专题18 基因工程-【真题汇编】2024年高考生物真题和模拟题分类汇编

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专题18 基因工程
(2024年1月浙江省)1. 关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是（ ）
A. 试管动物的培育B. 转基因食品的生产
C. 治疗性克隆的研究D. 生物武器的发展和生产
【答案】D
【解析】
【分析】1、我国政府一再重申 四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
2、2010年，在第65 届联合国大会上，我国政府重申支持《禁止生物武器公约》的宗旨和目标，全面、严格履行公约义务，支持不断加强公约的约束力，并主张全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。
【详解】A、试管动物的培育属于胚胎工程，没有禁止，A正确；
B、我过目前不反对转基因的食品的生产，B正确；
C、中国政府禁止生殖性克隆，支持治疗性克隆，C正确；
D、生物武器致病能力强、攻击范围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D错误
故选D。
(2024年山东省）13. 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A. 整个提取过程中可以不使用离心机
B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
【答案】A
【解析】
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；
B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；
C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；
D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
故选A。
(2024年山东省）25. 研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】（1） ①. 低 ②. 256 ③. GTTT ④. CAAT
（2） ①. 卡那霉素 ②. Sac Ⅰ ③. ④
（3）1/4
【解析】
【分析】1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
2、PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR可以快速的获取和扩增目的基因。
【小问1详解】
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。
【小问2详解】
根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
【小问3详解】
根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
（2024年高考全国甲卷）12. 某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
【答案】（1） ①. 变性 ②. 氢键
（2） ①. 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 ②. T4DNA连接酶
（3） ①. 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 ②. 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸
【解析】
【分析】1、基因工程基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。
【小问2详解】
构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4DNA连接酶连接。
【小问3详解】
大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
【小问4详解】
蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。
（2024年安徽省）14. 下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C. DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
【答案】D
【解析】
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；
B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；
C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；
D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。
故选D。
（2024年广东省）21. 驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
（1）研究者优化了培养基_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
（2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________，理由是___________。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为________________________（答两点）。
（4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。
（5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。
【答案】（1）碳源、氮源
（2） ①. PT7、PBAD 和PBAD ②. 基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
（3）抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
（4）该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
（5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
【小问2详解】
题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
【小问3详解】
光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。
【小问4详解】
由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
【小问5详解】
由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
（2024年吉林省）7. 关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【解析】
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。
【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
故选A。
（2024年吉林省）25. 将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【答案】（1） ①. 水解DNA酶，防止DNA被分解 ②. 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
（2） ①. PCR技术扩增 ②. 人工合成
（3） ①. RNA聚合酶识别并结合的部位 ②. 调控目的基因的表达
（4）HygBR （5） ①. F3 ②. R2 （6）D
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解DNA酶，防止DNA被分解。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
【小问2详解】
本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。
【小问3详解】
穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是调控目的基因的表达。
【小问4详解】
结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
【小问5详解】
为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。
【小问6详解】
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。
ABC不符合题意，D符合题意。
故选D。
（2024年安徽省）20. 丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
（1）扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_________________。
（2）使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是___________________________。
、
（3）研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的____________________，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置______（填数字）组实验（重复组不计算在内）。
（4）大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是__________________。
（5）发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经_____________________，最终获得发酵产品。
【答案】（1）在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
（2）在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
（3） ①. 乳酸或有机酸 ②. 9
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
（5）提取、分离、纯化
【解析】
【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【小问1详解】
在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。
【小问2详解】
据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
【小问3详解】
碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。
【小问4详解】
大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。
【小问5详解】
发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
(2024年1月浙江省)22. 锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。
（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
【答案】（1） ①. 根 ②. 解旋酶 ③. 磷酸基团 ④. 变长
（2） ①. DNA连接酶 ②. 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢
（3） ①. 划线分离 ②. 振荡培养
（4） ①. 梯度稀释 ②. 锌吸收缺陷型酵母+空载体 ③. N ④. 转入N基因的这组酵母菌数量数量多
【解析】
【分析】由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相近，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。
【小问1详解】
由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。
【小问2详解】
内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。
【小问3详解】
冻存酵母菌可直接在固体培养基上涂布或平板划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。
【小问4详解】
由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。
(2024年1月浙江省)23. 小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示）
回答下列问题：
（1）F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生______，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了______而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行______和______。
（2）从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第______泳道和第______泳道。
（3）g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是______，则g和f是非等位基因；若杂交结果是______，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示）
（4）确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是______。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用______。
【答案】（1） ①. 编码序列错位 ②. 氨基酸序列 ③. 替换 ④. 缺失
（2） ①. 3 ②. 2
（3） ①. 子代全为野生型 ②. 野生型：突变型=1：1
（4） ①. 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 ②. 抑制毛发生长
【解析】
【分析】基因分离定律实质：在杂合子细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；当细胞进行减数分裂，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子当中，独立地随配子遗传给后代。
【小问1详解】
依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。
【小问2详解】
从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。
【小问3详解】
据题意可知，野生型基因用++表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因型用+f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠（+f/++）与g小鼠（++/gg）杂交，后代为++/+g和+f/+g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠（+f）与g小鼠（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。
【小问4详解】
据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢失，无法转录出 mRNA，也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。
(河南省2024)11. 某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2点即可）。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯键 ②. 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达
（2）C-G、A-T、U-A
（3） ①. N基因的两条链 ②. 不能扩增出目的基因
（4）不污染环境、增加土壤养分
【解析】
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【小问1详解】
限制酶切割化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因，且能保证N基因正常发表达。
【小问2详解】
RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。
【小问3详解】
用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出DNA片段。
【小问4详解】
与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
(甘肃省2024)21. 源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。

（1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是______。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了______。
（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。
（3）过程⑤在基因工程中称为______，该过程需要的主要酶有______。
（4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有______。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种______的生理状态。
（5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是______（答出两点）。
注：混1和混2表示三种酶的混合物
【答案】（1） ①. 只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 ②. 菌落产生的纤维素酶的活性和量有关
（2）耐高温的DNA聚合酶
（3） ①. 基因表达载体的构建 ②. 限制酶、DNA连接酶
（4） ①. 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 ②. 能吸收周围环境中DNA分子
（5）降解时的温度不同、降解时的pH不同
【解析】
【分析】据图可知，①②是利用选择培养基筛选出高产纤维素酶菌株X，③是提取菌株X基因组，④为基因工程操作程序中“目的基因的筛选和获取”，⑤为“基因表达载体的构建”，⑥为“将目的基因导入受体细胞”，⑦为从培养体系中分离得到重组酶。
【小问1详解】
选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。
刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。
【小问2详解】
扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。
【小问3详解】
根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。
【小问4详解】
大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。
先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
【小问5详解】
不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响。
2024 年黑龙江省普通高等学校招生选择性考试临考预测押题密卷-生物学 A卷1. 吲哚胺-2，3-二氧酶（IDO）是一种含铁血红素单体蛋白，可催化色氨酸分解代谢，可能与免疫排斥反应、病原体感染、中枢神经系统疾病（如抑郁）等有关。为研究IDO表达的相关特性，研究者构建了一个能融合表达IDO和绿色荧光蛋白（EGFP）的质粒IDO-EGFP-C1。回答下列问题：
（1）利用PCR技术获取IDOcDNA，过程如图1所示，图中①~③表示步骤，其中影响扩增特异性的步骤是________。由图可知，扩增温度设置存在差异，其中与酶无关的步骤是______。
（2）构建融合IDO和EGFP的重组质粒IDO-EGFP-C1（图2中KpnI、NheI、AgeI、BglⅡ均为限制酶且指向其识别序列，KanR为卡那霉素抗性基因，ri为复制原点，233bp的片段为IDO基因的特有序列）。已知IDOcDNA的长度为1200bp，而质粒EGFP-C1的长度为4700bp，其上EGFP的长度为780bp。图2为设计的实验流程（箭头表示正确的插入方向），研究者甲认为用引物a和引物b进行PCR扩增，再将产物用电泳鉴定，若产生______bp的DNA片段即可证明实验成功；但研究者乙认为该实验流程需修正，其最简单的方法是____________。
（3）重组质粒IDO-EGFP-C1的测序。研究者乙根据其想法实施了实验并获得预期的产物，通常还需进一步通过基因测序对结果进行确认，原因是_____________。
（4）转染结果鉴定。转染IDO-EGFP-C1质粒的TC-1细胞中可见荧光蛋白表达，该过程需在培养基中添加______以便筛选转染成功的细胞，然后提取被转染的TC-1细胞的基因组DNA，用引物a和引物c对其进行扩增，结果如图3，则图中1为含______的TC-1细胞，2、3为______。
【答案】（1） ①. ② ②. ①②
（2） ①. 1013 ②. 在IDOcDNA左端插入KpnI识别序列，右端插入NheI（或AgeI、BglⅡ）的识别序列，以防止IDOcDNA反向插入质粒
（3）电泳仅能检测DNA片段的大小，无法确定DNA分子的碱基序列是否正确
（4） ①. 卡那霉素 ②. 重组质粒IDO-EGFP-C1 ③. 含EGFP-C1质粒（或空白质粒）的TC-1细胞
【解析】
【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
2、PCR技术扩增目的基因：
（1）原理：DNA双链复制。
（2）过程：第一步：变性，加热至90~95℃使DNA解旋；第二步：复性，降温到55~60℃，使引物结合到互补DNA模板链上；第三步：延伸，加热至70~75℃，热稳定的DNA聚合酶从引物3'端起始互补链的合成。
【小问1详解】
分析图1可知，图中①~③表示步骤分别为变性、复性和延伸，其中影响扩增特异性的步骤是步骤②复性，步骤②是引物与特异性扩增的DNA模板链结合的过程，由图可知，扩增温度设置存在差异，其中步骤①变性，加热至90~95℃使DNA解旋，与酶无关，步骤②复性是引物与特异性扩增的DNA模板链结合的过程，与酶无关。
【小问2详解】
根据题意和图2可知，已知IDOcDNA的长度为1200bp，而质粒EGFP-C1的长度为4700bp，其上EGPP的长度为780bp。研究者甲认为用引物a和引物b进行PCR扩增，再将产物用电泳鉴定，那么引物a和引物b进行PCR扩增后得到的片段有IDOcDNA中长度为233bp片段和EGFP的长度为780bp的片段，因此产物用电泳鉴定后，若产生233+780=1013bp的DNA片段即可证明实验成功；但是该实验流程中插入的IDOcDNA两端均为限制酶KpnI切割的序列，容易导致IDOcDNA反向插入，因此实验流程修正的方法为：在IDOcDNA左端插入KpnI识别序列，根据质粒EGFP-C1上限制酶的识别序列，在IDOcDNA右端插入NheI（或AgeI、BglⅡ）的识别序列，这样IDOcDNA序列左右两端限制酶识别序列不同，可防止IDOcDNA反向插入质粒。
【小问3详解】
根据题意，重组质粒IDO-EGFP-C1的测序。根据题意，用电泳鉴定的结果仅能检测DNA片段的大小，无法确定DNA分子的碱基序列是否正确，因此通常还需进一步通过基因测序对结果进行确认。
【小问4详解】
根据图2可知，IDO-EGFP-C1质粒上存在KanR为卡那霉素抗性基因，将IDO-EGFP-C1质粒导入TC-1细胞中，可以利用标记基因筛选转染成功的细胞，即在培养基中添加卡那霉素以便筛选转染成功的细胞。然后提取被转染的TC-1细胞的基因组DNA，用引物a和引物c对其进行扩增，结果如图3，引物a和引物c扩增的产物为IDOcDNA中长度为233bp片段，则图3中1具有233bp的片段，233bp的片段为IDO基因的特有序列，说明1为导入重组质粒IDO-EGFP-C1的TC-1细胞，图3中2、3不含有IDOcDNA中长度为233bp片段，说明导入TC-1细胞的为含EGFP-C1质粒或空白质粒。
2024届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题2. 大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（ ）

A. DNA溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
B. 电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理
C. 根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
【答案】D
【解析】
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小、和构象等有关。电泳技术可以根据相对分子质量大小把不同的DNA分开，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖凝胶电泳中移动速率越慢。
【详解】A、DNA不溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA，A错误；
B、DNA带负电，DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，B错误；
C、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，C错误；
D、用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒时，电泳结果中的这些条带通常需要在紫外线下观察和照射才能显示出来，因此需要紫外灯照射，D正确。
故选D。
2024届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题3. 科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析正确的是（ ）
A. 对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成
B. 生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列
C. 可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2
D. 构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcRI、BamHI和Ec52 I
【答案】ABC
【解析】
【分析】1、蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸列→找到相对应的核糖核苷酸序列（RNA)→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA)。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与表达。
【详解】A、对蛋白质结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成，A正确；
B、α—淀粉酶（AmyS1）的化学本质是蛋白质，蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核糖核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，正确；
C、将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C，可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2，C正确；
D、若用BamH I酶进行切割，会导致目的基因结构破坏，因此选择Nde I和EcR I，既不会破坏目的基因，也能防止目的基因片段反向连接与质粒自身环化等问题；根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是Mlu I和Ec 52Ⅰ，D错误。
故选ABC。
2024届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题4. 人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程（图中Tetr表示四环素抗性基因， Ampr表示氨苄青霉素抗性基因），五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题：

（1）要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是__________。基因工程技术中通常选择__________种限制酶进行酶切。
（2）人乳铁蛋白基因可利用PCR技术进行扩增，扩增需要引物__________（在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择），连续扩增5次后至少需要引物_________个。
（3）据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要再含有____________（填“四环素”或“氨苄青霉素”）的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用_________工程技术获得转基因小牛。
（4）检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用___________技术，若___________，则表明目的基因已翻译形成蛋白质。
（5）对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是________________。
【答案】（1） ①. BamHⅠ ②. 2##两
（2） ①. Ⅱ、Ⅲ ②. 62
（3） ①. 氨苄青霉素 ②. 胚胎
（4） ①. 抗原-抗体杂交 ②. 检测结果呈阳性
（5）转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对人乳铁蛋白进行加工，使人乳铁蛋白具有生物活性
【解析】
【分析】基因表达载体的构建使基因工程的核心步骤，表达载体元件包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点。
【小问1详解】
要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，根据人乳铁蛋白两端的识别序列可知，BclⅠ和Sau3AⅠ可以切除相同的黏性末端，结合质粒上的识别序列可知，只用一种酶且切除相同的黏性末端，则应选择的限制酶是BamHⅠ。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，基因工程技术中通常选择2种限制酶进行酶切，以形成不同的黏性末端。
【小问2详解】
引物的作用是使耐高温DNA聚合酶从引物的3'端连接游离的脱氧核苷酸，所以引物5'端应该于模板链的3'端配对，故引物应选择Ⅱ、Ⅲ，连续扩增5次后至少需要引物为（25-1）×2=62个。
【小问3详解】
据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，需要在含有氨苄青霉素的培养基上筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。
【小问4详解】
检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原-抗体杂交技术，若检测结果呈阳性，则表明目的基因已翻译形成蛋白质。
【小问5详解】
对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对人乳铁蛋白进行加工，使人乳铁蛋白具有生物活性。
2024届东北三省四市教研联合体高三模拟（二）生物试题5. 中国科学家领衔的国际团队发现，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，利用PCR 技术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（ ）
A. 研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案
B. PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步
C. DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
D. 一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物
【答案】C
【解析】
【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、题意显示，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，因此研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案，A正确；
B、PCR 反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，B正确；
C、DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误；
D、一般采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，D正确。
故选C。
2024届东北三省四市教研联合体高三模拟（二）生物试题6. 我国科研人员通过基因治疗，成功治愈了全球首例β-地中海贫血症患者。研究人员运用高精准变形式碱基编辑器(tBE)，对患者自体造血干细胞中的单个碱基进行编辑，以重新激活γ-珠蛋白的表达，最终使患者血红蛋白水平恢复正常，过程如图1 所示。相较于图2中基于 CRISPR 技术的β-地贫基因编辑疗法，该方法见效更快、疗效更好，且不引发患者基因组突变或片段缺失。请回答下列问题。
（1）基因治疗中通常用到AAV(腺病毒)等，AAV的作用为____________。
（2）据图2分析CRISPR 技术中gRNA 起____________(填“导向”或“切割”)的作用。相比 CRISPR 技术(切断双链)，tBE 不需要破坏DNA 双链就能对致病的碱基突变进行校正，由此可知tBE 具有________优点(写出1点即可)。
（3）为了检测目的基因是否翻译成γ-珠蛋白，可采用的技术为____________。采用自体造血干细胞编辑移植的优点为________________________________(写出1点即可)。
（4）欲验证图1中基因治疗方法对β-地中海贫血症患者的疗效，请写出大致实验思路。(注：使用的测量工具无需说明，β-地中海贫血症志愿者、健康志愿者多人)__________________
【答案】（1）作为载体将目的基因导入（受体）细胞
（2） ①. 导向 ②. 高安全性、高特异性；针对单碱基进行编辑，正常不发生错编或误编的情况；见效更快、疗效更好，且不引发患者基因组突变和片段缺失
（3） ①. 抗原-抗体杂交 ②. 不发生免疫排斥反应，
（4）将生理状态、性别、年龄等相同的β-地中海贫血症志愿者随机均分为甲、乙两组，分别测量二者的血红蛋白水平后，对甲组采用碱基编码疗法进行治疗，乙组不采用，适宜条件下生活一段时间后，分别再次测量二者的血红蛋白水平，并与健康志愿者的血红蛋白水平进行比较。
【解析】
【分析】CRISPR/Cas9基因编辑技术是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行准确切割的技术，通过设计向导RNA中的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割。
【小问1详解】
基因治疗中通常用到AAV(腺病毒)等，该技术中用到转基因技术，腺病毒AAV作为载体将目的基因导入（受体）细胞。
【小问2详解】
图2中CRISPR 技术中gRNA 起导向的作用，即能通过碱基互补配对原则实现基因中碱基的定点改变。相比 CRISPR 技术(切断双链)，tBE 不需要破坏DNA 双链就能对致病的碱基突变进行校正，由此可知tBE 具有高安全性、高特异性；针对单碱基进行编辑，正常不发生错编或误编的情况；见效更快、疗效更好，且不引发患者基因组突变和片段缺失。
【小问3详解】
为了检测目的基因是否翻译成γ-珠蛋白，由于要检测蛋白质的存在，因而可采用的技术为抗原-抗体杂交技术。
采用自体造血干细胞编辑移植的优点表现为由于造血干细胞取自患者本身，因而在改造后的造血干细胞移植后不会发生免疫排斥，因而更安全，治疗成功率高，且不需要在手术后服用免疫抑制剂。
【小问4详解】
本实验的目的是验证基因治疗方法对β-地中海贫血症患者的疗效，自变量应为是否进行基因治疗，因变量为血红蛋白的含量，因此实验设计思路为：将生理状态、性别、年龄等相同的β-地中海贫血症志愿者随机均分为甲乙组，分别测量二者的血红蛋白水平后，对甲组采用碱基编码疗法进行治疗，乙组不采用，适宜条件下生活一段时间后，分别再次测量二者的血红蛋白水平，并与健康志愿者的血红蛋白水平进行比较。若甲组体内血红蛋白低含量高于对照组，则表明基因治疗方法对β-地中海贫血症患者的疗效。
（2024届贵州省黔东南苗族侗族自治州凯里市第一中学黄金二卷三模）7. 胰岛素是治疗人类糖尿病的特效药，传统生产胰岛素的方法是从动物胰腺中提取。1978年，我国科学家将人胰岛素基因（S）导入大肠杆菌细胞中，构建基因工程菌并进行筛选，使大肠杆菌表达重组人胰岛素，这是我国拥有自主知识产权的基因工程药物，流程如图所示。为防止目的基因与载体质粒反向连接，选用图中MunI和NheI两种限制酶来切割目的基因和质粒，但INS基因的两侧无MunI和NheI两种限制酶的识别序列及切割位点，可在PCR扩增INS基因时增加MunI和NheI两种限制酶的识别序列，以便构建基因表达载体。回答下列问题：
注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。图中限制酶识别序列及切割位点：EcRI：G↓AATTC、MunI：C↓AATTG、NheI：G↓CTAGC、XhI：C↓TCGAG
（1）设计引物时需要在引物的________（填“3'”或“5'”）端增加相应限制酶的识别序列。
（2）已知INS基因编码区首端和末端（其中一条链）的序列为5'-AGCCCTCC…（中间核苷酸序列）…GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是________（选填字母序号）。
A. 5'-GAATTCAGCCCTCC-3'
B. 5'-CAATTGAGCCCTCC-3'
C. 5'-GCTAGCGCTGGTTC-3'
D. 5'-CTCGAGGAACCAGC-3'
（3）流程中步骤③将目的基因导入大肠杆菌前，常用_________处理大肠杆菌细胞，以提高转化率。转化后的大肠杆菌，需要配制培养基进行培养，配制的培养基采用___________法进行灭菌。
（4）在经步骤③处理后的大肠杆菌中进一步分离筛选出导入重组质粒（含目的基因的质粒）的大肠杆菌，从菌落特征的角度设计一个实验方案进行筛选，要求写出实验思路及预期结果______。
【答案】（1）5′ （2）BC
（3） ①. Ca2+ ②. 湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
（4）实验思路：将步骤③处理后的大肠杆菌培养在含有氨苄青霉素和X−gal的牛肉膏蛋白胨培养基中，在适宜条件下培养一段时间，观察平板上菌落的颜色。预期结果：若菌落呈白色，说明大肠杆菌导入了重组质粒；若菌落呈蓝色，说明大肠杆菌导入的是未含有目的基因的空质粒。
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因、复制原点等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
用PCR扩增目的基因时，需要加入引物，引物与目的基因模板链的3′端结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，因此限制酶的识别序列只能添加在引物的5′端。
【小问2详解】
已知INS基因的编码区的首段和末端（其中一条链）的序列为5′—AGCCCTCC…（中间核苷酸序列）…GAACCAGC—3′，则其互补链碱基序列为3′—TCGGGAGG…（中间核苷酸序列）…CTTGGTCG—5′。因为两种引物结合在模板链的3′端，根据碱基互补配对原则在没有添加识别序列时引物的序列为：5′—AGCCCTCC和5′—GCTGGTTC，且两种限制酶识别序列添加在引物的5′端，所以将限制酶MunⅠ的识别序列CAATTG和限制酶NheⅠ的识别序列GCTAGC分别加在原引物的5′端，故可选用的一对引物是B：5′—CAATTGAGCCCTCC—3′和C：5′—GCTAGCGCTGGTTC—3′。
【小问3详解】
大肠杆菌等原核细胞一般用Ca2+处理，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组质粒导入其中。配置好的培养基采用湿热灭菌法灭菌。
【小问4详解】
要设计实验用菌落的特征从步骤③处理后的大肠杆菌中分离筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，分离纯化微生物的方法可采用稀释涂布平板法或平板划线法进行接种操作。将步骤③处理后的大肠杆菌培养在含有氨苄青霉素和X−gal的牛肉膏蛋白胨培养基中，在适宜条件下培养一段时间，观察平板上菌落的颜色。由于氨苄青霉素具有杀菌作用，因此未含有目的基因的空质粒和含有重组质粒的大肠杆菌均能在此培养基生存。但由于目的基因的插入质粒，破坏了LacZ基因，导致LacZ基因不能编码产生β−半乳糖苷酶，培养基中的X−gal物质由于缺少β−半乳糖苷酶不能分解产生蓝色物质，故导入重组质粒（含目的基因的质粒）的大肠杆菌菌落呈白色。
（2024届广西桂柳高三下学期名校联考）8. 科研人员利用不同算法，可依据蛋白质结构预测其功能。下列有关说法错误的是（ ）
A. 将未知蛋白质与已知蛋白质的氨基酸序列进行对比分析可以预测蛋白质的功能
B. 通过三维结构对比可以判断两个蛋白质是否有相似的功能
C. 核苷酸序列发生突变，其编码的蛋白质功能就会发生改变
D. 可根据蛋白质结构相似程度判断物种间亲缘关系的远近
【答案】C
【解析】
【分析】1．蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2．蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
【详解】A、蛋白质的功能主要由其三维结构决定，而其三维结构与氨基酸序列有关。所以将未知蛋白质与已知蛋白质的氨基酸序列进行对比分析可以预测蛋白质的功能，A正确；
B、蛋白质的功能主要由其三维结构决定，所以通过三维结构对比可以判断两个蛋白质是否有相似的功能，B正确；
C、核苷酸序列发生突变，由于密码子具有简并性，其编码的蛋白质功能不一定发生改变，C错误；
D、蛋白质结构相似程度越高，生物之间的相似性越大，亲缘关系越近，因此可根据蛋白质结构相似程度判断物种间亲缘关系的远近，D正确。
故选C。
（2024届广西桂柳高三下学期名校联考）9. 基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（ ）
A. 应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内
B. 可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物
C. 目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则
D. 转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内，A正确；
B、若在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物，则可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物，B正确；
C、目的基因的黏性末端与质粒的黏性末端依赖碱基互补配对原则连接在一起，C错误；
D、转基因是否成功，最简便的方法是从个体水平上观察该植物有没有抗虫性状，D正确。
故选C。
（2024届贵州省贵阳一中联考模拟预测）10. 某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图所示，①～④为操作步骤，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcRⅠ酶切位点唯一。其中BamHⅠ与EcRⅠ之间的距离为20kb，BamHⅠ与BglⅡ之间的距离为25kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcRⅠ识别序列和切割位点如图。请回答：
BamHⅠ：—G↓GATCC— BglⅡ：—A↓GATCT— EcRⅠ：—G↓AATTC—
（1）常用特异性地扩增抗除草剂基因的方法是PCR，每次循环一般分为“变性→__________”三步。
（2）启动子的功能是__________。
（3）步骤①应选择限制酶__________切割农杆菌质粒。步骤④的培养基中应添加__________，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株，原因是__________。
（4）经检测，部分转基因甘蓝植株细胞中的目的基因不能表达，科研团队对此现象的观点是：目的基因存在正向与反向两种连接方式。用__________酶对步骤①获得的重组质粒进行切割，通过凝胶电泳分析产物大小，若出现__________条电泳条带，则说明科研团队的观点正确。
【答案】（1）复性→延伸
（2）RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
（3） ①. BamHⅠ ②. 潮霉素 ③. Ti质粒T－DNA中含有潮霉素抗性基因
（4） ①. BamHⅠ和EcRⅠ ②. 四
【解析】
【分析】分析题图：①为基因表达载体构建，②为将重组质粒导入农杆菌，③为农杆菌侵染愈伤组织，④为植物组织培养。
【小问1详解】
利用PCR扩增目的基因，每次循环一般分为“变性→复性→延伸” 三步。
【小问2详解】
启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
【小问3详解】
由图可知：目的基因的一侧和质粒中都含有BamHⅠ的酶切位点，因此步骤①应选择限制酶BamHⅠ切割农杆菌质粒。Ti质粒的T－DNA中含有潮霉素抗性基因，因此在步骤④的培养基中需要添加潮霉素，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。
【小问4详解】
由图可知：用BamHⅠ酶和BglⅡ酶切割得到的黏性末端相同，均为-GATC，因此剪切后的目的基因能与质粒连接在一起。在构建的重组质粒中，不再有BglⅡ酶的识别位点，但含有BamHⅠ和EcRⅠ酶切位点，酶切位点与目的基因正向和反向连接方式有关（见图）。

若只选一种酶切割基因表达载体，无论目的基因正向连接还是反向连接，均只得到长度180＋25＋20＝225kb的DNA，无法区分目的基因正向连接还是反向连接。若选用BamHⅠ和EcRⅠ酶切割，目的基因正向连接的重组质粒被切成180kb、45kb的两种DNA片段，目的基因反向连接的重组质粒被切成205kb、20kb两种DNA片段，所以电泳应出现四条条带。
(广东省汕头市某校2023-2024学年高三下学期三模)11. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓CATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（ ）
A. 质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割
C. 目的基因和质粒均用限制酶I切割
D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
【答案】A
【解析】
【分析】分析题图：限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，因此限制酶Ⅱ也能作用于限制酶Ⅰ的识别序列。
【详解】限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，可知限制酶Ⅱ能够识别和切割限制酶Ⅰ的识别序列，目的基因的右端限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，目的基因左端是限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，只有用限制酶Ⅱ才能同时将目的基因切割下来；质粒有GeneI和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶I的识别序列和限制酶Ⅱ的识别序列，如果用限制酶Ⅱ切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因，用限制酶Ⅰ切割，则破坏GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA，A正确，BCD错误。
故选A。
(广东省汕头市某校2023-2024学年高三下学期三模)12. 下图为DNA 分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（ ）
A. DNA 连接酶、限制酶、解旋酶
B. 限制酶、解旋酶、DNA连接酶
C. 限制酶、DNA连接酶、解旋酶
D. 解旋酶、限制酶、DNA连接酶
【答案】D
【解析】
【分析】解旋酶：能使DNA分子两条链之间的氢键断裂，使DNA双链打开。
限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
DNA连接酶：连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键。
【详解】①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位，催化磷酸二酯键的形成，即D正确。
故选D。
(广东省汕头市某校2023-2024学年高三下学期三模)13. 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（ ）

A. PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链
B. 电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关
C. 选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接
D. 选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接
【答案】C
【解析】
【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；
B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；
C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误；
D、选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100bp的片段，D正确。
故选C。
(广东省汕头市某校2023-2024学年高三下学期三模)14. 巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是（ ）
A. 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段
B. 第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定
C. 由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D. 如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
【答案】D
【解析】
【分析】PCR技术的原理是细胞内DNA复制，需要模板、原料、能量、酶、引物等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。
【详解】A、两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确；
B、第二轮PCR使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；
C、由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 ，将需要的目的基因扩增出来，C正确；
D、如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。
故选D。
(广东省汕头市2024年高三二模考试)15. 转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗虫基因（crylC）和双T-DNA载体连接（图示连接后双T-DNA部分结构），利用其中的“Cre/LxP”系统培育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的lxP序列并将两个lxP间的序列删除。
图：P—启动子（P1为胚乳特异表达启动子；P2为绿色组织特异性表达启动子）
回答下列问题：
（1）Cre酶与基因工程中的______（工具酶）作用类似。
（2）载体中，T-DNA的作用是转移到被侵染的细胞后__________________，hpt基因（潮霉素抗性基因）和gus基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA共转化植株的筛选，起到基因表达载体中____________（填结构）的作用。
（3）筛选得到双T-DNA共转化成功的植株T0中，hpt基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-1、GH-2和GH-3，自交后得到T1代植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus基因进行PCR检测，产物的电泳结果如下图a。（不考虑减数分裂时发生互换）
①T0代中______（填编号）是T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。
②在答题卡对应图b中画出植株GH-2的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置_____（注：用圆点·表示T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置）
③GH-1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt基因的植株的比例为______。这些植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx。
（4）水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LxP”系统，实现了______，培育了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片______（填“具有”或“不具有”）抗虫的性状。
【答案】（1）限制酶 （2） ①. 整合到染色体（细胞核）DNA ②. 标记基因
（3） ①. GH-3 ②. ③. 3/16
（4） ①. 在胚乳中特异性删除抗虫基因（外源基因/两个lxP间的序列） ②. 具有
【解析】
【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【小问1详解】
由题干信息可知，在“Cre/LxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的lxP序列并将两个lxP间的序列删除，所以Cre酶与基因工程中的限制酶作用类似。
【小问2详解】
载体中，T-DNA的作用是转移到被侵染的细胞后整合到染色体（细胞核）DNA，hpt基因（潮霉素抗性基因）和gus基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA共转化植株的筛选，起到基因表达载体中标记基因的作用。
【小问3详解】
①由题图信息可知，对自交后得到T1代植株进行潮霉素抗性检测，而潮霉素抗性检测为阴性植株，如果T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株，则对叶片的gus基因进行PCR检测时，电泳结果不会出现相应的条带，符合GH-3植株的电泳结果。
②由题图信息可知，先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-2，再结合植株GH-2的T1代叶片gus基因电泳结果可知，抗性检测为阴性，但植株的叶片中都含有gus基因，说明T-DNA1和T-DNA2插入到了一对同源染色体的不同位点，如果插入到了两对同源染色体的不同位置，符合自由组合定律，经过自交后会出现有的叶片含有gus基因，有的叶片不含gus基因，符合GH-1的电泳结果，所以植株GH-2的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置如图：
③根据GH-1的T0代自交的后代T1植株的gus基因电泳结果可知，T-DNA1和T-DNA2插入到了两对同源染色体的不同位置，符合自由组合定律，亲本为杂合子，所以在T1植株中具有抗虫特性但不含hpt基因的植株的比例为3/4×1/4=3/16。
【小问4详解】
由题干信息可以，在“Cre/LxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的lxP序列并将两个lxP间的序列删除，可以实现了在胚乳中特异性删除抗虫基因（或外源基因或两个lxP间的序列），培育了安全可食用的转基因水稻。GH-1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt基因的植株，这些植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx，所以Tx种子播种后获得的叶片具有抗虫的性状。
(2024年广东省茂名市高三模拟测试)16. 不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（ ）
A. 限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计
B. 据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同
C. 上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸
D. 该不对称PCR过程中需要（26-1）a个限制性引物
【答案】C
【解析】
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
【详解】A、PCR扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计，A正确；
B、当限制性引物的浓度降低，甚至基本耗尽，双链 DNA 的合成速率显著下降，此时非限制性引物将继续引导单链 DNA 的合成，非限制性引物是与乙链结合，故反应的最后阶段只产生初始 DNA 中一条链的拷贝（非限制性引物引导合成的单链），最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，B正确；
C、扩增时耐高温DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3'端，C错误；
D、PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要（26-1）a个限制性引物，D正确。
故选C。
(2024年广东省茂名市高三模拟测试)17. 在DNA体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛选方法，该方法实施的前提条件是载体DNA上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA和pBR322质粒构建基因表达载体，然后导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图1、2所示，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。回答下列问题：
（1）已知限制酶PstI和BamHI识别序列和切点分别是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，为构建重组质粒，图1中，若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，则切割pBR322应该选择限制酶___（填“PstI或”“BamHI”），不选择另外一种限制酶的理由是___。
（2）在某次实际操作中，实验人员将外源DNA片段插入pBR322的BamHI切割位点处，构建了重组质粒，然后导入大肠杆菌中。为检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图2所示的实验。
①结合图2阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是___。该培养基中添加了氨苄青霉素（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒，这是由于___。
②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠杆菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落印迹，然后平移并压在含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，如图2阶段二实验所示。导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含___（填“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由是___。
【答案】（1） ①. PstI ②. PstI和BamHI切割DNA分子产生的末端不能互补，若选择BamHI切割pBR322，则无法与PstI切割的外源DNA片段相互连接
（2） ①. 稀释涂布平板法 ②. pBR322和外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322或外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性 ③. Amp ④. 限制酶BamHI破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长
【解析】
【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，则切割pBR322应该选择限制酶PstI，不选择另外一种限制酶的理由是PstI和BamHI切割DNA分子产生的末端不能互补，若选择BamHI切割pBR322，则无法与PstI切割的外源DNA片段相互连接。
【小问2详解】
①图示中培养基上菌落分布均匀，因此将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是稀释涂布平板法。由于pBR322（空载质粒）和含外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322（空载质粒）或含外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性，因此在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒。
②由于限制酶BamHⅠ破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长，所以导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含Amp的培养基上获取。
(甘肃省西北师范大学附属中学2023-2024学年高三第五次诊断（三模）)18. 猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性肠道传染病。PEDV是一种正链单股RNA病毒，PEDV基因组共编码蛋白21种，这些蛋白共同协调着病毒的复制与增殖。其中Nsp10蛋白对基因组RNA合成以及病毒多聚蛋白的加工有着极其重要的作用。研究人员构建了PEDV Nsp10基因真核表达载体，为进一步探究PEDV Nsp10蛋白的生物学功能以及特性奠定一定的基础。请回答下列相关问题：
（1）对于PEDV而言，基因指的是______。PEDV在细胞中的增殖过程如图1所示。PEDV感染细胞后，其基因组既可作为______翻译出病毒特异的蛋白质，又能够作为模板经过______次复制得到子代病毒的基因组。
（2）Nsp10基因不能直接进行PCR扩增，需要经______过程得到相应的产物再进行PCR扩增。为了便于扩增后的DNA片段与表达载体连接，需在引物的______（填“3'端”或“5'端”）加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是______。
（3）扩增Nsp10基因的特异性引物分别为：
引物Ⅰ序列：5'-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGT-3'，
引物Ⅱ序列：5'-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAAT-3'
下表为几种限制酶的识别序列及其切割位点，图2质粒上的，Ampr代表青霉素抗性基因，其作用是______，rl为复制原点，其余为限制酶切割位点，由此推断切割质粒选择的限制酶是______。

【答案】（1） ①. 有遗传效应的RNA片段 ②. mRNA ③. 2
（2） ①. 逆转录 ②. 5'端 ③. 保证扩增后的DNA片段与表达载体正向连接
（3） ①. 便于重组DNA分子的筛选 ②. EcRⅠ、XhⅠ
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1） 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2） 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子终止子和标记基因等。（3） 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
基因是生物体遗传的基本单位，通常是有遗传效应的DNA片段，PEDV是一种正链单股RNA病毒，因此它的基因为有遗传效应的RNA片段，分析图可知PEDV感染细胞后，其基因组既可作为mRNA翻译出病毒特异的蛋白质，又能够作为模板经过复制得到子代病毒的基因组，因为PEDV是一种正链单股RNA病毒，因此需要2次复制才得到子代病毒的基因组。
【小问2详解】
Nsp10基因是RNA，不能直接进行PCR扩增，需要经逆转录过程得到相应的产物再进行PCR扩增。由于DNA子链是从引物的3’端延伸，而且引物的3’端序列必须与模板链配对，因此在设计引物时，只能在两条引物的5’端加上限制性酶切位点，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，保证扩增后的DNA片段与表达载体正向连接。
【小问3详解】
Ampr代表青霉素抗性基因，在基因表达载体中作为标记基因存在，便于重组DNA分子的筛选。扩增Nsp10基因的特异性引物分别为： 引物Ⅰ序列：5'-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGT-3'， 引物Ⅱ序列：5'-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAAT-3'，两种引物上分别有EcRⅠ、XhⅠ的识别序列，由此推断切割质粒选择的限制酶是EcRⅠ、XhⅠ。
2024届黑龙江省部分学校高三冲刺卷（五）生物试题19. 尖孢镰刀菌容易引起番茄枯萎症，对农业造成巨大损失。为研究F基因（目基因）的功能，科学家利用同源重组交换的原理对F基因敲除，分析其生物学功能及致病力。基因敲除过程是先构建基因敲除载体，将基因敲除载体导入受体细胞，经过筛选找出基因敲除成功的受体细胞。基因敲除原理如下图所示：
注：Hygr为潮霉素抗性基因；A、B为实现同源重组交换的序列，C、D、E、G为其他不同的基因片段；1～6为引物。
（1）选取限制酶____、____分别对F基因左右两端A、B片段进行酶切，并用____酶将A、B片段与潮霉素抗性基因连接，构建目的基因敲除载体。同时需要在潮霉素抗性基因前添加启动子，启动子的作用是____。
（2）把构建好的目的基因敲除载体导入尖孢镰刀菌细胞内，导入成功后，将菌液放在含____的固体培养基上培养，使用的接种方法是____。在这一过程中，F基因与潮霉素抗性基因发生同源重组交换，与____（填减数分裂时期）的某些行为类似。
（3）培养完毕，挑取单菌落提取其基因组DNA作为模板，选择引物____进行PCR扩增，其中引物会结合在DNA片段的____（3'或5'）端，扩增30个循环进行电泳，如果没有F基因条带，则确定目的基因敲除成功。
（4）潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌中表达的原因是____。
【答案】（1） ①. KpnI/XhI ②. SmaI/XbaI ③. DNA连接 ④. RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录，使潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌细胞内表达
（2） ①. 潮霉素 ②. 平板划线法或稀释涂布平板法 ③. 减数分裂Ⅰ前期
（3） ①. 引物1、2 ②. 3’
（4）生物界共用一套遗传密码子
【解析】
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：①目的基因的获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测与鉴定。2、PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 。
【小问1详解】
选取限制酶KpnI/XhI对A片段进行酶切，选取限制酶SmaI/XbaI对B片段进行酶切。需要用DNA连接酶将A、B片段与潮霉素抗性基因连接。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录，能够使潮霉素抗性基因在尖孢镰刀菌细胞内表达。
【小问2详解】
导入完成后，潮霉素抗性基因与F基因完成重组替换，受体细胞就具有抗潮霉素的特性，所以用潮霉素进行筛选转化的受体细胞。得到单菌落的接种方法有平板划线法或稀释涂布平板法。减数分裂过程中，发生类似于潮霉素抗性基因替换目的基因的过程，是减数分裂Ⅰ前期（或四分体时期）的互换。
【小问3详解】
用基因敲除成功的基因组DNA为模板，由于子链延伸方向是5’到3’，所以引物会结合在DNA片段的3’端。如果敲除成功，那么尖孢镰刀菌无F基因，用引物1和2是无法扩增出F基因的。
【小问4详解】
由于生物界共用一套遗传密码子，所以潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌中表达。
2024届黑龙江省部分学校高三冲刺卷（五）生物试题20. 在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量的有害物质H2O2，PIP2s为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输。我国的科研团队首次发现了植物细胞中AT1基因编码的AT1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理如图一所示。图二表示通过“PCR替换个别核苷酸获得突变基因”的定点突变技术，且个别核苷酸差异不影响引物与模板链的结合。回答下列问题：
（1）盐碱环境可引起大多数作物细胞内液渗透压_______，吸水能力_______。图一中植物细胞中AT1基因编码的AT1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理为______。
（2）通过PCR替换个别核苷酸诱导AT1基因突变时，引物_______中含有特定的突变，为防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对_____、______用于合成PCR产物1和PCR产物2；然后将PCR产物1和2加入无引物的PCR反应体系得到含有点突变的目的基因。再用引物对________扩增目的基因，得到大量的点突变目的基因。
（3）为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，对引物1和引物4的要求是_____。
（4）若将点突变目基因导入棉花细胞，我国科学家自己独创的方法是______。要检测是否成功表达，可以从转基因生物个体中提取蛋白质，用相应的抗体进行_______杂交。
【答案】（1） ①. 上升 ②. 增强 ③. PIP2s是一种水通道蛋白，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，抑制H2O2外排
（2） ①. 2和3 ②. 1和2 ③. 3和4 ④. 1和4物种多样性减少，群落优势度增大
（3）均带有该限制酶识别序列
（4） ①. 花粉管通道法 ②. 抗原—抗体
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。(4) 目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
盐碱环境可引起大多数作物细胞内液渗透压上升，吸水能力增强，图一中植物细胞中PIP2s是水通道蛋白的一种，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，抑制H2O2外排，导致细胞抗氧化胁迫减弱，最终死亡。
【小问2详解】
据图二可知，引物2和引物3中含有特定的突变，由PCR产物1和PCR产物2的位置分析可知，为了防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对为1和2、3和4，要扩增发生突变的目的基因，需要用能与目的基因两侧发生碱基互补配对的引物，即引物1和4。
【小问3详解】
因为目的基因两侧没有某种限制酶的酶切位点，所以为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，应该在引物1和4均带上该限制酶识别序列。
【小问4详解】
若将目的基因导入棉花细胞的方法很多，其中花粉管通道法是我国科学家自己独创的。要检测目的基因是否成功表达，即检测相关蛋白质是否合成，需要从转基因生物个体中提取蛋白质，可通过抗原-抗体杂交方法检测目的基因是否表达成功。氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
精氨酸
AGA
丝氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
终止
UGA
生物质原料
降解率（%）
协同系数
酶A
酶B
酶C
混1
混2
混1
混2
小麦秸秆
7.08
603
8.19
861
26.98
74.33
114.64
玉米秸秆
2.62
1.48
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉米芯
0.62
0.48
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NtⅠ
识别序列及切割位点





限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHⅠ
5'-G↓GATCC-3'
EcRⅠ
5'-G↓AATTC-3'
XhⅠ
5'-C↓TCGAG-3'