2025届生物高考 二轮复习 生物技术与工程 素养整合_诠释应用 课件

这是一份2025届生物高考 二轮复习 生物技术与工程 素养整合_诠释应用 课件，共25页。PPT课件主要包含了TA或CG，A或G，放射性同位素，048×106，TaqMan探针，扩增次数，病毒RNA初始数量等内容，欢迎下载使用。
素养　　科学思维与科学探究——PCR技术及应用
1.重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。这项技术目前主要有两个应用方向:基因定点突变;构建融合基因。
【例1】 重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术,其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(如图中的引物2和3,突起处代表与模板链不能互补的突变位点),分别进行PCR,获得有重叠链的两种DNA片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图所示。
(1)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为　　　 　　才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为　　　　　　(假设引物为单链DNA)。 
(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中,引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制,共产生____　　　　　种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为_________________________________________________________　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起,设计基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时,特别要注意的问题是_____________________________________________________________。 
引物2和3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用
M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
(1)基因定点突变,该技术要使用四种引物。考查内容可涉及与突变位点配对的引物设计情况、两个阶段引物的选择、扩增体系及产物等。解答此技术相关问题时可结合题图依据以下原则:引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此,分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
(2)构建融合基因,重叠延伸PCR还可以用于两个或两个以上异源基因DNA片段的拼接。引物上含有末端互补序列,通过PCR产生的两个DNA片段可通过引物延伸进行剪接和扩增,从而获得重组体,与定点突变不同的是待融合基因的PCR产物来自两个不同的基因,通过引物在两种PCR产物中产生互相重叠的链而获得融合基因。
2.反向PCR技术反向PCR技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
【例2】反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是(　　)
注:引物分别与临近的DNA链互补配对。
A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增B.设计的引物中G、C碱基含量越高,复性的温度越低C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶答案 A
当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术,反向PCR技术所依据的原理是:用限制性内切核酸酶切割该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。如下图所示:
3.不对称PCR正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物,那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫作不对称PCR。
【例3】(2024·山东临沂一模节选)研究人员常用DNA分子杂交技术检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上,检测时用　　 　　标记的目的基因单链片段作为探针。不对称PCR能够大量制备单链DNA片段,其基本原理是采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物,结果获得大量单链DNA(ss-DNA)。若反应体系中原有100个模板DNA,最初10个循环后限制性引物耗尽,再进行20个循环,理论上可制备ss-DNA　　　　　　　　　(用科学计数法表示),在这30个循环中ss-DNA的产生量主要受　　　 　　　　　　　　　　　的影响。 
限制性引物和非限制性引物的比例
不对称PCR主要只扩增一条模板链,实际操作时,为了增加模板量,也可以加入一对引物,只是两条引物在浓度上应存在差异。如此题经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物。此技术可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。
4.实时荧光定量RT-PCR实时荧光定量RT-PCR主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,实时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录。在RT-PCR中,通过逆转录酶将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。
【例4】“实时荧光定量RT-PCR”是一种用于实时扩增和检测特定DNA或RNA序列的分子生物学技术。TaqMan探针是实时荧光定量RT-PCR技术中一种常用探针(如图1),其5'端连接荧光基团(R),3'端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时,R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中,当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到,荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题。
(1)这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点,主要与试剂盒中的　　　　　　　、　　　　　　　　　　　有关。 (2)在实时荧光定量RT-PCR过程中,通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如图3)。最初数个循环里,荧光信号变化不大,设置为基线;之后进入指数扩增期,在这个时期设置一个荧光阈值线;Ct值是PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,则Ct值越小,起始模板量越　　　　　　　,从而实现对起始模板的相对定量分析。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a,则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与　　　　　　、　　　　 　　　　有关。 
荧光定量PCR可用于病毒核酸检测,其优点:早期诊断、灵敏度和特异性高,是判断是否感染某病毒的直接证据。基本原理是将病毒RNA逆转录为DNA,通过采用实时荧光定量RT-PCR技术进行检测,因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有逆转录酶、热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲剂等。试剂盒中的引物和TaqMan探针决定了这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和高灵敏性。结合图示可以看出,在PCR扩增过程中,Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R,因此,扩增次数越多,样品中病毒初始数量(病毒样品模板RNA含量)越多,则被水解的探针越多,释放出游离的R多,反应体系
中某时刻荧光信号强度(Rn)也越强。由图可知,随着PCR的进行,反应产物不断累积,“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链”不再增加,其原因最可能是试剂盒中原料、引物和探针数量、Taq酶活性等有限。图中Ct值是PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,则Ct值越小,起始模板量越多。
5.巢式PCR【例5】巢式PCR是指先后用外、内引物扩增目的基因的方法。其原理为:先以比目的基因大的DNA片段为模板,用一对外引物进行扩增,获得大量含目的基因的中间产物,再以扩增后的中间产物为模板,用一对内引物扩增目的基因,如图所示。下列说法错误的是(　　)
巢式PCR工作原理示意图
A.PCR反应缓冲液中Mg2+的作用是激活DNA聚合酶B.与传统PCR相比,巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例C.由于和两套引物都互补的靶序列较少,该技术可大大提高扩增的特异性D.如果两套引物一起加入反应体系中,外引物的复性温度应显著低于内引物答案 D
巢式PCR共使用了两对引物,进行了两轮PCR,第二次扩增可以减少或排除第一次扩增中出现的非特异性产物,所以该操作可以提高PCR的特异性和灵敏度,可用于极少量DNA模板的扩增。巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的,因此两个阶段反应一般不在同一试管完成,如果两套引物一起加入反应体系中,外引物复性温度要明显高于内引物,使外引物先进行反应。