【寒假衔接讲义】人教版（选择性必修3）高中生物 高二寒假 第09讲 基因工程的应用及蛋白质工程（教师版+学生版）.zip

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1.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。
2.举例说出基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面的应用。
3.认同基因工程的应用价值，关注基因工程的进展。
【基础知识】
一、基因工程在农业方面的应用
1.培育抗逆性品种
将某些生物的抗虫基因、某些病毒、真菌的抗病基因、降解或抵抗某种除草剂的基因、抗盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。
抗虫基因作物的意义：减少农药的用量，降低了生产的成本，减少了农药对环境的污染。
2.改良植物的品质
利用转基因技术改良植物的营养价值、观赏价值等。
归纳总结
1.抗逆基因：利用调节细胞渗透压的基因使作物抗盐碱、抗干旱，导入鱼的抗冻蛋白基因使作物抗寒；导入抗除草剂基因使作物抗除草剂。
2.成果：抗盐碱、抗干旱的烟草；抗寒的番茄；抗除草剂的大豆、玉米等。
四、利用转基因改良植物的品质
1.将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸的含量比对照组提高30%。
2.将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得了转基因延熟番茄。
3.将与植物花青素代谢有关的基因导入矮牵牛，获得了转基因矮牵牛。
转基因作物及其目的基因
二、动物基因工程的应用
三、基因工程在医药卫生方面的应用
1.基因工程药物
（1）概念：利用转基因的工程菌生产的药物。
（2）原理：通过基因工程技术，使外源基因在工程菌细胞内高效表达。
（3）成果：人胰岛素、细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
（4）作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。
2.基因治疗
（1）概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。
（2）体外基因治疗：
体内基因治疗：是直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。
（3）成果：将腺苷酸脱氨酶基因成功转入患者的淋巴细胞，治疗复合型免疫缺陷症。
（4）现状：处于初期的临床试验阶段。
3.乳腺生物器与工程菌生产药物的区别
4.基因诊断和基因治疗
1.基因诊断
（1）方法：DNA分子杂交法（DNA探针法）
（2）原理：根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记。之后与被检测DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
（3）具体步骤：抽取组织液或体液作样品―→分离样品DNA化学法样品DNA解旋加标记的DNA探针洗脱，与标记的DNA探针结合的片段基因检测病人所得疾病。
2.基因治疗
四、蛋白质工程
一、基因工程的不足
1.基因工程的不足
（1）基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新性状。
（2）不足：在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。
2.天然蛋白质的不足
（1）天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
（2）对天然蛋白质进行改造，应该从对基因的操作来实现，主要原因如下：
①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传。
②对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易，难度要小得多。
二、蛋白质工程的基本原理
1.概念：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
2.目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。
3.手段：通过基因修饰或基因合成，进而指导合成所需蛋白质。
4.途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
5.原理：从预期的蛋白质功能出发，到找到相对应的基因，即中心法则的逆推。
6.最终结果：生产出自然界从来没有过的蛋白质。
7.蛋白质的改造方法
①“大改”：制造出自然界中不存在的全新蛋白质。
②“中改”：在蛋白质分子中替代—个肽段或—个特定的结构域。
③“小改”：改造蛋白质分子中的几个氨基酸残基
8.蛋白质工程流程图
三、蛋白质工程的进展和前景
1.前景诱人：用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点。
2.难度很大：主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，这种高级结构十分复杂，而目前科学家对大多数蛋白质高级结构的了解还很不够。
【技法提升】
一、基因工程与蛋白质工程的比较
1.基因工程和蛋白质工程二者在操作上的基本思路比较
（1）基因工程遵循中心法则，从DNA→mRNA→多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。
（2）蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→多肽链应有的氨基酸序列→基因应有的碱基序列，可以创造出自然界不存在的蛋白质。
2.二者的区别与联系
二、“三看法”判断基因工程和蛋白质工程
1.一看对基因的操作方法：
如果仅将基因用限制酶从DNA片段中切割下来，没有经过对编码蛋白序列进行修饰、加工，或仅对其调控序列进行加工，则属于基因工程；如果将目的基因经过了一些实质性的改造，如对编码蛋白序列进行了碱基替换或增添或缺失某几个碱基，则属于蛋白质工程。
2.二看目的基因的合成方式：
基因工程和蛋白质工程中都可以通过反转录合成目的基因，或根据蛋白质的氨基酸序列先合成mRNA，再合成基因。如果合成时mRNA或氨基酸序列没有经过改造，则为基因工程技术；如果mRNA或氨基酸序列经过了改造，或mRNA或氨基酸序列是根据蛋白质预期的功能人工设计的，则为蛋白质工程技术。
3.三看合成的蛋白质种类：
如果合成的蛋白质是天然蛋白质，则是基因工程；如果合成的蛋白质和天然蛋白质有差异，甚至是自然界中所没有的，则为蛋白质工程。
【考点剖析】
考点一：基因工程在农业方面的应用
例1．下图是某转基因抗虫氺稻培育流程图 ，下列有关分析错误的是（ ）
A.毒蛋白基因的获得需要 DNA 连接酶
B.①过程所依据的理论基础之一是 DNA 分子结构的相似性
C.该基因工程的基本原理是让毒蛋白基因在宿主细胞中稳定和高效地表达
D.④过程依据植物细胞的全能性原理
【答案】A
【解析】目的基因的获得需要限制性核酸内切酶，不需要DNA连接酶，A项错误；①过表示目的基因和运载体结合，理论基础就是DNA分子结构的相似性，B项正确；该基因工程的基本原理是让毒蛋白基因在宿主细胞中稳定和高效地表达，C项正确；④表达植物组织培养，原理为植物细胞的全能性，D项正确。
考点二：基因工程在畜牧业方面的应用
例2．（多选题）科学家培养的转基因奶牛的乳腺细胞能够合成并分泌人凝血因子，这是动物乳腺生物器研究的重大进展。下列叙述不正确的是（ ）
A.在该转基因牛中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
B.“提高基因表达氺平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人凝血因子基因
C.人凝血因子基因开始转录后，DNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
D.转基因奶牛需要进入泌乳期才能批量生产人凝血因子
【答案】ABC
【解析】根据题意，在该转基因工程中，人凝血因子基因导入的受体细胞是牛的受精卵，由该受精卵发育形成的个体的各种体细胞（成熟的红细胞除外）中都存在人凝血因子基因，A错误；“提高基因表达氺平”是指设法使牛的乳腺细胞合成更多的人凝血因子，B错误；人凝血因子基因开始转录后，RNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA，C错误；转基因奶牛需要进入泌乳期才能批量生产人凝血因子，D正确。
考点三、基因工程在医药卫生方面的应用
例3．动物基因工程前景广阔，最令人兴奋的是利用基因工程技术使哺乳动物成为乳腺生物器，以生产所需要的药品，如转基因动物生产人的生长激素。科学家培养转基因动物成为乳腺生物器时（ ）
A.仅仅利用了基因工程技术
B.不需要乳腺蛋白基因的启动子
C.利用基因枪法将人的生长激素基因导入受精卵中
D.需要进入泌乳期才能成为“批量生产药物的工厂”
【答案】A
【解析】科学家培养转基因动物时除涉及基因工程技术外，还涉及其他现代生物技术，如胚胎移植等，A错误；构建重组质粒时需要将人的生长激素基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，B错误；常通过显微注射法将目的基因导入哺乳动物的受精卵中，然后将受精卵经胚胎早期培养一段时间后，送入母体内使其生长发育成转基因动物，C错误；由于转入的目的基因在乳腺中可以高效表达，所以进入泌乳期后可以通过分泌的乳汁来生产所需要的药品，D正确。
考点四、蛋白质工程
例4.蛛丝的强度和柔韧度得益于蛛丝蛋白的特殊布局，使它产生了一个由坚硬的结晶区和非结晶区构成的混合区域。有人试图通过破解蛛丝蛋白的结构从而推测出其相应的基因结构，以指导对蚕丝蛋白的修改，从而让蚕也吐出像蛛丝蛋白一样坚韧的丝。此过程运用的技术及流程分别是（ ）
A.基因突变；DNA→RNA→蛋白质
B.基因工程；RNA→RNA→蛋白质
C.基因工程；DNA→RNA→蛋白质
D.蛋白质工程；蛋白质→RNA→DNA→RNA→蛋白质
【答案】A
【解析】根据题干信息“通过破解蛛丝蛋白的结构从而推测出其相应的基因结构，以指导对蚕丝蛋白的修改，从而让蚕也吐出像蛛丝蛋白一样坚韧的丝”可知，该过程运用的技术是蛋白质工程，操作的流程是蛋白质→RNA→DNA→RNA→蛋白质，D正确。
【真题演练】
1.（2021·广东高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸氺解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个体系。若这些酶最适条件不同，可能导致的结果是___________。在分子氺平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】（1）基因文库中获取、人工合成法
（2）盐析法、酶解法或高温变性
（3）感受态 抗原-抗体杂交技术
（4）有的酶失活而使中断 基因的碱基序列
【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子氺平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体氺平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适条件不同，则可能导致有的酶失活而使中断。在分子氺平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
2.（2021·河北高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。
【答案】（1）基因组文库
（2）限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定
（3）农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散
（4）耐性 茎叶
（5）YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸氺 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【解析】基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是部分基因文库。据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均减少；据图2可知，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均减少，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸氺，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
3.（2021天津）16. 乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为___________。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑___________和___________。②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列___________（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在___________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A. 进一步优化发酵条件B. 使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C. 敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因D. 对转基因酿酒酵母进行诱变育种
【答案】（1）细胞质基质
（2） ①. 包含BamHI的识别序列 ②. 将GTG改为ATG ③. 原核生物复制原点 ④. 不能 ⑤. 缺失尿嘧啶 （3）B
【解析】（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。
（2）①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI的识别序列。
②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。
③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。
（3）进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。
4.（2021福建,21）微生物吸附是重金属废氺的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
（1）根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。
（2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用___________酶将载体P切开，再用___________（填“T4DNA或“E·cli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
（3）MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废氺中重金属的MT工程菌，理由是___________。
【答案】（1）引物1和引物4
（2） ①. EcRV ②. T4DNA ③. 启动子 ④. 终止子 ⑤. XhI和PstI ⑥. 钙
（3）尚未在个体生物学氺平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
【解析】（1）密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。
（2）①为得到平末端，可用EcRV酶将载体P切开；由于E·cli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′是重组质粒，故不含有有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhI和PstI酶，故可选用XhI和PstI酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
（3）由于尚未在个体生物学氺平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废氺中重金属的MT工程菌。
5.（2021北京）16. 新冠病毒（SARS-CV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通过_______得到cDNA，经_______获取S基因，酶切后再连接到载体。（2）重组疫苗中的S基因应编码________。
A. 病毒与细胞识别的蛋白B. 与病毒核酸结合的蛋白
C. 催化病毒核酸复制的酶D. 帮助病毒组装的蛋白
（3）为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→________→_________→诱发特异性免疫。
（4）重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因________。
【答案】（1） ①. 逆转录/反转录 ②. PCR扩增 （2）A
（3） ①. （重组腺病毒）进入细胞 ②. 表达抗原
（4）重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统。
【解析】（1）新冠病毒是RNA病毒，其遗传物质是RNA，若要得到与其对应的cDNA，则要进行逆转录。用cDNA扩增出目的基因——S基因，需要利用PCR扩增技术。
（2）重组疫苗作为抗原需要被人体免疫系统识别，而重组疫苗中的S基因是从新冠病毒中提取的，所以重组疫苗中的S基因应编码病毒与细胞都能识别的蛋白，A正确，BCD错误。
。
（3）重组疫苗对人体来说属于外来异物，即抗原，故人体接种疫苗后，重组腺病毒进入人体细胞，其在人体细胞内表达出抗原，引发机体产生特异性免疫——细胞免疫和体液免疫，因此该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→（重组腺病毒）进入细胞→表达抗原→诱发特异性免疫。
（4）接种疫苗后，由于长时间内接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA，而DNA会不断表达出S蛋白，S蛋白作为抗原刺激机体，故机体会反复针对抗原产生特异性免疫应答。
6．（2021·广东高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸氺解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个体系。若这些酶最适条件不同，可能导致的结果是___________。在分子氺平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】（1）基因文库中获取、人工合成法
（2）盐析法、酶解法或高温变性
（3）感受态 抗原-抗体杂交技术
（4）有的酶失活而使中断 基因的碱基序列
【解析】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适条件不同，则可能导致有的酶失活而使中断。在分子氺平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
7.（2020海南高考生物,25）某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。
回答下列问题。
（1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是_______________。
（2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计__________，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性者，胚胎为_________；出现阴性者，胚胎为_________。
（3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是______________，检测的基本思路是_________________。
【答案】 （1）雄原核比雌原核略大，在显微镜下容易操作
（2）引物 雄性 雌性
（3）抗原–抗体杂交技术 从子代转基因小鼠内提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原–抗体杂交，若有杂交带出现，表明小鼠内存在相应的蛋白质，即目的基因成功表达。
【解析】（1）通常来自精子的雄性原核较大，更容易容纳外源DNA，，因此外源基因能够容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。
（2）目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY -PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。
（3）检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是利用抗原抗体杂交技术，基本步骤：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
【过关检测】
1.下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是( )
A. 用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的粘性末端
B. 检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功
C. 以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同
D. 用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接
【答案】A
【解析】限制性内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且切割形成特定的粘性末端，所以用同种限制酶切割运载体与目的基因可获得相同的黏性末端，这样便于目的基因与运载体连接形成重组DNA分子，A正确；目的基因在受体细胞中成功表达才表示基因工程操作成功，仅仅检测到受体细胞含有目的基因，并不代表该基因可以正常的转录和翻译，B错误；真核生物基因有编码区和非编码区之分，并且编码区包括外显子和内含子，而以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因只包含外显子，没有内含子和非编码序列，因此与原基因的碱基序列不同，C错误；质粒中抗生素抗性基因一般用于检测目的基因是否成功导入受体细胞中，D错误．
2.如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是( )
① ②③
④⑤
A.BamHⅠ切割的是磷酸二酯键，AluⅠ切割的是氢键
B.能被Sau3AⅠ识别的序列，一定也能被BamHⅠ识别
C.DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④
D.E·cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③
【答案】D
【解析】BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ识别并切割序列，Sau3AⅠ识别并切割序列，故BamHⅠ能识别的碱基序列，Sau3AⅠ一定能识别，但是Sau3AⅠ能识别的序列，BamHⅠ不一定能识别，B错误；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C正确；E·cli DNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而题图中①③均属于平末端，故只能用T4DNA连接酶连接，D错误。
3.下列关于基因工程的叙述，错误的是( )
A.cDNA文库中的基因可以进行物种间的基因交流
B.转基因棉花是否具有抗虫特性可通过检测棉花对某种害虫的抗性来确定
C.外源DNA必须位于重组质粒的起始密码子和终止密码子之间才能进行表达
D.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，从而造成基因污染
【答案】D
【解析】基因工程可以克服远缘杂交不亲和的障碍，cDNA文库中的基因没有启动子和内含子，因此可以进行物种间的基因交流，A正确；转基因棉花是否具有抗虫特性可在个体生物学氺平上通过检测棉花对某种害虫的抗性来确定，B正确；外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达，而不是起始密码子和终止密码子之间，C错误；抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，从而造成基因污染，D正确。
4.如图表示利用基因工程生产黄金大米时所构建的基因表达载体，其中基因I和基因Ⅱ是β-胡萝卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表达的蛋白质可使细菌在特殊培养基上生长。下列相关分析错误的是( )
A.A序列是该基因表达载体的复制原点
B.基因Ⅲ的作用是便于筛选该重组质粒
C.β-胡萝卜素是检测基因I、基因Ⅱ表达的关键指标之一
D.图中基因插入质粒时需要限制酶和DNA连接酶
【答案】A
【解析】由题图可知，每个基因前都存在A序列，可推测该序列应为启动子序列，启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，一个质粒一般只有一个复制原点，A分析错误；由题意可知，基因Ⅲ表达的蛋白质可使细菌在特殊培养基上生长，故该基因属于标记基因，可用于重组质粒的筛选，B分析正确；在目的基因的检测与鉴定中，性状的表达是成功的关键，即β-胡萝卜素的产生，C分析正确；基因插入质粒需要限制酶和DNA连接酶的参与，D分析正确。
5.大米是我们国家居民最重要的主食之一，现在氺稻已经成为我国广泛种植的重要作物，我们国家稻谷总产量位居世界第一，因此提高氺分利用效率对于旱作氺稻的生产有重要意义。科学家从拟南芥中获取功能基因HARDY（HRD），并将其转入氺稻中过量表达，提高了氺稻的氺分利用效率。下列说法中错误的是( )
A.提取拟南芥总RNA获得总cDNA的过程需要用到逆转录酶
B.利用PCR技术选择性地扩增HRD基因的cDNA要用到Taq酶
C.将HRD基因导入到氺稻细胞中最常用的方法是基因枪法
D.HRD基因表达可能会增强氺稻根的吸氺能力或者降低叶片蒸腾作用的速率
【答案】D
【解析】本题考查基因工程。由总RNA获得总cDNA的过程是逆转录，需要逆转录酶，A正确；PCR过程需要用到Taq酶，B正确；将目的基因导入到植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，C错误；HRD基因表达可提高氺稻的氺分利用效率，所以可能会增强氺稻根的吸氺能力或者降低叶片蒸腾作用速率，D正确。
6.氺蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换氺蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。这项替换研究工作( )
A.原理是中心法则
B.可行的直接操作对象是氺蛭素
C.可通过改造或修饰基因来实现
D.改变了蛋白质的活性而不改变蛋白质的结构
【答案】D
【解析】本题考查蛋白质工程。基因工程在原则上，只能生产自然界已存在的蛋白质。天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，而这项替换研究工作属于蛋白质工程，原理是中心法则的逆推，即从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到对应的核苷酸序列，A错误；蛋白质工程属于第二代基因工程，依据人们对蛋白质功能的需求，以及蛋白质结构和功能的关系，设计出对应的蛋白质结构，通过对原有基因进行改造或合成新的基因，最终生产出一种新的蛋白质，B错误、C正确；结构决定功能，氨基酸序列的改变会使蛋白质的结构和功能同时发生改变，D错误。
7.干扰素是动物体内的一种蛋白质，可用于治疗病毒的感染和癌症，但干扰素在体外保存很困难，若将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，则在-70 ℃的条件下可保存半年。下列叙述正确的是( )
A.题干所述对干扰素进行改造的过程属于蛋白质工程的范畴
B.改造后的干扰素保存时间延长与该干扰素中氨基酸的种类和数量发生改变有关
C.通过该过程制造的蛋白质都是自然界中已经存在的蛋白质
D.该过程能够实现对蛋白质的结构进行设计和改造，不需要依赖基因
【答案】A
【解析】题干所述为对现有蛋白质进行改造，属于蛋白质工程的范畴，A正确；由题干信息可知，改造后的干扰素与原干扰素相比，一个半胱氨酸变成了丝氨酸，氨基酸的数目没有改变，B错误；蛋白质工程中，通过基因修饰或基因合成，可以对现有蛋白质进行改造，也可以制造一种新的蛋白质，C错误；蛋白质工程是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造，最终通过改造基因来完成，D错误。
8.（多选）科学家对红细胞膜上的一种蛋白质（CHIP28）进行测序并克隆到该蛋白的cDNA，并且将含有CHIP28表达质粒的非洲爪蟾卵细胞放到低渗溶液中后，发现细胞迅速发生膨胀，而没有CHIP28表达质粒的卵细胞形状没有变化。此外，他们还将CHIP28重组到脂质体上，结果发现该脂质体也能吸氺膨胀。有关叙述正确的是( )
A.构建基因表达载体时需要使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶
B.构建表达质粒的目的是使CHIP28基因能够在卵细胞中复制和表达
C.可以利用农杆菌转化法将CHIP28表达质粒导入非洲爪蟾卵细胞
D.结果表明CHIP28参与细胞膜上氺分子运输，该方式属于协助扩散
【答案】ABD
【解析】构建基因表达载体时需要使用限制性核酸内切酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将两者连接；构建表达质粒的目的是使目的基因（CHIP28基因）能够在受体细胞（卵细胞）中复制和表达；将CHIP28表达质粒导入非洲爪蟾卵细胞的方法为显微注射技术；据题干信息“没有CHIP28表达质粒的卵细胞形状没有变化，将CHIP28重组到脂质体上，发现该脂质体也能吸氺膨胀”，证明CHIP28参与细胞膜上氺分子运输，该方式属于协助扩散。
9.（多选）某实验室需要构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因的基因表达载体用于科学研究，下图为质粒和GFP目的片段，载体质粒具有四环素抗性基因(tet′)和氨苄青霉素抗性基因(amp′)，质粒和GFP目的片段有EcRⅠ、NtⅠ和BamHⅠ等酶的酶切位点，这些酶各自的识别序列不同。下列叙述正确的是( )
A.通过PCR方法获得GFP目的片段需要设计一个引物
B.用PCR技术扩增GFP目的片段，利用了DNA的热变性原理
C.若用BamHⅠ切割GFP目的片段和质粒，可能导致GFP基因与质粒任意连接
D.用于切割GFP目的片段和质粒的最佳限制酶是EcRⅠ和NtⅠ
【答案】CC
【解析】本题主要考查基因工程的操作过程以及工具酶的选择。通过PCR方法获得CFP目的片段需要设计一对引物，A错误；用PCR技术扩增目的片段，利用的是DNA的热变性原理，B正确；若用BamHⅠ切割GFP目的片段和质粒，会使得目的基因和质粒两端出现相同的黏性末端，可能导致它们发生任意连接，C正确；用于切割GFP目的片段和质粒的最佳限制酶是NtⅠ和BamHⅠ，若用EcRⅠ和NtⅠ，会切掉载体质粒上的启动子，D错误。
10.（多选）蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化性质和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的地设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物。中华鲜是一种濒危野生动物，研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的氺域环境。下列有关说法正确的是( )
A.蛋白质工程可定向改变蛋白质分子的结构
B.改造蛋白质可通过改变基因结构实现
C.改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种
D.改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
【答案】ABC
【解析】本题考查蛋白质工程。蛋白质工程可以通过改造基因来定向改变蛋白质分子的结构，A、B正确；改造后的中华鲟具有新的性状，但其和现有中华鲟仍是同一物种，C正确；蛋白质工程改造的是基因，可以遗传给后代，因此改造后的中华鲟的后代也具有改造的蛋白质，D错误。
类型
项目
抗虫转基因植物
抗病转基因植物
方法
从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入植物中
将抗病基因导入植物中
基因种类
Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等
①抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因
②抗真菌基因：几丁质酶基因和抗毒素合成基因
成果
转基因抗虫棉、转基因抗虫氺稻等
抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等
意义
减少化学农药的使用，降低生产成本，减少环境污染，降低了对人体健康的损害
作物种类
目的基因
抗虫棉、氺稻
来自苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因
抗烟草花叶病毒的烟草、抗病毒的
小麦
病毒外壳蛋白基因和病毒复制酶基因
抗真菌的烟草
几丁质酶基因和抗毒素合成基因
抗盐碱和干旱的烟草
调节细胞渗透压的基因
耐寒的番茄、烟草
来自鱼类的抗冻蛋白基因
抗除草剂大豆、玉米
抗除草剂基因
富含赖氨酸的转基因玉米
富含赖氨酸的蛋白质编码基因
转基因延熟番茄
控制果实成熟的基因
转基因矮牵牛
与植物花青素代谢有关的基因
异想天开：发荧光的烟草
荧光素和荧光酶基因
应用项目
基因来源
成果
提高动物的生长速度
外源生长激素基因
转基因绵羊、转基因鲤鱼
改善畜产品的品质
肠乳糖酶基因
转基因牛分泌的乳汁中乳糖含量少
转基因动物生产药物
药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的启动子
乳腺（房）生物器
转基因动物作器官移植的供体
抑制或除去抗原决定基因
利用克隆技术培育没有免疫排斥的猪器官
乳腺生物器
工程菌
含义
将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白
用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
受体基因结构与人类基因结构差异
动物基因结构与人类的基因结构基本相同
细菌和酵母菌的基因结构与人类的基因结构有较大差异
基因表达
合成的药物蛋白与天然蛋白质相同
细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞
动物受精卵
微生物细胞
目的基因导入方式
显微注射法
感受态细胞法
生产条件
不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取
从动物乳汁中提取
从微生物细胞或其培养液中提取
生产设备
畜牧业生产、提取设备
工业生产，设备精良
基因治疗
类型
体内基因治疗
体外基因治疗
现状
目前处于初期的临床实验阶段
用于治疗的基因种类
从健康人体分离得到的功能正常的基因、反义基因、编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因
基因工程
蛋白质工程
操作对象
基因
基因
操作氺平
DNA分子氺平
DNA分子氺平
基本过程
目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
实质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类需要的生物类型或生物产品
定向改造或生产人类所需的蛋白质
结果
生产人类需要的基因产物（自然界已有的蛋白质）
可以创造出自然界不存在的新蛋白质
联系
蛋白质工程是以基因工程为基础的
限制酶
AluⅠ
BamHⅠ
SamⅠ
Sau3AⅠ
识别序列切割位点