2025届生物高考 二轮复习 生物技术与工程 二轮核心_精研专攻 课件

这是一份2025届生物高考 二轮复习 生物技术与工程 二轮核心_精研专攻 课件，共60页。PPT课件主要包含了实验流程，细胞培养装置，Sau3AⅠ，氨苄青霉素，抗原抗体杂交，检测结果呈阳性，DNA连接酶，感受态细胞法，碱基互补配对原则，DNA分子杂交技术等内容，欢迎下载使用。
突破点1　微生物培养与发酵
聚焦1微生物的选择培养、鉴定和计数
1.(2024·山东卷)酵母菌在合成色氨酸时需要3种酶X、Y和Z,trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体。已知3种酶均不能进出细胞,而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可分泌到胞外。将这3种突变体均匀划线接种到含有少量色氨酸的培养基上,生长情况如图。据图分析,3种酶在该合成途径中的作用顺序为(　　)A.X→Y→ZB.Z→Y→XC.Y→X→ZD.Z→X→Y
则可以合成1、2,2突变则可合成1、3,1突变则可合成2、3。突变体3可以为培养基提供中间产物A、B,供突变体1、2利用合成色氨酸,突变体1可利用中间产物A合成色氨酸,突变体2可利用中间产物B合成色氨酸,两者竞争中间产物B,其结果为各突变体得到的色氨酸的量不同,其中突变体3>1>2,反映到菌落生长情况,突变体3优于1,1优于2,故A项符合题意。
2.(2023·广东卷)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断,下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)A.A点时取样、尿素氮源培养基B.B点时取样、角蛋白氮源培养基C.B点时取样、蛋白胨氮源培养基D.C点时取样、角蛋白氮源培养基
解析 本实验的目的是筛选能高效降解角蛋白的嗜热菌,因此既要耐高温,又要能够高效降解角蛋白,所以在C点取样,并且以角蛋白氮源培养基进行选择培养。
1.选择培养基四种常见的制备方法(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
2.辨析两种微生物计数方法
3.(2024·广东广州二模)双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。在培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后,将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至45~48 ℃,然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液,充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后,根据噬菌斑的数目可计算原液中噬菌体的数量。下列叙述错误的是(　　)
A.倒平板前需利用不同方法对培养基和培养皿进行灭菌B.若利用双层平板法对T2噬菌体进行计数,可选用乳酸菌为敏感指示菌C.上层平板中出现噬菌斑的原因是噬菌体侵染宿主细菌使其裂解死亡D.若上层平板中琼脂浓度较低,可能形成的噬菌斑较大,有利于计数答案 B
解析 对培养基进行灭菌常用高压蒸汽灭菌法,而对培养皿进行灭菌常用干热灭菌法,A项正确;T2噬菌体是专门寄生在大肠杆菌中的病毒,故T2噬菌体的宿主细菌是大肠杆菌,不能用其他细菌代替,B项错误;噬菌体寄生于宿主细菌内,二者混合培养一段时间后,在上层平板上出现一些噬菌斑,这是噬菌体侵染宿主细菌使其裂解死亡所致,C项正确;与底层平板相比,上层平板中琼脂浓度较低的优点是形成的噬菌斑较大,有利于计数,D项正确。
4.(2024·贵州贵阳模拟)自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中氮气的细菌,科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究,部分实验流程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.培养自生固氮菌时可用牛肉膏蛋白胨培养基,接种完成后培养皿应倒置B.该纯化培养的方法是稀释涂布平板法,统计细菌数目时通常会低于实际值C.步骤①获取土壤一般来自深层土壤,为防止其他杂菌污染,可对获取的土壤灭菌处理D.若④的平板上菌落平均数为58个,则每克土壤中含有的固氮菌数量约为5.8×105个
解析 培养自生固氮菌时一般不需要添加氮源,而牛肉膏蛋白胨培养基含有氮源,A项错误;该纯化培养的方法是稀释涂布平板法,由于两个或多个细胞连在一起时长出来的是单个菌落,因此统计细菌数目时通常会低于实际值,B项正确;步骤①获取土壤一般来自浅层土壤,对土壤灭菌处理时也杀死了固氮菌,C项错误;若④的平板上菌落平均数为58个,则每克土壤中含有的固氮菌数量约为58÷0.1×104=5.8×106(个),D项错误。
聚焦2传统发酵技术与发酵工程
5.(2024·湖北卷)制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物,常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是(　　)A.食用醋的酸味主要来源于乙酸B.醋酸菌不适宜在无氧条件下生存C.醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶D.葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内
解析 食用醋的酸味主要来源于乙酸,A项正确;醋酸菌是好氧细菌,不适宜在无氧条件下生存,当O2、糖源都充足时能将糖分解成乙酸,当缺少糖源时,将乙醇转化为乙醛,再将乙醛变为乙酸,B、C两项正确;醋酸菌是原核生物,不具有线粒体,葡萄糖分解为丙酮酸的场所为细胞质基质,D项错误。
6.(2024·山东卷)在发酵过程中,多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体,菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时,可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是(　　)A.相同菌体密度下,菌球体越大柠檬酸产生速率越慢B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长D.发酵结束后,将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
解析 相同菌体密度下,菌球体越大,其中的菌体得到的氧越少,柠檬酸的产生速率越慢,A项正确;发酵中期添加一定量的硫酸铵,可使菌体内铵离子浓度升高,进而解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制,有利于提高柠檬酸的产量,B项正确;发酵过程中pH下降使不耐酸的细菌(适合中性或弱碱性)难以生存,可抑制大部分细菌的生长,C项正确;柠檬酸属于代谢物,不能用过滤法获取,D项错误。
1.发酵过程中控制杂菌的措施(1)通过发酵条件控制杂菌:①无氧发酵时的无氧环境可以抑制好氧细菌;②乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境抑制杂菌繁殖。(2)利用盐控制杂菌:如腐乳的制作。(3)利用酒精控制杂菌:如果酒、腐乳的制作。
2.发酵工程与传统发酵技术的区别与传统发酵技术相比,大规模工业发酵能够通过选育菌种、控制发酵过程和分离、提纯产品等过程批量生产发酵产品。其操作流程如下:
7.(2024·广东广州一模)传统豆瓣酱的制作流程如下图所示,下列说法正确的是(　　)
A.霉豆瓣制作过程中,酵母菌、毛霉、乳酸菌等都发挥了重要作用B.霉豆瓣发酵过程中产生的蛋白酶能把蛋白质分解成易吸收的小分子的肽和脂肪酸C.制作辣椒胚时加入白酒的目的是利用酒精作为碳源,同时增加风味D.混合装坛后要“翻、晒、露”的目的是让微生物充分进行有氧呼吸答案 D
解析 霉豆瓣制作过程中,酵母菌、毛霉、曲霉等主要通过有氧呼吸起作用,乳酸菌只能进行无氧发酵,A项错误;霉豆瓣发酵过程中产生的蛋白酶能把蛋白质分解成易吸收的小分子的肽和氨基酸,B项错误;制作辣椒胚时加入白酒的目的是利用白酒杀菌,同时增加风味,C项错误;混合装坛后要“翻、晒、露”的目的是让微生物和空气接触,充分进行有氧呼吸,D项正确。
8.(2024·福建福州三模)青霉是一种好氧微生物,青霉发酵时,在合成的开始阶段青霉素和头孢霉素有共同的前体,不久出现分支。生产抗生素的发酵罐如图所示,以下叙述正确的是(　　)
青霉素与头孢霉素的生物合成途径(部分)
A.由于青霉素的抗菌作用,通入发酵罐的空气无需灭菌B.搅拌能够使氧气与培养液快速混合,但不利于散热C.将外源扩环酶基因导入青霉,可增加头孢霉素产量D.青霉的发酵最终获得的青霉素是一种单细胞蛋白答案 C
解析 青霉素可以抑制细菌的生长,但不能杀灭所有的微生物,因此,发酵罐需要严格灭菌,通入发酵罐的空气需灭菌,A项错误;搅拌能够使氧气与培养液快速混合,同时有利于散热,B项错误;青霉发酵时,在合成的开始阶段青霉素和头孢霉素有共同的前体,将外源扩环酶基因导入青霉,可增加头孢霉素产量,C项正确;微生物菌体本身属于单细胞蛋白,青霉素不是单细胞蛋白,D项错误。
突破点2　比较植物细胞工程和动物细胞工程
聚焦1植物组织培养和动物细胞培养
1.(2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染,造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗,操作流程如下图。下列叙述正确的是(　　)
A.①为脱分化过程,1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块B.②为再分化过程,愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组C.3号培养基用于诱导生根,其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1D.百合分生区附近的病毒极少,甚至无病毒,可以作为该研究中的外植体
解析 ①为脱分化过程,1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块,A项错误;②为再分化过程,愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变,但基因重组发生在减数分裂过程中,愈伤组织细胞分化时进行有丝分裂,不会发生基因重组,B项错误;3号培养基用于诱导生根,其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1,C项错误;百合分生区(一般在茎尖、芽尖、根尖)附近的病毒极少,甚至无病毒,因此可以作为该研究中的外植体,D项正确。
2.(2024·安徽卷)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素,设计了以下实验流程和培养装置(如图),请同学们进行评议。下列评议不合理的是(　　)
A.实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织,制备悬浮细胞B.装置中的充气管应置于液面上方,该管可同时作为排气管C.装置充气口需要增设无菌滤器,用于防止杂菌污染培养液D.细胞培养需要适宜的温度,装置需增设温度监测和控制设备答案 B解析 植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,欲利用愈伤组织制备悬浮细胞,可用纤维素酶和果胶酶进行处理,A项合理。为使细胞获得充足的氧气并及时排出多余气体,装置中的充气管应置于液面下方,排气管要置于液面上方,故充气管不能同时作为排气管,B项不合理。为了防止杂菌污染培养液,装置充气口需要增设无菌滤器,C项合理。细胞培养时需要保证适宜的温度,因此装置需增设温度监测和控制设备,D项合理。
比较植物组织培养与动物细胞培养
3.(2024·北京海淀一模)某科学小组探索长寿花组织培养过程中外植体的消毒条件,实验结果如下表所示。下列分析不正确的是(　　)
注:褐化是指培养材料在组织培养过程中向培养基中释放褐色物质并变褐死亡的现象。
A.消毒处理时间越长,组织培养成功率越高B.消毒处理时间越长,外植体的污染率越低C.诱导培养外植体脱分化为愈伤组织的过程中一般不需要光照D.组织培养过程中提高生长素与细胞分裂素的比例有助于生根答案 A解析 由表格信息可知,消毒处理时间越长褐化率越高,死亡率越高,组织培养成功率越低,A项错误;表中数据显示消毒处理时间越长外植体的污染率越低,B项正确;诱导愈伤组织形成过程中一般不需要光照,因为光可以诱导产生维管组织,不利于愈伤组织形成,C项正确;生长素和细胞分裂素的比值大时有利于根的形成,因此提高生长素与细胞分裂素的比例有助于生根,D项正确。
4.(2024·山东聊城二模)灌流式培养是在细胞培养管内,一边不断注入新鲜培养基,一边将培养液的上清液不断移出。区别传统的悬浮培养,灌流式培养可避免因细胞密度过大、有害代谢物积累等因素而使细胞分裂受阻的现象出现。下列叙述正确的是(　　)A.灌流式培养的细胞会贴壁生长,但不会出现接触抑制现象B.灌流是在细胞密度达到一定浓度或者营养物质低于一定浓度时进行的C.灌流速率越高,营养物质利用越充分D.向培养管注入的新鲜培养基中补充动物血清是为了防止杂菌污染
解析 灌流式培养的动物细胞不出现贴壁生长现象,A项错误;悬浮培养的动物细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻,而灌流是在细胞密度达到一定浓度或者营养物质低于一定浓度时进行的,B项正确;过高的灌流速率会导致培养的细胞没有及时利用营养物质,从而使营养物质不能得到充分的利用,C项错误;培养基中加入血清是为了提供动物细胞培养所需要的营养物质和某种生长因子,D项错误。
聚焦2植物体细胞杂交和动物细胞融合
5.(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性强,植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙,过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.过程①中酶处理的时间差异,原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异B.过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合C.过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素D.可通过分析植物丙的染色体,来鉴定其是否为杂种植株答案 B
解析 植物体细胞杂交过程包括原生质体的制备(去壁)、原生质体融合、再生细胞壁、植物组织培养等过程。图示过程①需要用纤维素酶和果胶酶处理去除细胞壁,酶处理的时间差异的原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异,A项正确;过程②可采用PEG融合法、高Ca2+—高pH融合法、电融合法和离心法等诱导原生质体融合,不能用灭活的仙台病毒诱导,B项错误;过程④和⑤分别是脱分化和再分化,培养基中均需要加入生长素和细胞分裂素,C项正确;杂种植株细胞中同时含有植物甲和乙的染色体,可通过分析植物丙的染色体,来鉴定其是否为杂种植株,D项正确。
6.(2024·江西卷改编)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基,每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法,研究人员采用杂交瘤技术制备了抗-S单克隆抗体(如图)。下列说法不正确的是(　　)
A.利用胶原蛋白酶处理,可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞B.制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是不同的单克隆抗体C.用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养,但不能冻存D.单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白答案 C
解析 胶原蛋白酶可以催化分解细胞外的胶原蛋白,因此利用胶原蛋白酶处理,可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞,A项正确;由于蛋白S含有多个不同的抗原决定基,每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体,单克隆抗体A和单克隆抗体B来自不同的杂交瘤细胞,因此制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是不同的单克隆抗体,B项正确;用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养,也可以冷冻保存,C项错误;单克隆抗体A和单克隆抗体B都来自筛选出的杂交瘤细胞,因此都能够特异性识别S蛋白,D项正确。
比较植物体细胞杂交与动物细胞融合
7.(2024·北京昌平二模)我国科研人员在太空中进行细胞电融合实验,获得烟草黄花品种叶肉细胞与烟草革新一号叶肉细胞的杂交细胞,又成功完成小鼠淋巴细胞和人骨髓瘤细胞杂交实验。下列相关叙述不正确的是(　　)A.两个电融合实验中,融合前都需用一定浓度的特定酶预处理实验材料B.细胞经电融合处理后,需进一步筛选,以淘汰未融合细胞和多核细胞C.电融合处理后的烟草细胞经组织培养,可获得具有双亲优良性状的植株D.经电融合获得的人—鼠杂交瘤细胞,培养过程中体现了细胞的全能性
解析 因植物细胞外面的细胞壁阻碍了细胞间的杂交,因此在诱导两个品种烟草的叶肉细胞融合之前,先要用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞的细胞壁;动物细胞虽然没有细胞壁,但为了防止人骨髓瘤细胞在培养过程中出现贴壁生长,在诱导小鼠淋巴细胞和人骨髓瘤细胞电融合前,也需用一定浓度的特定酶预处理实验材料,A项正确。融合后的细胞最初是多核的,经过有丝分裂后,细胞核才能融合,细胞经电融合处理后,需进一步筛选,以淘汰未融合细胞和多核细胞,B项正确。电融合处理后的烟草细胞经组织培养,可获得完整的植株。由于该植株的遗传物质来自双亲,所以具有双亲的优良性状,C项正确。经电融合获得的人—鼠杂交瘤细胞,培养过程中体现了细胞膜的流动性,没有体现细胞的全能性,D项错误。
8.(2024·重庆九龙坡模拟)图1为单克隆抗体的制备原理和方法,这样制得的抗体为鼠源性抗体,图2为鼠、人抗体基因示意图。下列叙述错误的是(　　)
A.图1获得的杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量增殖,又能产生特异性抗体B.细胞培养时除特殊营养成分外,还需提供95%空气和5% CO2的气体条件C.图1获得单克隆抗体过程中,需要进行克隆化培养和抗体检测D.将图2中的A和D连接进行基因改造可以降低鼠源抗体的免疫原性
解析 杂交瘤细胞既具有B细胞的特点又具有骨髓瘤细胞的特点,即既能无限增殖又能产生特异性抗体,A项正确;动物细胞培养时除特殊营养成分外,还需提供95%空气和5% CO2的气体条件,B项正确;对细胞进行克隆化培养后通过抗原—抗体杂交技术进行抗体检测,才能确认是所需抗体,C项正确;为降低鼠源抗体的免疫原性,进行基因改造时,应该把图2中的C和B进行连接,D项错误。
突破点3　表达载体的构建及基因编辑技术
聚焦1限制酶的选取与基因表达载体的构建
1.(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落答案 D
解析 用一种限制酶切割,目的基因在质粒上可以正向或反向插入,进而导致基因转录产物的不同,A项正确。用一种限制酶切割后,质粒有可能发生自身环化,导致目的基因未能插入,B项正确。SphⅠ酶切会在重组质粒上产生特定的片段,通过DNA凝胶电泳技术可以分离和检测这些片段,从而确定重组质粒是否构建成功,C项正确。根据质粒图示,携带目的基因的受体菌需要同时具有AmpR和TetR基因才能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基中形成菌落,若用SphⅠ酶切,会破坏四环素抗性基因(TetR),D项错误。
1.限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
2.基因表达载体的构建过程
2.(2024·山东泰安模拟)白细胞介素-2(IL-2)参与移植排斥反应,是免疫调节因子,对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用。科研人员将含IL-2基因的DNA片段和质粒pPIC9K(部分结构如图所示)构建成重组质粒,并导入酵母菌GS115(组氨酸缺陷菌株)中,筛选到了能分泌IL-2的工程菌株。下列叙述错误的是(　　)
A.组氨酸合成基因可作为标记基因筛选导入重组质粒的酵母菌细胞B.构建重组质粒时可选用Avr Ⅱ和Nt Ⅰ切割目的基因和pPIC9K质粒C.重组质粒导入酵母菌GS115前,需要先用Ca2+处理酵母菌GS115细胞D.抑制IL-2基因的表达可在一定程度上减轻机体器官移植后的免疫排斥反应答案 B
解析 酵母菌GS115是组氨酸缺陷菌株,不能合成组氨酸,可以用不含组氨酸的培养基筛选导入了重组质粒的酵母菌细胞,A项正确;据图可知,为保证目的基因(Avr Ⅱ会破坏目的基因)和启动子(SacⅠ会破坏启动子)的完整性,可用EcRⅠ和NtⅠ分别切割含有IL-2基因的DNA片段和pPIC9K质粒,B项错误;导入重组质粒前,需要先用Ca2+处理酵母菌GS115细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,C项正确;IL-2参与移植排斥反应,抑制IL-2基因的表达可在一定程度上减轻器官移植后机体的免疫排斥反应,D项正确。
3.(2024·黑龙江齐齐哈尔三模)人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中,在初乳中含量较高,对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程(图中Tetr表示四环素抗性基因,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因),五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题。
(1)要将人乳铁蛋白基因插入载体中,若只允许使用一种限制酶,应选择的限制酶是　　　　　。基因工程技术中通常选择　　　　　种限制酶进行酶切。 (2)人乳铁蛋白基因可利用PCR技术进行扩增,扩增需要引物__________　　　　　(在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择),连续扩增5次后至少需要引物　　　　个。 (3)据图分析,成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要在含有　　　　　　(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基上进行筛选,然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵,再利用　　　　工程技术获得转基因小牛。 
(4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用　　 　　 　技术,若　　 　　　,则表明目的基因已翻译形成蛋白质。 (5)对比大肠杆菌,转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势,其理由是______________________________________________________ _______________________________________________________。 
转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器,能够对人乳铁蛋白进行加工,使人乳铁蛋白具有生物活性
解析 (1)根据表中五种限制酶的识别序列及切割位点可知,Sau3AⅠ切割形成的黏性末端与BclⅠ和BamHⅠ切割形成的黏性末端相同,因此要将人乳铁蛋白基因插入载体中,若只允许使用一种限制酶,应选择的限制酶是Sau3AⅠ。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接,基因工程技术中通常选择2种限制酶进行酶切,以形成不同的黏性末端。(2)引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端连接游离的脱氧核苷酸,所以引物5'端应该与模板链的3'端配对,故应选择引物Ⅱ、Ⅲ,连续扩增5次后至少需要引物为(25-1)×2=62(个)。(3)据图分析,成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因,需要在含有氨苄青霉素的培养基上筛选,然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵,再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。
(4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术,若检测结果呈阳性,则表明目的基因已翻译形成蛋白质。(5)对比大肠杆菌,转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势,其理由是转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器,能够对人乳铁蛋白进行加工,使人乳铁蛋白具有生物活性。
聚焦2基因编辑技术及其应用
4.(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”,在单链向导RNA(sgRNA)引导下,切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。(1)过程①中,为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是　　　　　　　　。 (2)过程②中,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是　　　　　　　。 (3)过程③~⑤中,sgRNA与Cas9蛋白形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是　　　　 　　。随后,Cas9蛋白可切割　　　 　　　序列。 
目标DNA特定的核苷酸
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因,在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是　　　　　　　　　,基因敲除成功的判断依据是　　　　　　　　　。 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒,随后将其导入大肠杆菌细胞,通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中,构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内,将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程:_____________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是sgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,从而将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中
解析 (1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶,限制酶负责切割,DNA连接酶负责连接,因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物,属于微生物,将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(3)根据题意可知,在CRISPR/Cas9基因编辑技术中,sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA,能准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别,进而定位;由此可见,Cas9在功能上属于限制酶,可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
(4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功,若不出现杂交带,则说明基因敲除成功。(5)根据图示可知:CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是sgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,从而将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中。
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补,从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合,并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物,与传统的基因工程相比,其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
(1)从功能上来看,CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制性内切核酸酶,该系统广泛存在于细菌中,其在细菌中的作用是___________________ ______________________________________________________________________________。 (2)CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而“脱靶”的现象,sgRNA的识别序列越短,基因编辑的脱靶率就越高。请分析原因。_____________________________________________________________。 
切割外源DNA,使之失效,起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵,保护自身或清除入侵病毒DNA)
sgRNA的识别序列短,特异性差,容易与其他DNA片段结合造成编辑出错
5.(2024·广东佛山二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应,研究者提出了如下思路:剔除猪的某些基因,用猪的器官作为供体。借助CRISPR/Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因,下图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。下列相关叙述错误的是(　　)
A.上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因B.上述基因编辑过程还需细胞内的限制酶及DNA连接酶参与C.上述基因编辑技术能定点切除的目标基因取决于sgRNAD.可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵答案 B
解析 免疫排斥主要与标明身份的标签的蛋白质相关,所以为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应,题述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因,A项正确;由图可知,使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时,sgRNA分子的碱基序列与基因组DNA中特定碱基序列根据碱基互补配对原则结合在一起,然后由Cas9蛋白催化磷酸二酯键水解,该过程不需要细胞内的限制酶及DNA连接酶参与,B项错误;Cas9-sgRNA复合体能够精准识别某核苷酸序列的原因可能是单链sgRNA可与特定核苷酸序列碱基互补配对,所以题述基因编辑技术能定点切除的目标基因取决于sgRNA,C项正确;基因工程中常选用受精卵作为外源基因的受体细胞,可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵,D项正确。
6.(2024·江苏南通二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术是将编码Cas9酶和sgRNA的基因作为目的基因,构建基因表达载体后导入受体细胞,可对细胞内某个基因定点切割,引发被切割部位的随机突变(图1)。科研人员在CRISPR/Cas9编辑系统基础上开发了CBE单碱基编辑系统,该系统由三个元件构成,其中“dCas9蛋白+脱氨酶”在sgRNA的引导下,对结合区域第4~8位点的碱基C脱氨反应变成U,最终实现C→T的不可逆编辑,不需要DNA链断裂(如图2)。请回答下列问题。
图2(1)图1中Cas9酶作用于DNA某特定部位的　　 　键。CRISPR/Cas9编辑系统能特异性识别某段特定DNA序列的原理是依靠　　　　与特定DNA序列进行　 　　　。 
(2)CBE单碱基编辑系统将靶位点胞嘧啶脱氨基后,细胞复制　　　　次,子代DNA中靶位点碱基对由C—G彻底替换成　　　　,实现单碱基编辑。 (3)基因编辑可能造成非目标序列的碱基改变,称为脱靶。图3是我国科研工作者建立的一种脱靶检测技术。在小鼠受精卵分裂到2细胞期,编辑其中1个细胞,并使用红色荧光蛋白将其标记。当小鼠胚胎发育到14.5 d时,将整个小鼠胚胎消化成为单细胞,再利用细胞分选技术,进行全基因组测序,比较两组差异。
①小鼠受精卵可以从雌鼠　　　　　中采集或通过　　 　　技术获得。当小鼠胚胎发育到14.5 d时,将整个小鼠胚胎先用　　 　　处理,分散成单细胞再进行分选。 ②图3中的标记基因的作用是  　。 ③在该实验中,没有编辑的那个细胞发育出的细胞的作用是　　　　　。经检测,如果两种细胞之间存在基因组碱基序列上的差异,这种差异就是　　　　　　　　引起的。与用同一品系小鼠不同受精卵进行脱靶检测相比,上述脱靶检测技术更加精准,这是因为__________________________　 。 
分选被编辑细胞与未编辑细胞的后代
来自同一受精卵的细胞基因
解析 (1)脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接,Cas9酶可以水解该键。CRISPR/Cas9编辑系统能特异性识别某段特定DNA序列的原理是依靠sgRNA与特定DNA序列进行碱基互补配对。(2)根据题意,CBE单碱基编辑系统能将靶位点的胞嘧啶C脱氨基成尿嘧啶U,第一次复制后的2个子代DNA中,相应位置的碱基对分别是G—C和U—A,再经过第二次复制,得到的4个子代DNA中相应位置的碱基对分别是G—C、C—G、U—A和A—T,所以复制2次后,子代DNA中靶位点碱基对由C—G彻底替换成T—A。
(3)①受精作用发生在输卵管,小鼠受精卵可以从雌鼠输卵管中采集或通过体外受精技术获得。可用胰蛋白酶将整个小鼠胚胎分散成单细胞。②脱靶检测过程中标记基因的作用是分选被编辑细胞与未编辑细胞的后代。③在该实验中,没有编辑的那个细胞发育出的细胞起到对照作用。如果两种细胞之间存在基因组碱基序列上的差异,这种差异就是基因编辑工具进行基因编辑引起的。若是用同一品系小鼠不同受精卵进行脱靶检测,不同小鼠受精卵的基因会不同,有可能对实验结果造成影响。