢产物,培养基中的氮源可以作为合成这些营养物质及代谢产物的原料。
提示 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
易错辨析基于对微生物的基本培养技术的理解,判断下列表述是否正确。(1)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物,又减少消毒剂对细胞的伤害。( )(2)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。( )(3)倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。( )(4)平板划线法中每一次划线前要将接种环灼烧。( )(5)配制培养基时应先灭菌再调pH。( )(6)为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。( )
二、微生物的选择培养和计数1.筛选菌株(1)寻找目的菌株的方法:根据 ,到相应的环境中去寻找。 (2)实验室中微生物的筛选①原理:人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。②选择培养基:在生物学中,允许特定类型的微生物生长,同时 的培养基。
微生物对生存环境的要求
抑制或阻止其他种类微生物生长
2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释后,将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面,进行培养。(1)系列稀释操作,移液管需要经过灭菌。操作时,试管口和移液管应离火焰1~2 cm处。操作过程如下:
(3)培养:待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板 ,放入30~37 ℃的 中培养1~2 d。 (4)稀释涂布平板法计数的4个注意事项
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作(1)实验原理
(3)统计细菌数目的方法①显微镜直接计数法 较实际值偏高
②间接计数法——活菌计数法 较实际值偏低原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(4)实验结果分析与评价
旁栏边角1.(选择性必修3,第12页,“探究·实践”改编)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法?
提示 由于在所划的线中,一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落,而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成,而在计数时一个菌落对应着一个细菌,这样在划线所得的平板中,菌落数目远低于活菌的实际数值,所以不能用平板划线法测定活菌数量。
2.(选择性必修3,第30页,“复习与提高”改编)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图。(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么?
提示 获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法,获得图B效果的接种方法为平板划线法。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是什么?应当怎样操作才可避免此种现象?
提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌;采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
易错辨析基于对微生物的选择培养和计数的理解,判断下列表述是否正确。(1)对细菌进行计数能采用稀释涂布平板法,也能用平板划线法。( )(2)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中,尿素是唯一的氮源。( )(3)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的酸碱度降低。( )(4)刚果红可以与纤维素形成透明复合物,所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。( )(5)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中,选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度。( )
考向探究考向1培养基的配制1.(2022四川南充二模)甲、乙、丙是3种微生物,下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的3种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖;甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,而乙和丙都不能;乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,甲、丙都不能。注:“+”表示培养基中加入了这种物质,“-”表示培养基中没有加入这种物质。
下列说法正确的是( )A.甲、乙、丙都是异养型微生物B.甲、乙都是自养型微生物,丙是异养型微生物C.甲是异养型微生物,乙是固氮微生物,丙是自养型微生物D.甲是固氮微生物,乙是自养型微生物,丙是异养型微生物
答案 D 解析 根据题意可知,甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,而乙和丙都不能,而Ⅰ培养基缺少氮源,说明甲能够固氮,属于固氮微生物;乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,而甲和丙都不能,Ⅱ培养基中没有有机碳源,说明乙能够合成有机物,属于自养型微生物;而丙不能在Ⅰ培养基中生长,说明其不能固氮,又不能在Ⅱ培养基中生长,说明其不能合成有机物,只能在Ⅲ培养基中生长,说明丙属于异养型微生物。
考向2无菌技术2.下列关于微生物实验操作的叙述,错误的是( )A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌B.接种前后,接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧C.接种后的培养皿要倒置,以防培养污染D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
答案 A 解析 接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理,接种环等常用灼烧灭菌法处理,吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理,培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理,A项错误;为了防止杂菌污染,每次接种前后,接种环都要进行灼烧灭菌,B项正确;接种后,培养皿需要倒置,以防皿盖上水珠落入培养基造成污染,C项正确;分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法,后者还可以用于微生物的计数,所用培养基为固体培养基,D项正确。
考向3微生物的纯培养3.(2022山东济南一模)随着石油危机的出现,乙醇作为可再生资源中比较理想的液态燃料正受到人们越来越多的关注。自然界中可再生的木质纤维素资源极为丰富,其主要成分之一是半纤维素。半纤维素容易被酸或者酶水解,其水解产物中的85%~90%为木糖。因此利用木糖发酵生产乙醇具有重要的应用研究价值。酵母菌是传统的乙醇生产菌株,因其缺乏转化木糖的酶系而不能很好地利用木糖。自然界中某些酿酒酵母能利用木糖进行酒精发酵,某研究小组欲从土壤中分离这种酵母菌并对产酶活性进行测定,实验基本流程为:取土样→制取土壤悬液→扩大培养→选择培养→菌种分离→酶活性鉴定。
请回答下列问题。(1)扩大培养又称富集培养,可增加 ,以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。 (2)分离纯化微生物的关键是 。该研究小组将扩大培养后的混合菌液适当稀释后接种于 的选择培养基,倒置放入培养箱培养。常用的接种方法有 两种。若划线的某个平板培养后,第一划线区域的划线上都长满了菌落,第二划线区域的第一条线上无菌落,其他划线上有菌落。第二划线区城的第一条线上无菌落的原因是 。
(3)为进一步确定目的菌株的最佳产酶条件,该研究小组选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量4个因素实验。其中,培养基初始pH、培养温度会影响菌株产酶主要是因为 ;摇床转速因影响 进而影响菌株产酶。
答案 (1)目的菌株数量 (2)逐渐将聚集的菌体分散,以得到由单个细胞增殖而形成的单个菌落 以木糖为唯一碳源 平板划线法和稀释涂布平板法 接种环灼烧灭菌后未冷却即进行划线操作、未从上次划线末端开始划线(3)培养基初始pH、培养温度会影响酶活性 溶氧量、菌种与营养物质的接触
解析 (1)扩大培养又称富集培养,其目的是增加目的菌株数量,以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。(2)分离纯化微生物的关键是逐渐将聚集的菌体分散,以得到由单个细胞增殖而形成的单个菌落。为了分离这种能利用木糖进行酒精发酵的酵母菌,将扩大培养后的混合菌液适当稀释后接种于以木糖为唯一碳源的选择培养基,倒置放入培养箱培养。常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法2种。在平板划线的过程中,若接种环灼烧灭菌后未冷却即进行划线操作或未从上次划线末端开始划线等会导致第二划线区域的第一条线上无菌落。(3)选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量4个因素进行实验进一步确定目的菌株的最佳产酶条件:主要是因为培养基初始pH、培养温度会影响酶活性从而会影响菌株产酶;而摇床转速因影响溶氧量、菌种与营养物质的接触进而影响菌株产酶。
考向4分离微生物的方法4.(2022广东惠州三模)敌敌畏是一种有机磷农药,使用后残留严重且难以降解,对环境造成危害。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解敌敌畏的细菌(目标菌),具体流程如下图所示。
(1)研究人员应从 中采集土样,取土样用的小铁铲和盛土用的信封在使用前都要 。 (2)称取5 g土壤样品,加入装有45 mL无菌生理盐水的锥形瓶中,振荡培养制成菌悬液,吸取1 mL菌悬液加入含有9 mL无菌生理盐水的试管中,制成稀释 倍的菌悬液,按此方法依次系列稀释;取0.1 mL各浓度梯度的菌悬液分别接种到固体培养基上,该接种方法为 。 (3)由流程图可推测“目标菌”的呼吸类型为 ;培养微生物的锥形瓶及保藏菌种的试管均使用到棉塞,推测棉塞的作用为 。 (4)分离纯化后的微生物最初不一定具有降解敌敌畏的能力,所以要对菌株进行驯化,使其具有较高的速率来降解目标农药敌敌畏,从而筛选出耐药菌株。驯化的实质是在特定条件下,将耐药的微生物定向富集的过程。请你结合题意,简述驯化的实施方案: 。
答案 (1)长期喷洒敌敌畏农药的农田 灭菌 (2)100 稀释涂布平板法 (3)有氧呼吸 阻止外界微生物进入造成污染、保持一定的通气性 (4)配制好固体培养基,加入较大剂量(或浓度)的敌敌畏农药,将分离纯化得到的菌株接种在此平板上培养解析 (1)根据生物与环境相适应的特点,欲从土壤中筛选出能降解敌敌畏的细菌,应从长期喷洒敌敌畏农药的农田中采集土样,取土样用的小铁铲和盛土用的信封在使用前都要灭菌,以避免杂菌污染。
(2)称取5 g土壤样品,加入装有45 mL无菌生理盐水的锥形瓶中,样品被稀释了10倍,振荡培养制成菌悬液,吸取1 mL菌悬液加入含有9 mL无菌生理盐水的试管中,样品又被稀释了10倍,制成共稀释100倍的菌悬液,按此方法依次系列稀释;取0.1 mL各浓度梯度的菌悬液分别接种到固体培养基上,可得到分布均匀的菌落,该接种方法为稀释涂布平板法。(3)振荡培养可增加培养液中氧气含量,由此可推测“目标菌”的呼吸类型为有氧呼吸;培养微生物的锥形瓶及保藏菌种的试管均使用到棉塞,棉塞可阻止外界微生物进入造成污染,同时保持一定的通气性。(4)分离纯化后的微生物最初不一定具有降解敌敌畏的能力,故对菌株进行驯化,使其具有较高的速率来降解目标农药敌敌畏,可配制好固体培养基,加入较大剂量(或浓度)的敌敌畏农药,将分离纯化得到的菌株接种在此平板上培养。
方法突破1.“碳源”与“自养生物”“异养生物”的辨析(1)自养型微生物与异养型微生物的划分主要依据是能否以CO2作为碳源。需根据微生物的代谢特点去选择相应的培养基。如自养型微生物可以利用空气中的CO2,缺碳培养基可以培养自养型微生物。(2)自养型微生物所需的碳源来自含碳的无机物,而异养型微生物需要的碳源来自有机物,因此可根据培养基中的营养物质判断微生物的代谢类型。含氮无机物不但能给自养型微生物提供氮源,也能作为能源物质提供能量,如NH3既为硝化细菌提供氮源,也可作为能源物质。
2.消毒、灭菌的方法及适用对象(1)消毒方法及适用对象
(2)灭菌方法及适用对象
3.鉴别培养基的举例
考向探究考向1选择培养基1.(2022四川成都外国语学校模拟)莠去津是一种含氮农药,在土壤中不易被降解,为修复被其污染的土壤,可按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。已知莠去津在水中溶解度低,含过量莠去津的固体培养基不透明。请据下图回答下列问题。
(1)由图推断,从A瓶到C瓶液体培养的过程称为 。图中固体培养基比培养瓶中的培养基多添加了 作为凝固剂,从功能上讲,这两种培养基都属于 培养基。 (2)在将C瓶菌种接种到固体培养基之前通常要进行 。图中将菌种接种到固体培养基的方法是 ,对所用接种工具常采用的灭菌方法是 。 (3)一段时间后,培养基出现无透明带和有透明带两种菌落,我们筛选的目的菌是 (填“有透明带”或“无透明带”)菌落中的细菌,该菌落生长所需的氮元素主要来源于 。
答案 (1)选择培养 琼脂 选择 (2)梯度稀释 稀释涂布平板法 灼烧灭菌 (3)有透明带 莠去津
解析 (1)通过题图可以看出A瓶到C瓶中的培养液中除莠去津外没有其他氮源,而本实验的目的是选择降解莠去津的细菌,所以该过程是通过选择培养基选择能够降解莠去津的细菌。通常情况下,固体培养基比液体培养基中多加入的凝固剂是琼脂。从功能上讲,这两种培养基目的都是筛选出能降解莠去津的细菌,都属于选择培养基。(2)从培养液中选取细菌进行涂布培养,如果直接进行接种,培养基中的菌落将会很密,无法进行纯化,通过梯度稀释后再接种,培养基中菌落将会分开,这时就可以进行纯化和分离了。通过培养基上的菌落分布特征可以判断接种方式为稀释涂布平板法。涂布平板操作所用的接种工具是涂布器,常用灼烧灭菌法对涂布器进行灭菌。(3)莠去津在水中溶解度低,含过量莠去津的固体培养基是不透明的,能够降解培养基中的莠去津的菌落周围会形成透明带,所以选择的目的菌是有透明带菌落中的细菌,即该菌落生长所需的氮元素主要来源于莠去津。
考向2稀释涂布平板法2.(2022山东威海期末)氰化物是指含有CN基团的化合物,许多氰化物有剧毒,极少量就会使生物在短时间内中毒死亡。世界卫生组织《饮用水水质标准》规定,必须严格控制水中氰化物的含量,含有氰化物的废水要经过处理才能排放。采用生物法降解氰化物是减轻水中氰化物污染的有效途径之一。自然界中对氰化物有降解能力的微生物约有50种,它们能产生氰(腈)水合酶和氰(腈)水解酶等,最终将氰化物中的C和N转变为CO2和NH3。
(1)欲从水体中分离出能够降解氰化物的微生物,首先应制备两种培养基,一种是牛肉膏蛋白胨培养基,另一种是以 作为唯一氮源的选择培养基。然后将两种培养基倒平板,设置如下表所示的对照组和实验组:
对照组①②分别为 。若对照组的平板上没有菌落生长,说明培养基在使用前未被杂菌污染;若实验组③平板上的菌落数显著多于同一稀释度的④平板上的菌落数,说明 。
(2)用稀释涂布平板法计数能够降解氰化物的微生物时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是 。计数时,同一个稀释浓度下应至少对 个平板进行重复计数。若某同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的菌液0.1 mL,培养后菌落数分别为155、160、176、149个,则每毫升原菌液中上述目的菌的数量约为 个。经实验统计出的菌落数往往比活菌的实际数目少,原因是 。实验结束后,使用过的培养基应进行 处理才能倒掉,以防造成环境污染。 (3)脱除污水中氰化物的方法有多种,目前采用较多的是化学氧化法,但该处理过程中易产生毒性比HCN更大的挥发性气体CNCl。与化学氧化法相比,生物降解法具有更好的应用前景,原因是 。
答案 (1)氰化物 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和未接种的选择培养基平板 选择培养基具有选择作用 (2)平板上的一个菌落一般来源于稀释液中的一个活菌 3 1.6×109 当两个或多个细胞形成的菌落连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 灭菌 (3)生物降解法能将氰化物彻底分解成CO2和NH3等产物,比化学方法更安全
解析 (1)欲从水体中分离出能够降解氰化物的微生物,首先应制备2种培养基,一种是牛肉膏蛋白胨培养基,另一种是以氰化物作为唯一氮源的选择培养基。然后将2种培养基倒平板,设置对照组是为了说明培养基是否合格,因此,对照组①②分别为未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和未接种的选择培养基平板,若相同的时间内,对照组培养基上无菌落出现,则说明实验组的数据具有说服力,④的处理是接种了等量菌种的选择培养基(以氰化物作为唯一氮源的选择培养基);若实验组③平板上的菌落数显著多于同一稀释度的④平板上的菌落数,说明选择培养基具有选择作用。
(2)用稀释涂布平板法计数能够降解氰化物的微生物时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,因为当稀释倍数足够高时,就可以在平板上获得由一个活菌长成的菌落,因此,此时的菌落数可代表稀释液中的活菌数。计数时,同一个稀释浓度下应至少对3个平板进行重复计数,然后求平均值,这样可以减小实验误差。若某同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的菌液0.1 mL,培养后菌落数分别为155、160、176、149个,则每毫升原菌液中目的菌的数量为(155+160+176+149)÷4÷0.1×106= 1.6×109(个)。培养时,两个或多个细胞形成的菌落连在一起时会形成一个菌落,因此统计的菌落数往往比活菌少。实验结束后,使用过的培养基应灭菌处理才能倒掉,这样可避免微生物对环境造成污染。
(3)脱除污水中氰化物的方法有多种,目前采用较多的是化学氧化法,但该处理过程中易产生毒性比HCN更大的挥发性气体CNCl。而对氰化物有降解能力的微生物能产生氰(腈)水合酶和氰(腈)水解酶等,在这些酶的催化下,最终将氰化物中的C和N转变为CO2和NH3,CO2和NH3可被植物吸收利用,不会造成污染,因此,与化学氧化法相比,生物降解法具有更好的应用前景。
考向3土壤中分解尿素的细菌的分离与计数3.(2022河南月考)尿素适用于作基肥和追肥,有时也用作种肥,因为不能被土壤吸附,易随水流失,所以使用时需要深施覆土,但经微生物分解后能更好地被植物利用。科研人员设计实验从土壤微生物中筛选出能分解尿素的微生物,并成功筛选到能高效分解尿素的尿素分解菌。请回答下列问题。(1)科研人员在筛选尿素分解菌时,应选择 (填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”)作为氮源,不选择其他两组的原因是 。
(2)科研人员从经常使用尿素的农田中取得土样制成土壤悬液,并用蒸馏水定容到100 mL。具体操作过程如图1所示。
①图1中,通常接种到每一个培养基上的菌液量不超过 mL。在接种后用涂布器涂布之前,需先将沾有少量酒精的涂布器放在 ,待酒精燃尽后,冷却8~10 s。 ②若某一稀释度的菌液接种的3个培养皿中菌落数分别为23个、40个、86个,则出现这种结果的可能原因是 。若接种了某一稀释度菌液的一个平板经培养后,菌落分布如图2所示,则出现这种现象的可能原因是 。 (3)初步筛选出来的菌种还需要进一步的鉴定,具体的鉴定方法是:在培养基中加入 指示剂,并接种初步筛选的菌种,培养一段时间,若指示剂变成 色,则可说明该菌种能够分解尿素。
答案 (1)尿素 其他两组都含有NH4NO3,能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3,不能起到筛选作用(2)①0.1 酒精灯火焰上引燃 ②吸取菌液进行涂布之前没有振荡;吸取菌液时的位置不同 涂布不均匀(3)酚红 红解析 (1)尿素分解菌可合成脲酶分解尿素,从中获得氮源,而不能利用尿素的微生物在只含尿素为唯一氮源的培养基上不能生长,所以在筛选尿素分解菌时,应选择尿素为唯一氮源。其他两组都含有NH4NO3,能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3,不能起到筛选作用。
(2)①图1为稀释涂布平板法,通常接种到每一个培养基上的菌液量不超过0.1 mL。在接种后用涂布器涂布之前,需先将沾有少量酒精的涂布器放在酒精灯火焰上引燃,目的是杀菌,防止外来微生物的污染,待酒精燃尽后,冷却8~10 s。②若某一稀释度的菌液接种的3个培养皿中菌落数分别为23个、40个、86个,则出现这种结果的可能原因是吸取菌液进行涂布之前没有振荡;吸取菌液时的位置不同,导致菌体分布不均匀。图2中菌体分布不均匀,可能是涂布不均匀。(3)根据分析可知,尿素分解菌的鉴定需要在培养基中加入酚红指示剂;细菌合成的脲酶可以将尿素分解为氨,导致pH升高,指示剂变为红色。故鉴定尿素分解菌的方法为:在培养基中加入酚红指示剂,并接种初步筛选的菌种,培养一段时间,若指示剂变成红色,则可说明该菌种能够分解尿素。
考向4微生物的其他分离、计数方法4.(不定项选择)某学者利用“影印培养法”研究大肠杆菌抗链霉素性状产生的原因,先将原始菌种接种到1号培养基上,培养出菌落后,将灭菌绒布在1号上印模,绒布沾上菌落并进行转印,使绒布上的菌落按照原位接种到2号和3号培养基上。待3号上长出菌落后,在2号上找到对应的菌落,然后接种到不含链霉素的4号培养液中,培养后再接种到5号培养基上,并重复以上操作。实验过程如下图所示。
下列相关叙述正确的是( )A.大肠杆菌抗链霉素的突变是发生在与链霉素接触之前B.1号和5号采用平板划线法将菌种接种在相应选择培养基上C.4号和8号培养液中,大肠杆菌抗链霉素菌株的比例逐渐增大D.该实验缺乏对照实验,无法确定抗链霉素性状属于可遗传变异
答案 AC 解析 大肠杆菌是原核生物,其可遗传变异只有基因突变,大肠杆菌抗链霉素的性状是由基因突变引起的,该突变发生在与链霉素接触之前,链霉素是对其起选择作用,A项正确;1号和5号采用稀释涂布平板法将菌种接种在相应选择培养基上,B项错误;3号与2号、7号与6号培养基中的菌落数的比值,是抗性菌落占全部菌落的比例,观察实验结果可知,4号与8号培养液中,抗链霉素菌株的比例在逐渐增大,C项正确;本实验有对照实验,无链霉素的培养基作为对照,可以确定抗链霉素性状属于可遗传的变异,D项错误。
方法突破选择培养基的应用举例
微生物筛选实例分析知识必备在生产和生活中,需要优良的菌种生产发酵食品或分解废物垃圾等,而获取途径往往从环境中筛选和鉴别优良菌种。微生物的筛选与鉴别方法如下。1.微生物的筛选方法
2.微生物的鉴别方法
3.选择培养基4种常见制备方法或实例(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
专项突破典例.(2020全国Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解,会对环境造成污染,只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基,甲的组分为无机盐、水和S,乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题。(1)实验时,盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、 乙培养基均属于 培养基。 (2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL,若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液,且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个,则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。 (3)在步骤⑤的筛选过程中,发现当培养基中的S超过某一浓度时, 某菌株对S的降解量反而下降,其原因可能是 (答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数,请写出主要实验步骤: 。 (5)上述实验中,甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同,但都能为细菌的生长提供4类营养物质,即 。
答案 (1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择 (2)104 (3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长 (4)取淤泥加入无菌水中,涂布(或稀释涂布)到乙培养基上,培养后计数 (5)水、碳源、氮源和无机盐解析 本题主要考查微生物的培养、筛选与计数的相关知识,旨在考查考生对微生物相关基础知识及应用的理解能力。(1)培养基的灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法。由图可知,乙培养基用来挑选单菌落,菌种分离培养所用的培养基为固体培养基,因此需要添加凝固剂——琼脂。甲、乙两培养基都起筛选作用,因此甲、乙培养基都属于选择培养基。(2)根据1 mL=1 000 μL,可将100 μL转化为0.1 mL,设菌液的稀释倍数为x倍,可得(2×107/x)×0.1≤200,解得x≥104。
(3)当培养基中的S超过某一浓度时,某菌株对S的降解量反而下降,说明该浓度的S抑制菌株的正常生命活动,导致菌株对S的降解量下降。(4)对微生物进行计数时,一般将菌液稀释后涂布到固体培养基上,培养后进行计数。测定淤泥中能降解S的细菌细胞数时,应取淤泥加入无菌水中,然后涂布(或稀释涂布)到乙培养基上,培养后计数。(5)不同微生物的培养基的配方不完全相同,但一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐。
专项训练1.营养缺陷型菌株是指缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素)的能力,必须在基本培养基中补充特殊营养物质才能正常生长的一类菌株,可自然产生或人工诱导获得。用一定方法诱变大肠杆菌并将其接种到甲培养皿上,一段时间后将菌落影印接种(不改变菌落位置)到乙、丙两培养皿中,进一步培养一段时间可筛选出营养缺陷型菌株,结果如下图所示。
下列说法正确的是( )A.将大肠杆菌接种到甲培养皿的方法为平板划线法B.甲、丙两种培养基中均添加了特殊营养物质C.乙培养皿中能生长的为所需的营养缺陷型菌株D.甲中的部分大肠杆菌发生了基因突变或染色体变异
答案 B 解析 由菌落的分布情况可知,将大肠杆菌接种到甲培养皿的方法为稀释涂布平板法,A项错误;根据甲、丙两种培养基中菌落位置可知,甲中的菌种在丙培养基中均能生长,再结合乙培养基中菌落的生长情况,可推测甲培养基和丙培养基都添加了某种特殊营养物质,B项正确;乙培养皿中不能生长的为所需的营养缺陷型菌株,C项错误;甲中的部分大肠杆菌发生了基因突变,不可能发生染色体变异,因为大肠杆菌不含染色体,D项错误。
2.“纸片扩散法”测定病原菌对抗生素敏感性的实验是在某病原菌均匀分布的平板上,铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养。右图示为某测定实验的结果,其中抑菌圈是在纸片周围出现的透明区域。下列叙述正确的是( )A.在图示固体培养基上可用平板划线法接种病原菌B.形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感C.未出现抑菌圈可能是病原菌与抗生素接触后发生抗性变异D.“纸片扩散法”实验中的自变量是不同种的抗生素
答案 D 解析 根据题干“某病原菌均匀分布的平板上”可知,图示固体培养基上采用的接种方法是稀释涂布平板法,A项错误;形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物敏感程度较低,B项错误;未出现抑菌圈可能是病原菌对该抗生素不敏感,C项错误;根据题干“铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养”判断,“纸片扩散法”实验中的自变量是不同种的抗生素,D项正确。
3.(2022重庆模拟)随着人们生活质量的提高,餐饮含油脂废水的排放量大量增加,合理处置油脂废水也成为新的课题。已知芽孢杆菌中有多种分解油脂并产酸的菌种,科研人员欲采用下列流程筛选出能高效分解油脂的微生物。菌种取样→分离培养→菌株的筛选→形态特征观察和生理生化反应鉴定。请回答下列问题。(1)选取饭店附近排污渠的含油脂废水为样本,采样约0.2 mL,立即装于试管内,此试管使用前需要经过 处理。 (2)样品分离培养前,一般需要将菌液进行 处理,然后吸取0.2 mL菌液涂布到营养琼脂培养基平板上,置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h,记录菌落总数。将分离出的菌株按照菌落 (至少答3点)等表观特征初步分类。
(3)上述步骤筛选的菌株分别接种到含“花生油”的琼脂培养基中,37 ℃恒温培养箱中培养24 h,筛选出油脂降解菌,培养基中“花生油”主要为菌种繁殖提供 。在该培养基还需加入中性红染料(中性红为脂溶性染料,遇酸为红色,遇碱为黄色),挑选菌株要挑选显 降解圈的菌株,并且选颜色较 (填“深”或“浅”)的为宜。 (4)实际操作中,由于油脂易聚集成液滴,常在培养基中加入2~3滴乳化剂使油脂分散均匀,鉴定效果更好,试分析原因。
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