清单10 基因工程与育种电泳PCR原理依据相结合-备战2025年高考生物二轮热点背练清单（新高考通用）

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一、基因工程与育种基础
1. 基因工程操作技术
限制酶的作用及酶切位点分析（如R₁、R₂双酶切载体）
重组质粒的构建与验证（电泳检测、抗生素筛选）
目的基因的克隆与表达（启动子、终止子的功能）
2. 育种技术应用
转基因抗虫作物的培育（如Bt基因导入）
多囊卵巢综合征等疾病模型的基因调控机制
环境DNA（eDNA）技术在种群监测中的应用
二、电泳技术原理与应用
1. 琼脂糖凝胶电泳
电泳原理：带电分子在电场中的迁移规律
电泳结果分析（条带长度与DNA片段大小的关系）
应用案例：验证重组质粒构建、检测酶切产物
2. 限制性酶切图谱分析
单酶切与双酶切策略
电泳图谱判断载体类型（环状/线状DNA）
结合PCR产物的电泳验证（如基因敲除检测）
三、PCR技术原理与实验设计
1. PCR扩增基础
引物设计原则（互补性、方向性）
PCR循环步骤（变性、退火、延伸）
应用场景：目的基因扩增、突变位点引入
2. PCR技术的拓展应用
逆转录PCR（RTPCR）获取cDNA
荧光定量PCR（qPCR）检测基因表达量
定点突变技术（如无缝克隆InFusin技术）
四、综合实验设计与分析
1. 基因工程与电泳结合案例
重组质粒的酶切验证（如HindⅢ、BamHⅠ双酶切）
基因表达载体构建中的电泳筛选（如抗性标记分析）
2. PCR与电泳联合应用
突变基因的检测（如基因D的碱基缺失分析）
转基因植株的基因型鉴定（电泳条带解读）
3. 复杂实验设计
光控基因表达系统的构建（如蓝光诱导的酪氨酸酶表达）
双特异性抗体的开发（CD3与CD87结合位点设计）
电泳结果判断（如限制酶切位点间距计算）
PCR产物分析（引物设计错误的影响）
基因表达载体的构建逻辑（启动子选择、标记基因功能）
基因功能验证实验（如荔枝核皂苷降糖机制）
生态位分化的研究（红外相机监测动物活动节律）
基因编辑技术（CRISPR/Cas9）的应用与评价
结合遗传规律与分子生物学技术（如基因型表型关联分析）
实验设计的科学性与可操作性（如对照组设置、变量控制）
一、单选题
1．（23-24高二下·广东中山·期末）在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R₁和R₂)处理基因表达载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述错误的是（ ）
A．电泳是带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。本实验中，带电分子会向着电荷相反的电极移动
B．该载体最可能是环状DNA，两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R₁和R₂的酶切位点最短相距约200bp，最长相距约600bp
D．需将扩增得到的PCR 产物与内含指示剂的电泳缓冲液混合后加样
【答案】D
【分析】切割DNA的工具是限制酶，它们能够识别双链DNA分子的某种特定脱氧核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
【详解】A、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A正确；
B、由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，这两种限制酶切割产生的DNA片段等长，只有1条片段，故该载体最可能是环状DNA，两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；
C、由题知，两种限制酶同时切割时则产生600bp和200bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200bp，最长相距约600bp，C正确；
D、将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，D错误。
故选D。
2．（2025·湖南永州·二模）每年5至9月，中华鲟能在长江口完成淡海水转换，进入海洋环境。根据其生活史特征和洄游习性，要全面覆盖标记追踪很困难。eDNA（环境DNA）技术是指从环境中提取生物残留的DNA片段，通过PCR扩增后经DNA测序等检测目标生物，确定其数量和分布状况等的检测调查方法。研究人员在5月和8月对长江口水域6个站点的水样进行了eDNA分析，通过PCR方法，推断中华鲟的空间分布范围。下列相关叙述错误的是（ ）
A．eDNA技术与采用标记重捕法调查中华鲟的种群密度相比，该方法的优势是对中华鲟的影响较小
B．应用eDNA技术可在外来入侵物种还未大量繁殖时实施有效管控，在珍稀濒危物种监测方面，传统的标记重捕法也可以达到预期效果
C．eDNA条带出现拖带可能是因为样品里含有中华鲟近亲或其他物种的DNA片段
D．8月eDNA检出率明显低于5月可能是因为中华鲟逐渐迁移到海洋深处生活
【答案】B
【分析】由题意可知，eDNA（环境DNA）技术，通过检测生物体粪便、黏液、血液、皮肤、尿液等释放出的游离在环境中的DNA分子，来确定该生物体是否在调查区域出现，其原理是水生生物不同生命阶段的eDNA检测效率和丰度存在差异。水生生物在繁殖期会向水体释放大量细胞，所以繁殖期eDNA检测易出现峰值。
【详解】A、eDNA技术并未直接影响中华鲟的生活，因此与采用标记重捕法调查中华鲟的种群密度相比，该方法的优势是对中华鲟的影响较小，A正确；
B、水生生物不同生命阶段的eDNA检测效率和丰度存在差异。水生生物在繁殖期会向水体释放大量细胞，所以繁殖期eDNA检测易出现峰值。幼鱼排泄速率更高，幼虾的蜕壳频率更高，也会引起eDNA浓度偏高。因此，通过水体eDNA研究特定生物类群并实施有效管控时，需要依据生物当前所处的生命阶段进行偏差校正，在珍稀濒危物种（尤其是中华鲟这种种群密度极小的物种）监测方面，传统的标记重捕法难以获取必要的样本进行观察，导致其应用可能无法达到预期效果，B错误；
C、每个物种的DNA片段长度不一样，eDNA样品里可能含有中华鲟近亲或其他物种的eDNA片段，在琼脂糖凝胶电泳检测中，eDNA条带会有拖带情况，C正确；
D、若8月中华鲟逐渐迁移到海洋深处生活，会导致eDNA检出率明显低于5月，D正确。
故选B。
3．（23-24高二下·辽宁大连·期末）构建基因表达载体是基因工程的核心步骤。可通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段，初步判断基因表达载体是否构建成功。下图是用限制酶完全酶切后(不考虑相同DNA之间的连接和目的基因的自身环化)的电泳结果。下列叙述错误的是（ ）

A．在特定波长的紫外灯照射下，DNA在琼脂糖凝胶中被检测出来
B．酶切后，相同条件下DNA分子越小，在凝胶中的迁移速率越快
C．泳道1为单酶切空载体后的产物，泳道2为单酶切重组载体后的产物
D．泳道3为双酶切重组载体后的产物，且目的基因与载体正确连接
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、核酸染料加在凝胶中，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，A正确；
B、在凝胶中DNA分子的迁移速度与DNA分子的大小有关，DNA分子越小，迁移速度越快，B正确；
C、泳道1的质粒长度小于泳道2，则泳道1为单酶切空载体，泳道2为单酶切的重组载体，C正确；
D、泳道3有一个条带的大小与泳道1相同，且还有两个较小的条带，则为限制酶A和限制酶B双酶切的重组载体，但是无法判断目的基因与载体是否正确连接，D错误。
故选D。
二、多选题
4．（24-25高三上·辽宁·开学考试）甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（ ）

A．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定
B．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、限制酶、DNA连接酶
C．若构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHⅠ在重组质粒上有4个酶切位点
D．在通过PCR技术从1个cDNA分子中特异性扩增出R蛋白基因时，为得到55条脱氧核苷酸链等长的R蛋白基因，理论上应至少进行6次PCR循环
【答案】CD
【分析】1、图甲中①是逆转录过程，②是经过复制形成双链cDNA，③是将R蛋白基因和质粒结合形成基因表达载体，图乙是用限制酶切割后形成的电泳图。2、PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3＇端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5＇端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3＇端延伸DNA链。3、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】A、不同生物的DNA切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定，A正确；
B、图甲获得重组质粒过程，需要逆转录、形成双链cDNA分子以及R蛋白基因与质粒的重组，所以至少需要应用到逆转录酶、DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶，B正确；
C、用Hind III将质粒2000bp切割后形成了200bp、400bp和1400bp共3个片段，说明Hind III在重组质粒上有3个酶切位点，而用Hind III和BamHl将质粒切割后形成了200bp、420bp、560bp的片段，2000=420×2+560+200×3，所以一共形成了6个片段，因此共有5个酶切位点，因此BamHI在重组质粒上有5-2=3个酶切位点，C错误；
D、通过PCR技术将cDNA分子扩增成双链DNA后，若要从中特异性扩增出完整的R蛋白基因，循环3次可获得2个不含黏性未端的R蛋白基因，循环4次可获得8个不含黏性未端的R蛋白基因，循环5次可获得22个不含黏性末端的R蛋白基因，循环6次可获得52个不含黏性末端的R蛋白基因，为到55条脱氧核苷酸链等长的R蛋白基因，理论上应至少进行7次PCR循环，D错误。
故选CD。
三、非选择题
5．（21-22高二下·江苏盐城·期末）罗格列酮和格列奇特是常见的降糖、降脂药物，主要机制有促进胰岛素的分泌、增强胰岛素敏感性等，但长期服用会导致肝、肾等器官功能损伤。有研究表明荔枝核皂苷也具有降糖、降脂作用，为研究其作用机制，科研人员以正常大鼠和高血脂症-胰岛素抵抗模型大鼠（通过饲喂高脂饲料获得）为对象，分别灌喂适量葡萄糖溶液或葡萄糖-药物混合液2h后，测定血糖等指标，结果如下表。请回答下列问题：
(1)正常大鼠进食后血糖升高，胰岛素分泌增加，促进血糖进入细胞 ，合成糖原或转化为非糖物质，并抑制 及非糖物质转化为葡萄糖。
(2)与正常大鼠相比，模型大鼠血糖、胰岛素均较高的原因分别是 、 。
(3)根据实验结果，荔枝核皂苷降糖机制类似于 （药物），其主要机制是 。
(4)与罗格列酮等西药相比，荔枝核皂苷降糖、降脂具有 的优点。
(5)下图表示人体内E2（一种雌激素）、胰岛素分泌的部分调节过程，器官甲是血糖调节的中枢。请回答下列问题：
①器官甲是 。排卵前，E2含量升高导致器官乙对器官甲分泌的①敏感性升高，有利于合成和分泌E2，这属于 调节（填“正反馈”或“负反馈”）。
②在饥寒交迫时，器官甲一方面可通过分泌 （填激素中文名称）间接升高甲状腺激素的含量，增加产热；另一方面可通过释放 直接调控胰腺中的 细胞分泌 （填激素中文名称），提高血糖浓度。
【答案】(1) 氧化分解 肝糖原分解
(2) 高脂饲喂引起胰岛素敏感指数降低，细胞吸收和利用血糖能力降低 血糖、血脂升高，促进胰岛B细胞合成分泌胰岛素
(3) 罗格列酮 增强胰岛素敏感性
(4)安全、副作用小
(5) 下丘脑 正反馈 促甲状腺激素释放激素 神经递质 胰岛A细胞 胰高血糖素
【分析】分析表格中的数据，罗格列酮、格列奇特和荔枝核皂苷都能够降低血糖和血脂的含量，但罗格列酮和荔枝核皂苷中数据基本相同，说明二者的机制相同，同时表格中最后的数据降低，说明其降低了胰岛素的抵抗性，提高了胰岛素的敏感性，而格列奇特没有提高敏感性，而是通过提高胰岛素含量降低了血糖和血脂。
（1）
胰岛素降低血糖，是促进血糖进入细胞氧化分解，合成糖原或转化为非糖物质，并抑制肝糖原分解成葡萄糖及非糖物质转化为葡萄糖。
（2）
模型大鼠饲喂了高脂饲料，引起胰岛素敏感指数降低，细胞吸收和利用葡萄糖的能力降低，血糖升高，血糖、血脂升高，又促进了胰岛素的分泌，所以胰岛素含量升高。
（3）
根据表格数据可知，罗格列酮能增强胰岛素敏感性，格列齐特促进胰岛素的分泌，荔枝核皂苷主要增强胰岛素的敏感性，所以与罗格列酮类似。
（4）
西药降糖效果较好，但是长期服用会导致器官功能受损等多种并发症。而荔枝核皂苷等中药具有安全、副作用小的特点，适宜于糖尿病辅助治疗。
（5）
①据图可知，器官甲是血糖调节的中枢，名称是下丘脑；排卵前，E2含量升高导致器官乙对器官甲分泌的①敏感性升高，有利于合成和分泌E2，这属于正反馈调节。
②在饥寒交迫时，器官甲下丘脑一方面可通过分泌促甲状腺激素释放激素间接升高甲状腺激素的含量，增加产热；另一方面可通过释放神经递质直接调控胰腺中的胰岛A细胞，使其分泌胰高血糖素，该过程属于神经调节。
6．（23-24高三下·安徽·阶段练习）某地青松林区内自然资源丰富，有国家一级重点保护野生动物紫貂和国家二级重点保护野生动物黄喉貂、黑熊、马鹿等。紫貂、黄喉貂和黄鼬在该林区同域分布，三者均以鸟类、兽类、昆虫、植物为食，紫貂和黄鼬以夜间活动的啮齿目动物为主要食物，而黄喉貂又是紫貂和黄鼬的天敌。探明三者共存机制可为物种的保护和相应管理措施的制定提供重要参考依据，研究者于2019年11月至2021年11月，在林区布设41台红外相机，对这三种动物开展昼夜活动节律的监测。请回答下列问题：

(1)红外相机记录的数据可利用标记重捕法模型直接计算种群密度，该模型中以相同侧面部位的斑纹、体型、毛色等特征作为天然的标记。据此分析，与传统的标记重捕法相比，该方法的优点有 （答出一点）。
(2)若研究该林区红松的生态位，通常要研究红松在研究区域内的 （答出三点）。
(3)据图分析可知，三种动物中 主要在夜间活动，推测出现该现象的原因主要是 （答出两点）。
(4)若黄喉貂是该林区的顶级捕食者，则其同化的能量最终去向为 。
(5)最终研究表明，紫貂、黄喉貂和黄鼬选择不同的昼夜活动节律及不同的栖息地等，说明三种动物产生了生态位的分化，并各自占据稳定的生态位，意义是 。
【答案】(1)减小标记对动物身体或活动造成的影响
(2)出现频率、种群密度、植株高度等特征，以及它与其他物种的关系等
(3) 紫貂与黄鼬 躲避昼行性动物黄喉貂等天敌，降低被捕食的风险；更易捕获夜间活动的啮齿目动物
(4)呼吸作用散失、分解者利用
(5)有利于不同生物充分利用环境资源
【分析】生态位：(1)概念：一个物种在群落中的地位和作用，包括所处的空间位置，占用资源的情况以及与其他物种的关系等。(2)研究内容：①植物：在研究领域内的出现频率，种群密度、植株高度以及与其他物种的关系等。②动物：栖息地、食物、天敌以及与其他物种的关系等。(3)特点：群落中每种生物都占据着相对稳定的生态位。(4)原因：群落中物种之间以及生物与环境间协同进化的结果。(5)意义：有利于不同生物充分利用环境资源。
【详解】（1）红外相机拍摄以动物的相同侧面部位的斑纹、体型、毛色等自身特征为天然标记，可以减小标记对动物身体或活动造成的影响。
（2）研究植物的生态位，需要研究其出现频率、种群密度、植株高度等特征，以及它与其他物种的关系等。
（3）据图可知，紫貂与黄鼬主要在夜间活动，黄喉貂主要在白日活动；由题干信息可知，紫貂和黄鼬以夜间活动的啮齿目动物为主要食物，而黄喉貂又是紫貂和黄鼬的天敌。故紫貂和黄鼬在夜间活动是为了躲避昼行性动物黄喉貂等天敌，降低被捕食的风险，同时更易捕获夜间活动的啮齿目动物。
（4）生物同化能量的最终去向包括呼吸作用散失、分解者利用以及流入下一营养级。黄喉貂是顶级捕食者，所以其能量最终去向为呼吸作用散失和分解者利用。
（5）生态位分化的意义是有利于不同生物充分利用环境资源。
7．（24-25高三上·重庆·阶段练习）驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路。回答下列问题：
(1)构建基因表达载体的过程中需要用到的工具酶有 。
(2)研究者利用T7噬菌体来源RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图甲，载体的部分结构见图乙)。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色,启动子①②③依次为 (填“PT7、PBAD和PBAD”或“PBAD、PT7和PT7”),理由是 。
(3)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(4)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述基因表达载体的构建模式提出一个简单思路： 。(答出要点即可)
【答案】(1)限制酶和DNA连接酶
(2) PT7、PBAD 和PBAD 基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
(4)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶/将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）构建基因表达载体，首先要用一定的限制酶切割载体，使载体出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因的片段插入载体的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，再加入DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。构建基因表达载体的过程中需要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶；
（2）题图分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD；
（3）细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色；
（4）题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
8．（24-25高二上·山东青岛·阶段练习）激素、神经递质等信息分子帮助生命体形成一个复杂的调节网络。图1是人体内部分信息分子的作用示意图，字母A-D表示信息分子，①～③表示生理过程；多囊卵巢综合征以双侧卵巢增大、胰岛素抵抗和雄激素产生过剩为特征，是生育年龄妇女最常见的内分泌疾病。下图2为多囊卵巢综合征患者发病机制示意图。请回答问题。
(1)图1中信息分子A是指 ；①过程中减少散热的途径有 。
(2)图1中，②过程的具体途径有 。信息分子D是指 ，在③过程中，它发挥作用后能够使细胞外液渗透压下降，其作用原理是 。
(3)图2中雄激素的分泌过程受到“下丘脑—垂体—性腺轴”的调节，这属于 调节，这种调节方式的意义是 。雄激素可在血液中检测含量的理由是 。
(4)胰岛素抵抗是指组织细胞对胰岛素不敏感，多囊卵巢患者体内胰岛素的分泌量 正常值，长期如此会出现多尿现象，原因是 。
【答案】(1) 神经递质 皮肤血管收缩、汗腺分泌减少
(2) 胰高血糖素促进肝糖原分解成葡萄糖 抗利尿激素 促进肾小管和集合管对水的重吸收
(3) 分级 可以放大激素的调节效应，形成多级反馈调节，有利于精细调控，维持机体的稳态 雄激素会随血液循环运输到全身各处
(4) 高于
原尿中葡萄糖浓度过高，渗透压增大，肾小管和集合管对水的重吸收减少，尿量增多
【分析】图1中，下丘脑参与体温调节、血糖调节和渗透压调节；
图2中，卵巢分泌雄激素受下丘脑-垂体-卵巢的分级调节，另外胰岛素还能对卵巢和垂体进行调节，促进卵巢和垂体分泌相应激素。
【详解】（1）图1中A表示神经递质，①过程中机体通过促进皮肤血管收缩，减少血流量以及减少汗腺分泌的方式减少散热。
（2）②过程中胰高血糖素通过促进肝糖原分解成葡萄糖来升高血糖。在③过程中，抗利尿激素作用于肾小管和集合管，促进肾小管和集合管对水的重吸收，降低细胞外液的渗透压。
（3）下丘脑-垂体-性腺轴属于分级调节，该调节方式可以放大激素的调节效应，形成多级反馈调节，有利于精细调控，维持机体的稳态。雄激素可以通过血液循环运输到全身各处，故可以通过抽血检测其含量。
（4）多囊卵巢综合征以双侧卵巢增大、胰岛素抵抗和雄激素产生过剩为特征，胰岛素可以促进垂体和卵巢的分泌活动，雄激素的产生过剩与患者体内胰岛素的分泌量高于正常值有关。由于胰岛素抵抗，原尿中葡萄糖浓度过高，渗透压增大，肾小管和集合管对水的重吸收减少，尿量增多，故该患者会出现多尿现象。
9．（2024·江苏盐城·一模）科研人员利用图1所示材料构建重组质粒并导入大肠杆菌，以期获得能监测生物组织或环境中四环素水平的“报警器”。限制酶识别序列及切割位点如下表。TetR基因是一种转录调节基因，GFp基因为绿色荧光蛋白基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ri为复制原点。请回答下列问题：
(1)使用工具酶拼接DNA片段1和2，拼接后的片段连接处部分序列为5＇ 3＇（写出6个碱基），TetR基因和GFP基因转录的模板链 （“是”或“不是”）该拼接DNM的同一条链。
(2)构建重组质粒时，选择 对质粒和拼接的DNA片段进行酶切，在DNA连接酶的作用下恢复 键。再根据 的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。
(3)将重组质粒导入经 理的大肠杆菌后，在含 的固体培养基中筛选出工程菌。
(4)工程菌监测四环素的原理如图2，当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌 （能/不能）发出荧光，其原因是 。
【答案】(1) TCTAGT或ACTAGA 不是
(2) BamHⅠ，EcRⅠ 磷酸二酯键 琼脂糖凝胶电泳
(3) CaCl2 氨苄青霉素
(4) 能 当环境中含四环素时，抑制TctR蛋白作用增强，解除TctR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白（GFP蛋白）而发光
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）据图1分析可知，DNA片段1两端的限制酶识别序列分别是Xba Ⅰ和EcR Ⅰ，而DNA片段2两端的限制酶识别序列是Spe Ⅰ和BamH Ⅰ，若要让两个DNA片段连接在一起，需要经酶切后获得相同的黏性末端。据表格分析，XbaⅠ和SpeⅠ酶切能获得相同的黏性末端，因此DNA片段1用XbaⅠ酶切，DNA片段2用SpeⅠ酶切，然后在用DNA连接酶将两个DNA片段连接在一起，由于无法得知DNA片段两条链具体的方向，所以在特定工具酶作用下能成功拼接的位点处碱基序列为5’-TCTAGT-3’或5’-ACTAGA-3’；DNA片段1和DNA片段2连接后，两个片段启动子方向相反，故TetR基因和GFP基因转录的模板链不是该拼接DNA的同一条链。
（2）据图可知，重组质粒含有3种酶的酶切位点，且使用工具酶拼接DNA片段1和2后两端的酶是BamHⅠ，EcRI，故构建重组质粒时，选择BamHⅠ，EcRⅠ对质粒和拼接的DNA片段进行酶切；在DNA连接酶的作用下恢复磷酸二酯键；琼脂糖凝胶电泳可以将不同大小的DNA片段分离开，故根据琼脂糖凝胶电泳的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。
（3）钙离子能促进细菌摄 取外源的 DNA，科学家常使用 CaCl2溶液制备感受态细胞，使其处于感受态；图示重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，故将重组质粒导入经CaCl2处理的大肠杆菌后，在含氨苄青霉素的固体培养基中筛选出工程菌。
（4）分析题图可知，当环境中含四环素时，抑制TetR蛋白作用增强，解除TetR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白（GFP蛋白）而发光，因此当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌能发出绿色荧光。
10．（24-25高一上·内蒙古锡林郭勒盟·期末）L-天冬酰胺酶是治疗急性淋巴细胞白血病的药物，其化学本质是蛋白质。在人体血浆中，该酶可催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。研究者制备了含L-天冬酰胺酶的纳米微球(简称酶微球)，为研究酶微球在血浆中的稳定性，以游离的L-天冬酷胺酶(简称游离酶)为对照，进行了实验，过程如下:
①取适量酶微球溶液和游离酶溶液，分别与模拟血浆混匀，37℃水浴预热;
②预热不同时间后，加入L-天冬酰胺保温 10min;
③反应体系中加入三氯乙酸终止反应;
④测定体系中____________的生成量，得到时间-酶活性曲线(如下图)。

回答下列问题:
(1)L-天冬酰胺酶作为药物使用时，应采用的给药方式是 (填“口服”或“静脉注射”)。L-天冬酰胺酶发挥作用的原理是 。
(2)向反应体系中加入三氯乙酸，可破坏酶的 ，使酶变性，从而终止反应。
(3)实验步骤④处应填 。
(4)该实验的结论是 。
【答案】(1) 静脉注射 降低化学反应的活化能
(2)空间结构
(3)氨
(4)相同条件下酶微球在血浆中的稳定性比游离酶高
【分析】酶是由活细胞产生的具有催化作用的蛋白质或RNA，是一类极为重要的生物催化剂；具有高效性、专一性和作用条件温和的特性；低温会抑制酶的活性，可以恢复，高温、过酸、过碱、重金属会破坏酶的空间结构，使酶变性失活，不能恢复。
【详解】（1）L-天冬酰胺酶的化学本质是蛋白质，属于大分子物质，作为药物使用时，应采用静脉注射的给药方式，如果口服会被分解而失去作用，故应采用的方式是静脉注射；酶发挥作用的原理是j降低化学反应的活化能。
（2）蛋白质的结构决定功能，向反应体系中加入三氯乙酸，可破坏酶的空间结构使酶变性，从而终止反应。
（3）分析题意可知，人体血浆中酶可催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨，故测定体系中氨的生成量。
（4）由图可知，相同条件下，酶微球在血浆中的相对活性比游离酶高，说明在相同条件下酶微球在血浆中的稳定性比游离酶高。
11．（24-25高三上·四川内江·阶段练习）以下是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料：
资料1：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒[5'AOXI和3'AOXI（TT）分别是基因AOXI的启动子和终止子]用作载体，其与目的基因HBsAg形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。
注意HBsAg基因中的箭头表示转录的方向
资料2：限制酶酶切位点
(1)用PCR技术扩增HBsAg基因时所需TaqDNA聚合酶需要 激活。此过程中需要添加引物，引物的作用是 。
(2)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置分别添加 限制酶识别序列。这样设计的优点是 。
(3)若用限制酶SnaBI，BglII联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是36kb，25kb，65kb；用限制酶BglII、AvrII联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是36kb，36kb、54kb；已知HBsAg基因长度是52kb。步骤3中应选用限制酶 来切割重组质粒以获得重组DNA，切割后的重组DNA的长度是 。
【答案】(1) Mg2+ 引导DNA聚合酶从引物3’端开始连接脱氧核苷酸
(2) SnaBI和AvrII 避免目的基因反向接入质粒（保证目的基因定向接入质粒）、防止质粒和目的基因环化（任答一种）
(3) BglII 131kb
【分析】分析题图：图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和 SacⅠ限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。要将HBsAg基因和 pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，要获取含有5'AOXI--3'AOXI段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割。
【详解】（1）PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，扩增HBsAg基因时原料是脱氧核苷酸(dNTP)，Mg2+是Taq酶最重要的激活剂。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，因此PCR过程中需要添加引物。
（2）DNA聚合酶是沿着DNA的单链移动，从引物的5'向3'端合成新的DNA链，因此设计引物时需要在引物的5'端添加相应限制酶的识别序列。图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和 SacⅠ限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，BglⅡ位于终止子上，并且有两个切点，要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，根据图中HBsAg基因转录方向可知，应在HBsAq基因A侧加入SnaBⅠ识别序列，即加入碱基序列TACGTA；在B侧加入AvrⅡ识别序列，即加入碱基序列CCTAGG。用双酶切的优点是避免目的基因反向接入质粒(保证目的基因定向接入质粒)、防止质粒和目的基因环化。
（3）若用限制酶SnaBI，BglII联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是36kb，25kb，65kb；用限制酶BglII、AvrII联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是36kb，36kb、54kb，因此，在pPIC9K质粒中 左侧BglII与SnaBⅠ之间的DNA片段的长度为25kb； 右侧BglII与AvrⅡ之间的DNA片段的长度为54kb，用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，故目的基因位于SnaBⅠ和AvrⅡ之间，目的基因(HBsAg基因)长度是52kb，故切割后的重组DNA的长度是25kb+54kb+52kb=131kb。
12．（24-25高三上·陕西商洛·阶段练习）人参是一种名贵中药材，具有良好的滋补作用。干扰素可用于治疗慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤。下图为三种限制酶识别序列与酶切位点及制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的示意图。一请回答下列问题：
(1)图中①的DNA用限制酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ完全酶切后，反应管中有 种DNA片段。利用PCR技术扩增干扰素基因时，扩增第n次时，需要 个引物。
(2)假设图中质粒上限制酶BamH1识别的碱基序列变为了另一种限制酶Bcl1识别的碱基序列，现用限制酶Bcl1和HindⅢ切割质粒，那么该图中①的DNA右侧能否选择BamHⅠ进行切割，并说明理由： 。
(3)在构建重组质粒的过程中，用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ切割质粒和目的基因比只用BamH Ⅰ好，这样可以防止 。②过程需要用到的酶是 。
(4)④过程检测人参愈伤组织细胞是否产生干扰素，常用的方法是 。
(5)将构建的基因表达载体导入动物受精卵常用的方法是 。
【答案】(1) 4 2n
(2)能，BamHI、BclⅠ切割后的黏性末端相同
(3) 目的基因的自身环化、目的基因反向接入质粒 DNA连接酶
(4)抗原一抗体杂交法
(5)显微注射法
【分析】题图为三种限制酶识别序列与酶切点及制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的示意图。①为用限制酶切割获取目的基因，②为构建基因表达载体，③为将目的基因导入受体细胞，④为目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）图中①的DNA有1个HindIII和两个BamHI酶切位点，用HindIII、BamHI完全酶切后，反应管中有4种DNA片段。利用PCR技术扩增干扰素基因时，扩增第1次时，需要2个引物，扩增第2次时，需要4个引物，所以扩增第n次时，需要2n个引物。
（2）据图可知，BamHⅠ、BclⅠ虽然识别序列不同，但切割后的黏性末端相同，因此假设图中质粒上BamHⅠ识别位点的碱基序列变为了另一种限制酶Bc1Ⅰ识别位点的碱基序列，用BclⅠ和HindⅢ切割质粒，则该图中①的DNA右侧仍能选择BamHⅠ进行切割，并能获得所需的重组质粒。质粒和目的基因都被HindⅢ进行切割，形成相同的黏性末端，则形成的重组质粒能被HindⅢ进行切割。
（3）若只用一种酶切，产生的黏性末端完全一致，在构建重组质粒的过程中，目的基因和质粒则都容易发生自身环化（或目的基因反向接入质粒；或目的基因与质粒的任意连接），所以用HindⅢ、BamHⅠ切割质粒和目的基因比只用BamHⅠ好，这样可以防止目的基因的自身环化和目的基因反向接入质粒。②为构建基因表达载体，需要用DNA连接酶。
（4）检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术，故④过程检测人参愈伤组织细胞是否产生干扰素，所用的方法是抗原—抗体杂交法。
（5）将构建的基因表达载体导入动物受精卵常用的方法是显微注射。
13．（24-25高三上·辽宁·期末）很多人不喜欢山羊肉的膻味，这影响了肉山羊的销量。科研人员尝试寻找去膻味基因，采用基因工程技术培育转基因去膻味山羊，所需要的限制酶如表，培育流程如图甲所示，质粒和目的基因如图乙所示。请回答下列问题：

(1)在构建图甲中的重组表达载体时，应用限制酶 切割图乙中质粒，再用 DNA连接酶连接，不选用其他限制酶的原因是 。
(2)为保证目的基因与载体的正向连接，在设计PCR引物时，应在与α链互补引物的 （填“3′”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据图乙信息，写出该引物的15个碱基序列5′- -3′。
(3)图甲中④为核移植，核移植时卵母细胞应在体外培养到 期；将早期胚胎移入代孕母羊时， （填“需要”或“不需要”）给代孕母羊注射免疫抑制剂。
【答案】(1) KpnⅠ、PvitⅡ（顺序可颠倒） T4 用限制酶HindⅢ会破坏质粒上的标记基因，用限制酶PstⅠ、BamHⅠ会破坏目的基因
(2) 5′ PvitⅡ CAGCTGGTAGTCGAA
(3) MⅡ 不需要
【分析】胚胎工程是指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内然后生产后代，以满足人类的各种需求。胚胎工程技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。
【详解】（1） 由图乙可知，不能选用限制酶HindⅢ切割质粒，因为限制酶Hind Ⅲ会破坏质粒上的标记基因，也不能用限制酶PstⅠ、BamHⅠ，因为用限制酶PstⅠ、BamH Ⅰ会破坏目的基因，因此应选用限制酶KpnⅠ、Pvit Ⅱ切割质粒，限制酶KpnⅠ、Pvit Ⅱ切割质粒产生黏性末端和平末端，可用T4DNA 连接酶连接。
（2） 为保证目的基因与载体的正向连接，应在去膻味基因的左侧添加限制酶KpnⅠ的识别序列，在去膻味基因的右侧添加限制酶PvitⅡ的识别序列，据此推导，应在α链对应引物的5端添加限制酶PvitⅡ的识别序列，该引物的15个碱基序列为5-CAGCTGGTAGTCGAA-3` 。
（3） 核移植时，卵母细胞应在体外培养到MⅡ期。将早期胚胎移入代孕母羊时，不需要给代孕母羊注射免疫抑制剂，因为受体不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应。
14．（23-24高三上·江西宜春·阶段练习）玉米是我国第一大粮食作物，有较高的经济价值。矮化玉米株型紧凑，通风透光、适合密植，可有效减少玉米倒伏，提高玉米产量。现利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变野生型玉米WT获得玉米矮化突变体，并通过连续自交得到纯合体，即为突变体A5。现将A5与野生型杂交获得F₁，F₁自交得到F₂，其中部分个体相关基因的电泳结果如图所示。回答下列问题：
(1)玉米为单性花，杂交育种时的操作流程是 。与杂交育种相比，理论上能更快获得A5的育种方法是 。
(2)根据题意判断，突变型为 性状。理论上，F₂个体在电泳时能产生Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带型的数量比是 。
(3)进一步研究发现，在A5的mRNA上距离起始密码子474个核苷酸的位置出现了终止密码子，使 ，进而导致O₂蛋白合成异常。通过抗原—抗体杂交技术对A5与WT玉米的O₂蛋白进行检测，结果如图所示。A5无条带的原因可能是 。
(4)根据突变体对赤霉素的敏感程度，可将玉米矮秆突变分为赤霉素敏感型和赤霉素钝感型。赤霉素敏感型突变是玉米体内赤霉素合成的通路被阻断；赤霉素钝感型突变是赤霉素合成正常，但赤霉素信号转导通路受阻。欲探究A5是赤霉素敏感型还是赤霉素钝感型，请设计实验进行探究并预期实验结果。
实验思路： ；
预期实验结果： 。
【答案】(1) 套袋→人工授粉→再套袋 单倍体育种
(2) 显性 2:1:1
(3) 肽链的合成提前终止 错误翻译的O₂蛋白可能被机体识别并快速降解了
(4) 实验思路：对A5幼苗喷施适宜浓度的外源赤霉素，观察其生长状况 预期实验结果：若A5株高可恢复正常，则说明A5是赤霉素敏感型突变体；若A5株高无法恢复正常，则说明A5是赤霉素钝感型突变体
【分析】电泳依据DNA分子量的大小分离DNA分子，DNA分子越大，移动速率越慢，反之越快。
【详解】（1）玉米为单性花，杂交育种时的操作流程是套袋→授粉→套袋；与杂交育种相比，单倍体育种能极大的缩短育种年限，因此能更快获得A5。
（2）据图分析，A5与野生型杂交获得F₁，F1均为突变型，因此 推断突变型为显性性状；假设该形状由一对基因控制（A/a）, F1Aa自交，F2中AA：Aa：aa=1：2：1，因此理论上，F₂个体在电泳时能产生Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带型的数量比是2：1：1。
（3）在A5的mRNA上距离起始密码子474个核苷酸的位置出现了终止密码子，会导致肽链的合成提前终止，进而导致O₂蛋白合成异常。错误翻译的O₂蛋白可能被机体识别并快速降解了，进而导致A5无条带。
（4）实验思路：对A5幼苗喷施适宜浓度的外源赤霉素，观察其生长状况
预期实验结果：若A5株高可恢复正常，则说明A5是赤霉素敏感型突变体；若A5株高无法恢复正常，则说明A5是赤霉素钝感型突变体
15．（2024·安徽安庆·三模）玉米是我国第一大粮食作物，有较高的经济价值。矮化玉米株型紧凑、通风透光，适合密植，可有效减少玉米倒伏，提高玉米产量。现利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变野生型玉米（WT）获得玉米矮化突变体，并通过连续自交得到纯合体，即为突变体A5。现将A5与WT杂交获得F1，F1自交得到F2，其中部分个体相关基因的电泳结果如图所示（已知其中一个基因可被限制酶切割成两个不同长度的片段）。回答下列问题。

(1)玉米为单性花，杂交育种时的操作流程是 。与杂交育种相比，理论上能更快获得A5的育种方法是 。
(2)据题可知，突变型为 性状。理论上，F2个体在电泳时能产生Ⅲ带型的数量比例是 。
(3)研究发现，突变基因位于2号染色体上。科研人员推测2号染色体上已知的三个突变基因可能与突变性状出现有关。这三个突变基因中碱基发生的变化如下表所示。
由上表推测，该基因A突变 （填“会”或“不会”）导致突变性状，可能原因是基因A的突变没有发生在 序列。基因D突变使蛋白质长度明显变短，这是由基因D的突变导致 造成的。
(4)玉米非糯性基因（W）对糯性基因（w）是显性，W-和w-表示该基因所在染色体发生部分缺失（缺失区段不包括W和w基因），缺失不影响减数分裂过程。染色体缺失的花粉不育，而染色体缺失的雌配子可育。现有基因型分别为WW、Ww、ww、WW-、W-w、ww-的6种玉米植株，通过测交实验可验证“染色体缺失的花粉不育，而染色体缺失的雌配子可育”的结论，写出测交亲本组合的基因型： 。
【答案】(1) 套袋→人工授粉→再套袋 单倍体育种
(2) 显性 1/4
(3) 不会 密码子对应 翻译提前终止
(4)ww（♀）×W-w（♂）；W-w（♀）×ww（♂）
【分析】基因分离定律的实质：在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给后代。
【详解】（1）玉米是单性花，不需要进行人工去雄，故杂交育种的流程为：套袋→人工授粉→再套袋。与杂交育种相比较，最快获得A5的育种方法是单倍体育种。
（2）依据题干信息，利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变野生型玉米（WT）获得玉米矮化突变体，并通过连续自交得到纯合体A5，可知突变型为显性类型，野生型为隐性类型。由已知，其中一个基因可被限制酶切割成两个不同长度的片段，结合电泳条带可知能被限制酶切割的基因为隐性基因，可标为a，而突变基因为A，不能被限制酶切割，F2个体在电泳时能产生Ⅲ带型的基因型为AA，所占的比例为1/4，具体过程为：野生型aa突变型AAF1：AaF2：AA:Aa：aa=1:2:1。
（3）依据表格信息可知，突变基因A发生了碱基对的增添，突变基因B发生了碱基对的替换，突变基因C发生了碱基对的缺失。又因为，当发生突变A时，表达产生的蛋白质与野生型分子结构无差异，说明该基因A突变不会导致突变性状，可能的原因是基因A的突变没有发生在编码序列，即密码子对应的序列。基因D突变导致表达产生的蛋白质长度比野生型明显变短，可能的原因是基因D的突变导致终止密码子提前出现，导致翻译提前终止。
（4）依据题干信息，若要验证“染色体缺失的花粉不育，而染色体缺失的雌配子可育”的结论，且采用测交方法，故选用的植株类型应为W-w和ww，采用正反交实验即可，即ww（♀）×W-w（♂）；W-w（♀）×ww（♂），前者后代全都表现为糯性，后者非糯性：糯性=1:1。
16．（2024·全国·模拟预测）利用转基因技术进行作物品种改良已成为一种全新的育种途径。玉米（2n=20）为雌雄同株异花植物，科研人员利用转基因技术将Bt基因（1.8kb）导入玉米中，获得具有抗虫性状的转基因玉米，相关流程如图1。
回答下列问题：
(1)构建重组质粒时需要用到限制酶和DNA连接酶。用限制酶SpeⅠ切割目的基因后形成的黏性末端为，则该酶的识别序列和切割位点为5'- -3'（用箭头标注酶切位点）。常用的DNA连接酶有两种，其中 能连接平末端和黏性末端。除图示方法外，将重组质粒导入植物细胞的方法还有 （答两种）。
(2)利用PCR技术扩增Bt基因时，应选择图2中A、B、C、D四种单链DNA片段中的 作为引物对Bt基因进行扩增。一个Bt基因扩增30次，消耗引物的数量为 。设计引物时，每对引物之间不能碱基互补配对，其原因是 。
(3)随机选取4株玉米（编号3~6），通过PCR等技术检测Bt基因是否成功导入玉米植株中，PCR产物经电泳后结果如图3。由图可知，3~6号玉米中，成功转入Bt基因的玉米是 （填编号）。要验证获得的转基因玉米是否具有抗虫性状，还需要进行 实验。
【答案】(1) A↓CTAGT T4DNA连接酶 农杆菌转化法、花粉管通道法
(2) B、C 231-2 防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链的结合效率
(3) 3、4、5 抗虫接种
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因，检测目的基因是否转录出了mRNA：PCR；②检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）构建重组质粒时需要用到限制酶和DNA连接酶。用限制酶SpeⅠ切割目的基因后形成的黏性末端为，说明该限制酶识别GGATCC序列并在G和G之间将磷酸二酯键切开，即该酶的识别序列和切割位点为5'- A↓CTAGT -3' ,常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的E.cli DNA连接酶和来自噬菌体的T4 DNA连接酶，能连接平末端和黏性末端的是T4 DNA连接酶，将重组质粒导入植物细胞的方法还有花粉管通道法和农杆菌转化法。
（2）利用PCR技术扩增Bt基因时，引物是与模板链的3' 结合，因此应选择图2中B、C作为引物对Bt基因进行扩增。一个Bt基因扩增30次，消耗引物的数量为231-2个。设计引物时，每对引物之间不能碱基互补配对，目的是防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链的结合效率
（3）通过PCR等技术检测Bt基因是否成功导入玉米植株中，是根据B基因序列设计引物，进行Bt基因的PCR扩增，1组是以非转基因玉米DNA为模板，结果显示无扩增产物，说明非转基因玉米中无Bt基因，由此可知，1组作为对照组，说明非转基因玉米中无Bt基因；2组为含有目的基因的重组质粒，通过图中比较，3、4、5组玉米有对应的条带，说明含有Bt基因。要验证获得的转基因玉米是否具有抗虫性状，还要进行个体水平的检测，如抗虫接种实验。
17．（2024·湖北黄冈·二模）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因）或插入新的基因，其工作原理如下所示。
(1)研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，从功能上看，细菌体内的Cas9类似于基因工程中的 ，推测细菌中Cas9存在的意义： 。
(2)SgRNA是一段较短的能与目标基因互补配对的特殊序列，在SgRNA的引导下，Cas9蛋白对目标基因进行识别和定点敲除。Cas9蛋白有时会对非目标基因进行切割，试分析其原因可能是 。请提供一个解决措施： 。
(3)图2为科研人员利用CRISPR/Cas9技术制作PD-1基因敲除牛的流程图，通过删除编码PD-1蛋白功能区的2、3、4片段造成蛋白的功能性缺失，此过程至少需要根据PD-1基因的碱基序列设计 个SgRNA．经基因编辑得到的12只小牛可通过PCR鉴定其基因型，电泳结果如图3所示。据图可知，图3中代表基因敲除纯合子的小牛有 只。
(4)要获得基因编辑的小牛，需将培养到 时期的胚胎移植到经过 处理的母牛的子宫中进行发育。
【答案】(1) 限制酶 切割外源DNA使之失效，以保证自身的安全
(2) 当其他基因也含有与SgRNA互补配对的序列时，造成SgRNA与非目标基因错误结合，进而导致Cas9蛋白对非目标基因进行切割 适当增加SgRNA的长度，提高其与目标基因识别的特异性
(3) 2 6
(4) 桑葚胚或囊胚 同期发情
【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因）或插入新的基因，由此可知细菌体内的Cas9类似于基因工程中的限制酶，通过切割外源DNA使之失效，以保证自身的安全。
（2）SgRNA是一段较短的能与目标基因互补配对的特殊序列，在SgRNA的引导下，Cas9蛋白对目标基因进行识别和定点敲除。当其他基因也含有与SgRNA互补配对的序列时，造成SgRNA与非目标基因错误结合，进而导致Cas9蛋白对非目标基因进行切割，为此可以通过适当增加SgRNA的长度，提高SgRNA与目标基因识别的特异性。
（3）据图示分析，需要将野生型基因2、3、4三个片段切除，需要设计2的起始点和4的终点两个sgRNA。
据图2分析，野生型基因核苷酸数量多于2、3、4片段敲除基因，基因的核苷酸数量越多，电泳时移动速度慢，距离点样孔近。据图3结果可知，1、4、6、7、10、12只有一条条带，说明只含有一种基因，且离点样孔远，故为敲除后的基因，所以说明1、4、6、7、10、12代表基因敲除纯合子，即图3中代表基因敲除纯合子的小牛有6只。
（4）胚胎移植是将培养到桑葚胚或囊胚时期的胚胎移植到经过同期发情处理的母牛的子宫中进行发育。
18．（24-25高三上·湖南长沙·阶段练习）黄瓜通过数千年的自然选择、人工选择的不断淘汰和改良，发展到现在的众多栽培品种。根据不同黄瓜果实的特性，在取食过程中，黄瓜嫩果果皮颜色成为一个重要的参考指标。
(1)某黄瓜植株甲的一个原始雄性生殖细胞经减数分裂产生了AB、Ab、aB、ab四种基因型的花粉，推测该原始雄性生殖细胞在减数分裂的四分体时期，位于同源染色体上的 （填“等位基因”或“非等位基因”）随着非姐妹染色单体之间的互换而发生了交换。据现有结果 （填“能”或“不能”）判断基因A/a与B/b是位于一对同源染色体上。
(2)现用纯种黄瓜嫩果黄绿色果皮品系P1与黄瓜嫩果白色果皮品系P2进行杂交，F1再自交。所得F2表现型及比例如下表，据此判断，黄瓜嫩果果皮颜色由 对等位基因控制，预计P2与F1杂交，后代表型及比例约为 。
(3)为确定决定白色果皮的基因在染色体上的具体位置，研究者将纯合嫩果白色果皮品系H4与绿色果皮品系Q1杂交，F1表现为绿色，自交获得F2，F2绿色果皮与白色果皮比例为3:1。SSR是各染色体上的一段特异性短核苷酸序列，非同源染色体上和不同品种的同源染色体上的SSR都不同，可作为基因定位的遗传标记。研究者在黄瓜的7条染色体上选择了179对SSR位点进行PCR。其中位于3号染色体的SSR15进行PCR及电泳后结果如下图。据此判断，白色果皮基因 （填“位于”或“不位于”）3号染色体上。判断依据是 。

(4)以上黄瓜品系均不抗虫，科研人员利用基因工程培育出转基因抗虫新品种，基因工程选用的外植体来自（2）中的F1，科研人员从获得的转基因抗虫新品种中筛选出了2株一对同源染色体上仅导入一个抗虫基因的转基因植株，命名为S1、S2。若S1和S2植株中各含有两个抗虫基因，S1与S2杂交，所得子代的表型比例为135:45:60:9:3:4，则S1和S2的抗虫基因在染色体上的分布及与果皮颜色基因的位置关系是 。
【答案】(1) 等位基因 不能
(2) 2 黄绿色：浅绿色：白色=1:1:2
(3) 位于 F2白色植株的SSR15的PCR结果与H4保持一致
(4)S1和S2的抗虫基因位于两对同源染色体上，且与F1控制果皮颜色基因所在的同源染色体均不同
【分析】自由组合定律：控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的；在形成配子时，决定同一性状的成对的遗传因子彼此分离，决定不同性状的遗传因子自由组合。
【详解】（1）一个原始雄性生殖细胞经减数分裂产生了AB、Ab、aB、ab四种基因型的花粉，推测该原始雄性生殖细胞的基因型是AaBb，其在减数分裂的四分体时期，位于同源染色体上的等位基因随着非姐妹染色单体之间的互换而发生了交换；基因A/a与B/b无论位于一对还是两对同源染色体上，发生染色体互换后，一个AaBb的原始雄性生殖细胞经减数分裂均能产生四种基因型的花粉，所以据现有结果不能判断基因A/a与B/b是位于一对同源染色体上还是位于两对同源染色体上。
（2）据表中数据分析，F2中黄绿色果皮：浅绿色果皮：白色果皮=9:3:4，为9:3:3:1变式，符合基因自由组合定律，说明黄瓜嫩果果皮颜色由2对等位基因控制。由F2的表型及比例，可推测F1为杂合子。又品系P1黄绿色果皮，品系P2为白色果皮，可推断P2为隐性纯合子。P2与F1杂交即为测交，子代各基因型比例为1:1：1:1。且在F2中黄绿色果皮：浅绿色果皮：白色果皮=9:3:4，则测交对应的各表型及比例为黄绿色果皮：浅绿色果皮：白色果皮=1:1:2。
（3）电泳检测F2中白色果皮植株、F1、H4和Q1的SSR15的扩增产物，由图谱可知，F2白色果皮植株都含有H4亲本的SSR15，SSR15在黄瓜的3号染色体上，故推测控制果皮颜色的基因位于3号染色体上。
（4）将135:45:60:9:3:4比例中各数加起来共256份，则推知子代表型由四对等位基因控制，且符合自由组合定律，因此得出抗虫基因位于两对同源染色体上，且与F1控制果皮颜色基因所在的同源染色体均不同。
19．（23-24高二下·安徽黄山·期末）“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验：
【实验一】遗传特性及杂交育种的研究
在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。
【实验二】甜度相关基因的筛选
通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。
【实验三】转S基因新品系的培育
提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Tǐ质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培育出转S基因的新品系。
根据研究组的实验研究，请回答下列问题：
(1)假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则品系乙基因型为 。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜∶不甜比例为 。
(2)下图中，能解释（1）中杂交实验结果的代谢途径模型有 。
(3)为获取S基因的cDNA，提取品系乙的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增S基因的cDNA。其中用于扩增的引物需满足的条件是 。
(4)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用 酶切割S基因的cDNA和载体。
(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有 （答出2点即可）。
【答案】(1) aabb 1:5
(2)①③
(3) 逆转录 两种引物分别与两条模板链3，端的碱基序列互补配对
(4)Xba Ⅰ和Hind Ⅲ
(5)单倍体育种和诱变育种
【分析】常见的育种方法
（1）杂交育种：将两个或多个品种的优良性质通过杂交集中在一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法。
（2）诱变育种：利用物理因素或化学因素来处理生物，使生物发生基因突变。
（3）单倍体育种：通过花药离体培养获得单倍体植株，人工诱导染色体数目加倍后得到稳定遗传的优良品种。
（4）多倍体育种：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，使染色体数目加倍。
（5）基因工程育种：转基因技术将目的基因导入生物体内，培育出新品种。
2.自由组合定律特殊比例归纳
【详解】（1）甲为纯合不甜品系，则甲的基因型为AAbb，甲和乙杂交得到F1表现型为不甜，则纯合甜品系乙的基因型为aabb；甲和丙杂交得到F1表现为甜，F1自交得到F2中甜：不甜=3:1，据此可推出纯合甜品系丙的基因型为AABB。乙、丙杂交的F2中甜：不甜=13:3，是9:3:3:1的变式，据此得出F2中不甜植株的基因型及比例为AAbb：Aabb=1:2，若F2中不甜的植株进行自交，F3中甜的植株所占的比例为（2/3）×（1/4）=1/6，则不甜的植株所占的比例为5/6，因此F3甜：不甜=1:5。
（2）乙、丙杂交的F2中甜：不甜=13:3，且不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，即只有A基因存在时表现为不甜，当A与B同时存在或只有B存在或A与B都不存在时，表现为甜，能解释该实验结果的代谢模型有①和③。
（3）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。用于扩增目的基因的引物需要满足的条件是两种引物分别与两条模板链3，端的碱基序列互补配对。
（4）
因为限制酶BamH Ⅰ会破坏S基因的cDNA，因此不能选用限制酶BamH Ⅰ；限制酶Sal Ⅰ的酶切位点不在T-DNA中，不能选择；限制酶EcR Ⅰ在S基因的左右两侧均有酶切位点，会导致错误连接，因此为了确保目的基因插入载体中的方向正确，最好选用限制酶Xba Ⅰ和Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和载体。
（5）常见的育种方法有杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、基因工程育种等。因此除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，还能使用单倍体育种和诱变育种。
20．（24-25高三上·云南大理·期中）我国西北某地发现一种植物耐盐碱的能力非常强，生长迅速，适应性好。通过研究筛选发现，耐盐碱基因（M）对不耐盐碱基因（m）为显性。设想通过转基因技术培育耐盐碱的大豆新品种，将符合条件的盐碱地适度有序开发为耕地，推进我国农业的发展。回答下列问题：
(1)对M、m基因进行酶切后电泳发现，M、m基因的总长度相同，说明是DNA分子中发生 导致的基因突变。
(2)图1所示的限制酶PstI与SmaI在质粒的相应区域也有切点，在构建基因表达载体时，应选用限制酶 切割M基因和质粒。
(3)用一种限制酶切M基因与质粒，构建基因表达载体时，除了会出现M基因自连成环外，还会出现M基因与质粒反向连接而影响M基因的表达。图2表示正确插入M基因的表达载体，为了鉴定M基因是否正确插入，拟设计甲、乙、丙三种引物对一个插入M基因的表达载体进行PCR，再通过电泳后的片段长度进行鉴定，应选用 （填“甲”“乙”“丙”）两种引物，如果扩增出长度为 bp 的片段，说明M基因是正确插入；如果 ，说明M基因是反向插入。
(4)采用农杆菌转化法将M基因导入大豆细胞，最终获得耐盐碱的转基因大豆新品种。基因工程育种与诱变育种相比，基因工程育种的优点是 。
【答案】(1)碱基对的替换
(2)Pst I
(3) 乙、丙 700 不能进行PCR（或不能扩增、扩增不出DNA片等）
(4)定向改造生物的遗传性状
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）基因突变有基因中碱基对的增添、缺失和替换，对M、m基因进行酶切后电泳发现，M、m基因的总长度相同，说明是DNA分子中发生碱基对的替换导致的基因突变。
（2）据图可知，由于限制酶SmaI识别位点有一个在M基因内，若用该酶切割，会破坏目的基因，因此不能选该酶，即在构建基因表达载体时，应选用限制酶Pst I切割M基因和质粒。
（3）根据图示，重组质粒复制方向以及引物甲、乙、丙的正确位置已经确定，若选择甲和丙，无论M基因是否正确插入，都是扩增出100+600+200=900bp的DNA片段；若选择乙和甲，反向连接才能扩增出长度为600+200=800bp的DNA片段；因此应选择乙和丙进行PCR，若电泳产物出现100+600=700bp片段，则M基因是正确插入，若反向连接，不能进行PCR（或不能扩增、扩增不出DNA片等）。
（4）基因工程育种通过DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞中，使后者获得前者的某些优良性状，或者利用后者作为表达场所来生产目的产物的新菌种，基因工程育种与诱变育种相比，基因工程育种的优点是目的性强，能够定向地改造生物的遗传性状。
21．（24-25高三上·广东·期中）我国玉米的生产一直受到虫害的严重影响，其中鳞翅目害虫亚洲玉米螟对我国玉米生产的危害较为显著。通过基因工程育种，将抗虫基因crylAb13转入玉米，能够显著提高玉米对玉米螟的抗性。过程如图1所示，其中基因Bar为抗除草剂基因。回答下列问题：
(1)根据基因表达载体的结构推测，抗除草剂基因Bar的作用是 。基因cry1Ab13必须插入Ti质粒的T-DNA中，原因是 。
(2)为了减少限制酶识别序列的影响，研究人员利用无缝克隆In=Fusin技术实现过程②目的。原理如图2所示。利用限制酶 将表达载体线性化。过程①利用 技术获取基因crylAb13，该过程中要在引物1和引物2的 （填“3＇”或“5＇”）端增加对应表达载体中的片段。将线性化的表达载体和基因cry1Ab13混合进行In-Fusin反应，获得重组表达载体。
(3)过程③利用构建好的重组表达载体转化经 处理过的农杆菌，然后侵染玉米愈伤组织，进而获得转基因玉米植株。研究人员探究了农杆菌浓度对基因转化效率的影响，结果如图3所示。实验结果表明，转化效率较高的农杆菌浓度范围为 OD600。为了进一步对侵染条件进行优化，可进行实验探究的课题是 。
【答案】(1) 检测目的基因是否导入受体细胞 T-DNA可将目的基因转移并整合到玉米细胞的染色体DNA上
(2) BamH Ⅰ PCR 5＇
(3) Ga2+(CaCl2) 0.4～0.6 探究基因转化效率最高的农杆菌浓度
【分析】农杆菌中含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可以转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌这种特点，可以将目的基因插入Ti质粒中的T-DNA，通过农杆菌转化作用，可以目的进入植物细胞，从而使抗盐基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
【详解】（1）基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等。根据图1基因表达载体的结构推测，抗除草剂基因Bar应该是作为标记基因，其作用是检测目的基因是否导入受体细胞，筛选出重组 DNA分子。T-DNA可将目的基因cry1Ab13转移并整合到玉米细胞的染色体DNA上，因此基因cry1Ab13必须插入Ti质粒的T-DNA中。
（2）根据图1信息，重组基因表达载体上有限制酶BamH Ⅰ切割位点，用限制酶BamH Ⅰ可将其线性化，In-Fusi酶将线性化的表达载体和基因cry1Ab13连接成重组表达载体。目的基因crylAb13两侧缺少相应的限制酶识别序列，可通过PCR技术获取基因crylAb13，在目的基因crylAb13两侧添加相应限制酶识别序列，由于DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，故一般在引物5’端添加相应限制酶识别序列。
（3）农杆菌是原核生物，需要Ca2+（CaCl2）处理，使其处于易于吸收外源DNA的状态，完成将基因表达载体导入受体细胞的过程。由图3所示结果可知，当菌液浓度为0.5OD600时，转化率较最高，因此基因转化效率较高的农杆菌浓度范围为0.4～0.6OD600。为了进一步对侵染条件进行优化，在基因较高转化效率的农杆菌浓度范围内，可进一步缩小浓度梯度，探究基因转化效率最高的农杆菌浓度。
22．（24-25高三上·西藏拉萨·阶段练习）基因工程在育种方面得到广泛应用。研究人员将油体蛋白基因SIOLE1与红色荧光蛋白基因TagRFP连接形成融合基因SIOLE1-TagRFP，并将此融合基因转入番茄细胞中获得高产油体蛋白的转基因番茄，培育过程如图所示。回答下列问题：
(1)将油体蛋白基因SIOLE1与红色荧光蛋白基因TagRFP连接形成融合基因SIOLE1-TagRFP需要使用 酶，融合基因中整合上基因TagRFP的目的是 。
(2)构建基因表达载体时需要数量较多的融合基因，需要在体外扩增融合基因，首先要根据融合基因的 端碱基序列设计引物，在PCR过程中需要使用引物的原因是 。
(3)根据图中Ti质粒限制酶识别位点，需要使用 切割Ti质粒，便于融合基因的插入；获得重组细胞后，通常使用含 （填“卡那霉素”或“氨苄青霉素”）的选择培养基培养番茄细胞以抑制农杆菌生长。
【答案】(1) DNA连接 转基因番茄发出红色荧光，便于筛选
(2) 3' 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(3) XPnI、XbaI 卡那霉素
【分析】基因工程的基本工具为限制酶、DNA连接酶和运载体。基因工程的基本操作程序为：获取目的基因、构建基因表达载体、导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。
【详解】（1）将油体蛋白基因SIOLE1与红色荧光蛋白基因TagRFP 连接形成融合基因SIOLE1−TagRFP需要使用DNA连接酶。红色荧光蛋白基因TagRFP表达产物可以发出红色荧光，融合基因中整合上基因TagRFP的目的是转基因番茄发出红色荧光，便于筛选。
（2）DNA复制是从模板的3'→5'，引物是能与目的基因两端序列互补配对的单链DNA，因此首先要根据融合基因的3'端碱基序列设计引物，在PCR 过程中需要使用引物的原因是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（3）为了保证目的基因成功表达，目的基因应该插入在质粒的启动子和终止子之间，若选择EcR1切割Ti 质粒，会导致氨苄青霉素抗性基因的破坏，无法完成后续的筛选过程，因此需要使用Kpn1、Xba1切割Ti 质粒，便于融合基因的插入。重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，氨苄青霉素无法抑制农杆菌生长，因此获得重组细胞后，通常使用含卡那霉素的选择培养基培养番茄细胞以抑制农杆菌生长。
23．（2025·湖南永州·二模）第三代杂交水稻育种技术是以基因工程雄性不育系为遗传工具，将任意雄性可育水稻品种转化为雄性不育水稻，从而实现任意两个品种水稻的杂交。获取任意雄性不育水稻的技术路线如下：①提取并测序所有水稻品种都有的显性雄性可育基因A；②比较可育基因A与某隐性天然雄性不育基因a的碱基序列，找到其不同点并设为拟突变位点；③利用PCR定点突变技术将雄性可育基因A突变为雄性不育基因a（过程如图1）；④将雄性不育基因a导入水稻细胞并培育出水稻植株（过程如图2）；⑤利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除转基因水稻原有的雄性可育基因A。请回答下列问题：
(1)图1中引物2与引物3 （填“相同”或“互补”），合成的DNA分子经混合、变性、杂交后选取通过引物2和引物3延伸形成的两条链杂交在一起的片段，在后续的PCR过程中，这两条链互为 。可育基因A与不育基因a之间的差异可能不止一处，若它们之间的差异有三处，则共计需要设计 种引物。最后利用引物 进行PCR扩增得到大量含有突变位点的DNA片段。
(2)图2中选用的质粒有两个标记基因，分别是抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因，其好处是： 。在构建重组质粒时最好选用限制酶 切割目的基因，用这样的限制酶切割目的基因和质粒的优点是 。
【答案】(1) 互补 模板和引物 8 1、4
(2) 可通过检测农杆菌是否抗氨苄青霉素来检测质粒是否导入，可通过检测农杆菌是否抗四环素来检测目的基因是否导入 HindⅢ和Sal I 可以防止目的基因自连和质粒自连；防止目的基因与质粒反向连接
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
【详解】（1）图1中引物2与引物3是分别与DNA两条互补的模板链中拟突变点处的一段碱基序列互补(突起处代表与模板链不能互补的突变位点)。故引物2与引物3是互补关系。分别经过引物1、2和引物3、4合成的 DNA分子经混合。变性、杂交后选取通过引物2和引物3延伸形成的两条链杂交在一起的片段，在后续的PCR过程中，这两条链既作为PCR的模板，又作为PCR的引物。可育基因A与不育基因a之间的差异若有三处，设计引物时入基因的两端要各设计一种引物，每处差异处要设计两种互补的引物，设计引物总数有8种。最后利用引物1和4进行PCR扩增得到大量含有突变位点的DNA片段。
（2）据图2，可用限制酶HindⅢ和Sal Ⅰ同时切割目的基因和质粒(双酶切)，可以防止目的基因自连和质粒自连，也可防止目的基因与质粒反向连接。若目的基因和质粒正确连接了，则重组质粒中含抗氨苄青霉素基因，不含抗四环素基因，可通过分别检测农杆菌是否抗氨苄青霉素来检测质粒是否导入，是否抗四环素来检测目的基因是否导入。
24．（24-25高三上·新疆喀什·阶段练习）果蝇（2n=8）的红眼(W)对白眼(w)为显性，这对等位基因位于X染色体上。下图表示一红眼雄果蝇与一红眼雌果蝇分别通过减数分裂产生配子，再通过受精作用产生一白眼雄果蝇的过程。请据图回答问题：
(1)写出图中A、E、G 细胞的名称： A E G
(2)若精子C与卵细胞Ｆ结合，产生的后代表型为 ；若亲代红眼雌果蝇与一白眼雄果蝇交配，则子代中出现白眼雌果蝇的概率为 。
(3)某学习小组的同学用显微镜观察果蝇的生殖器官，发现有15%的细胞含有16条染色体，55%的细胞含有8条染色体，30%的细胞含有4条染色体。该小组的同学判断，细胞中 条染色体的出现可能与减数分裂有关。
【答案】(1) 初级精母细胞 次级卵母细胞 （第二）极体
(2) 红眼雌果蝇 1/4
(3)8和4
【分析】减数分裂是有性生殖生物在生殖细胞成熟过程中发生的特殊分裂方式。在这一过程中，DNA复制一次，细胞连续分裂两次，结果形成4个子细胞的染色体数目只有母细胞的一半。
【详解】（1）根据减数分裂产生精子和卵细胞的过程并结合图示可知：雄果蝇的精原细胞经减数第一次分裂前的间期进行DNA复制，成为初级精母细胞A；初级精母细胞经过减数第一次分裂形成两个次级精母细胞；次级精母细胞经过减数第二次分裂形成四个精细胞（包括B）；精细胞经过复杂的变形成为精子（包括C）。雌果蝇卵原细胞的分裂过程：减数第一次分裂前的间期卵原细胞进行DNA复制，成为初级卵母细胞D；初级卵母细胞经过减数第一次分裂形成一个大的次级卵母细胞E和一个小的极体；减数第二次分裂时次级卵母细胞分裂为一个大的卵细胞F和一个小的极体，减数第一次分裂形成的极体也分裂为两个极体（包括G）。
（2）由以上分析可知，精子C所含的基因为XW，卵细胞F所含基因为Xw，它们结合产生的后代基因型为XWXw，表现型为红眼雌果蝇。亲代红眼雌果蝇（XWXw）与一白眼雄果蝇（XwY）交配，则子代基因型有：XWXw、XwXw、XWY、XwY。因此，子代中出现出现雌性白眼果蝇的概率为1/4。
（3）染色体数为16的细胞一定处于有丝分裂后(末)期，染色体数为8的细胞若处于有丝分裂前期和中期或减数分裂I，此时细胞中均含有同源染色体和姐妹染色单体；染色体数为4的细胞可能是处于减数分裂Ⅱ前期和中期的细胞。所以细胞中8和4条染色体的出现可能与减数分裂有关。
25．（23-24高三上·河北邢台·期末）群落内存在两个生态位重叠的物种会向着占有不同的空间、食性、活动时间或其他生态习性分化的现象，称为同域共存机制。回答下列问题：
(1)同域共存机制有利于维持群落的 （答出1点）。存在同域共存机制，种间竞争的结果可能会使两个种群生态位的重叠度 （填“升高”或“降低”）。
(2)菜粉蝶幼虫啃食叶片，而成虫吸食花蜜 （填“属于”或“不属于”）同域共存机制，判断依据是 。
(3)三裂叶豚草是世界公认的恶性入侵杂草，给农作物和生态环境带来严重危害。科研人员比较了三裂叶豚草入侵和非入侵时荒地早春植物群落的各物种生态位宽度，结果如图所示。三裂叶豚草入侵，对 的生存有利，对 的生态位宽度影响最大。

(4)鸣叫计数法是调查鸟类种群数量动态变化及影响因素的一种方法。该方法利用专业的数字录音机记录鸟类鸣唱，随后对所录每只个体的鸣唱参数进行测量和分析，测量并绘制的音图结构可精准确定每只个体独特的音调变化，进而辨别个体。相比于标记重捕法，鸣叫计数法的主要优点是 。对某区域某些种类成年鸟数量的调查在每年的不同季节会出现规律性的变化，可能原因是 。
【答案】(1) 物种丰富度、物种多样性 降低
(2) 不属于 生态位重叠的研究对象是两个物种之间的种间竞争，而菜粉螺幼虫和成虫属于同一物种的不同生长发育时期
(3) 蒲公英和葎草 蔊菜
(4) 对鸟类不损伤，低干扰 鸟类会随季节气候进行迁徙等行为
【分析】生态位：一个物种在群落中的地位或作用，包括所处的空间位置、占用资源的情况、以及与其他物种的关系等，称为这个物种的生态位。
【详解】（1）群落内存在两个生态位重叠的物种会向着占有不同的空间、食性、活动时间或其他生态习性分化的现象，称为同域共存机制,有利于维持群落的物种丰富度、物种多样性。存在同域共存机制，生态位会发生改变，重叠度降低。
（2）生态位重叠的研究对象是两个物种之间的种间竞争，而菜粉螺幼虫和成虫属于同一物种的不同生长发育时期，菜粉蝶幼虫啃食叶片，成虫吸食花蜜不属于同域共存机制。
（3）三裂叶豚草入侵后蒲公英和草的生态位变宽，说明分布更广，生存更有利，从柱状图分析，三裂叶豚草入侵后，蔊菜的生态位影响最大，下降的幅度最大。
（4）相比于标记重捕法，鸣叫计数法对鸟类不损伤，低干扰；某区域某些种类成年鸟数量的调查在每年的不同季节会出现规律性的变化，可能原因是鸟类会随季节气候进行迁徙等行为。
26．（23-24高一下·湖北武汉·期末）玉米（2n=20）雌雄同株且单性花，由野生玉米大刍草驯化而来，现在不仅是主要粮食作物，同时还是一种良好的遗传学实验材料。已知玉米叶片宽窄是由A/a控制的一对相对性状，具有显性基因A时表现宽叶。
(1)玉米作为良好遗传学实验材料的优点有： （答出一点即可）。
(2)若对玉米基因组测序需要检测 条染色体。
(3)现有杂合宽叶植株若干，自然条件下进行繁殖，理论上F1表型及比例为： 。实际收获后，统计F1宽叶植株：窄叶植株为2：1，其原因可能是： 。
(4)玉米作为我国重要的粮食作物之一，全球气温升高会使其减产，寻找耐高温基因并就其调控机制进行深入研究对玉米遗传改良具有重要意义。某研究人员获得一株耐高温突变体甲，高温下该突变体表皮蜡质含量较高，让甲与野生型不耐高温植株杂交，其F₁自交后代中耐高温植株约占1/4，说明耐高温为 性状，且这对相对性状由 对基因控制。
(5)现有宽叶不耐高温玉米和窄叶耐高温玉米作亲本进行杂交，F1表现为宽叶不耐高温：窄叶不耐高温=1：1，请依据第（3）、（4）小题中的结论，设计实验探究控制两对性状的基因遗传时是否遵循基因的自由组合定律（要求：从F1中选择合适的实验材料，通过一次杂交实验完成）。请写出相应的实验思路并预期实验结果（不考虑交叉互换和突变）。
①实验设计思路： 。
②结果预测与结论：
若 ，说明控制两对性状的基因遗传时遵循基因的自由组合定律
若不出现该现象，说明控制两对性状的基因遗传时不遵循基因的自由组合定律
【答案】(1)雌雄同株且为单性花，便于人工授粉；生长周期短，繁殖速度快；具有易于区分的相对性状；产生的后代数量多
(2)10
(3) 宽叶：窄叶=3：1 显性基因纯合致死
(4) 隐性 1/一
(5) 选择F1中的宽叶不耐高温（AaBb）玉米植株让其自交，观察统计子代的表型及比例 子代的表型及比例为宽叶不耐高温：宽叶耐高温：窄叶不耐高温：窄叶耐高温=9：3：3：1
【分析】1、基因分离定律的实质是:在杂合子的细胞中,位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性 ;生物体在进行减数分裂形成配子时，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入到两个配子中，独立地随配子遗传给后代；
2、基因的自由组合定律的实质：当具有两对（或更多对）相对性状的亲本进行杂交，在子一代产生配子时，等位基因分离的同时，非同源染色体上的基因表现为自由组合。其实质是非等位基因自由组合，即一对染色体上的等位基因与另一对染色体上的等位基因的分离或组合是彼此间互不干扰的，各自独立地分配到配子中去。
【详解】（1）玉米作为遗传学实验材料的优点包括：雌雄同株且为单性花，便于人工授粉，这有助于在控制条件下进行遗传操作；生长周期短，繁殖速度快，这使得实验可以在较短的时间内完成，提高了实验效率；具有易于区分的相对性状，如高茎与矮茎、长果穗与短果穗等；产生的后代数量多，这使得统计结果更加准确。
（2）玉米为雌雄同株异花植物，无性染色体，因此进行基因组测序，需要检测10条染色体。
（3）由题意可知，该杂合宽叶植株的基因型为Aa，自然条件下进行繁殖，理论上F1的基因型及比例为AA：Aa：aa=1:2:1，表型及比例为宽叶：窄叶=3：1；实际收获后，统计F1宽叶植株：窄叶植株为2：1，其原因可能是显性基因纯合致死。
（4）耐高温突变体甲与野生型不耐高温植株杂交，其F1自交后代中耐高温植株约占1/4，说明耐高温为隐性性状，且这对相对性状由一对基因控制。
（5）假设控制不耐高温与耐高温这对相对性状的基因为B/b，由（3）、（4）小题中的结论可知，宽叶不耐高温玉米的基因型为AaBB，窄叶耐高温玉米的基因型为aabb，这对亲本杂交，F1中宽叶不耐高温的基因型为AaBb，窄叶不耐高温aaBb，因此要设计实验探究控制两对性状的基因遗传时是否遵循基因的自由组合定律，可选择F1中的宽叶不耐高温（AaBb）玉米植株让其自交，观察统计子代的表型及比例。如果控制两对性状的基因遗传时遵循基因的自由组合定律，则杂交子代的表型及比例为宽叶不耐高温：宽叶耐高温：窄叶不耐高温：窄叶耐高温=9：3：3：1；如果控制两对性状的基因遗传时不遵循基因的自由组合定律，则杂交子代的表型及比例不为宽叶不耐高温：宽叶耐高温：窄叶不耐高温：窄叶耐高温=9：3：3：1。
27．（24-25高二上·北京朝阳·期末）禁食会激活下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴释放糖皮质激素(GC)(图1)，以提高血糖、保证重要器官能量供应。但禁食对HPA轴的调控机制尚需进一步的研究。
(1)图1中CRH为 激素，下丘脑通过垂体调节肾上腺分泌GC的调节方式称为 。与GC协同提高血糖水平的激素有 (写2个)。
(2)禁食会激活下丘脑中的AgRP神经元，激活的AgRP神经元膜电位表现为 。研究者据此推测禁食通过激活AgRP神经元促进HPA轴释放GC．为验证该推测，研究者激活正常饮食状态下小鼠的AgRP神经元并检测血浆GC含量，结果如图2。该实验是否足以验证推测。若能，请阐述理由；若不能，请补充实验并预期结果 。
(3)激活的AgRP神经元释放抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)和神经肽Y(NPY)。向禁食小鼠的下丘脑注射NPY受体拮抗剂、GABA受体拮抗剂后，结果如图3。实验结果表明，AgRP神经元通过 。
(4)研究发现AgRP与CRH神经元之间还存在中间神经元BNST。综上分析AgRP激活CRH神经元的机制 。
(5)临床上对于肾上腺皮质功能亢进症患者，在饮食管理方面可以采取哪些措施？并说明其可能的治疗原理。 。
【答案】(1) 促肾上腺皮质激素释放 分级调节 胰高血糖素、甲状腺激素、肾上腺素
(2) 外负內正 不能，应补充2组实验，对照组：禁食状态；实验组：禁食状态下抑制小鼠AgRP神经元，检测两组血浆GC含量。实验组GC水平低于对照组
(3)释放GABA激活HPA轴
(4)AgRP 神经元通过解除BNST对CRH的抑制而激活CRH
(5)可以采取适当增加进食频率、避免长时间禁食的措施 避免 HPA 轴的过度激活，减少 GC 的过度分泌
【分析】分析题图：禁食刺激下丘脑分泌的CRH可促进垂体分泌ACTH，ACTH也能促进肾上腺皮质分泌肾上腺皮质激素，该激素可维持血糖平衡、使免疫功能下降等。
【详解】（1）CRH是下丘脑分泌的促肾上腺皮质激素释放激素，可以促进垂体分泌促肾上腺皮质激素。丘脑通过垂体调节肾上腺分泌GC的调节方式称为分级调节，与GC协同提高血糖水平的激素有胰高血糖素、肾上腺素、甲状腺激素。
（2）AgRP神经元被激活，即产生兴奋，膜电位表现为外负內正，实验目的是探究禁食通过激活AgRP神经元促进HPA轴释放GC，研究者激活正常饮食状态下小鼠的AgRP神经元，不符合实验要求，应该还要用禁食小鼠做实验，实验思路及结论：
需要补充2组实验，对照组：禁食状态；实验组：禁食状态下抑制小鼠AgRP神经元，检测两组血浆GC含量，如果实验组GC水平低于对照组，则可证实。
（3）激活的AgRP神经元可以释放抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)和神经肽Y(NPY)，而向禁食小鼠的下丘脑注射NPY受体拮抗剂、GABA受体拮抗剂后，从图3可以看出，禁食可以升高血浆中GC含量，而加入NPY受体拮抗剂，GC含量没有降低，加入GABA受体拮抗剂后，血浆中GC含量大幅降低，说明AgRP神经元通过释放GABA激活HPA轴，促进GC分泌增加。
（4）AgRP与CRH神经元之间还存在中间神经元BNST，而AgRP会释放抑制性神经递质抑制下一个神经元的作用，当AgRP被激活后，GC含量增加，说明BNST抑制下丘脑释放CRH，可以推测，AgRP 神经元通过解除BNST对CRH的抑制而激活CRH。
（5）禁食会促进GC分泌，对于肾上腺皮质功能亢进症患者，可以取适当增加进食频率、避免长时间禁食的措施，从而避免 HPA 轴的过度激活，减少 GC的过度分泌。
28．（24-25高二上·湖南长沙·期末）紫楠是中国特有珍贵树种，其冠型优美、材质优良，不仅是家具、雕刻、建筑等的良材，还有较好的防风、防火效能，可栽作防护林带。紫楠天然分布范围较广，但因人们不合理砍伐利用等原因，现存紫楠天然种质资源已濒临枯竭。
(1)人们过于追求经济效益对紫楠不合理砍伐利用的做法违背了生态工程的 原理。
(2)紫楠主要依靠种子繁殖，研究其种子休眠解除过程中的生理生化变化规律有利于苗木生产。种子休眠可采用层积方法解除，低温层积和变温层积的效果有所不同，分别测定两种层积处理过程中种子的营养物质含量变化，部分结果如下图所示：

①结合图像分析， （选填“低温层积”或“变温层积”）更有助于紫楠种子萌发。
②由图可知，层积处理中期可溶性糖含量有所增加，可能是由于 。
(3)种子萌发期是植物生长发育的关键时期，该阶段发生逆境胁迫会延缓种子萌发及幼苗生长。
①研究发现，低浓度的NaCl溶液对种子萌发无显著影响，而在中、高浓度NaCl处理下，种子表现为萌发率显著降低，萌发时间显著延长，其可能原因是： （答出一点即可）。
②褪黑素（MT）作为一种吲哚类植物生长调节剂，在一定程度上能够调控植物种子萌发，为探究褪黑素对盐胁迫下紫楠种子萌发的缓解效应及生理机制，研究小组做了如下实验。

从实验结果可以看出，褪黑素对紫楠种子的RA有何影响： ，由此推测褪黑素对盐胁迫下紫楠种子萌发的缓解机制为 。
【答案】(1)整体
(2) 变温层积 脂肪和淀粉转换为可溶性糖
(3) NaCl浓度过高，导致植物细胞失水 褪黑素可缓解盐胁迫对紫楠种子的RA影响 褪黑素通过增强紫楠种子的RA，缓解盐胁迫
【分析】种子休眠与种子中存在脱落酸有关，只有通过层积处理将脱落酸水平降低后，种子才能正常发芽。
【详解】（1）追求经济效益，而没有保护环境，违背了生态工程的整体原理。
（2）①可溶性糖可为种子呼吸提供底物，变温层积组的可溶性糖多于低温层积组，所以变温层积更有助于紫楠种子萌发。
②层积处理导致脂肪和淀粉的含下降，所以可能是层积处理导致脂肪和淀粉转换为可溶性糖，从而可溶性糖含量有所增加。
（3）①NaCl浓度过高，导致植物细胞失水，所以在中、高浓度NaCl处理下，种子表现为萌发率显著降低，萌发时间显著延长。
②MT+NaCl组的RA大于NaCl组，说明褪黑素可缓解盐胁迫对紫楠种子的RA影响。则说明褪黑素通过增强紫楠种子的RA，从而缓解盐胁迫。
29．（24-25高三上·福建宁德·阶段练习）研究发现，基因D能通过脱落酸信号途径调控大豆的耐盐碱特性。为培育耐盐碱大豆品系，科研人员利用基因编辑技术改变基因d中一个碱基对成为基因D培育多代后，并未获得耐盐碱性状，检测发现基因D在大豆中处于沉默状态。现将基因编辑系统相关基因M插入大豆细胞染色体，打破基因D沉默状态，获得耐盐碱大豆。M基因插入染色体的位点是随机的。现向基因型相同的大豆品系导入M基因，获得仅导入一个M基因且插入位点各不相同的三种耐盐碱大豆品系：甲、乙、丙。将三种品系分别与野生大豆杂交，结果如表。不考虑自然基因突变和互换。

(1)获得D的变异类型是 ，导入向导DNA序列和M获得耐盐碱性状大豆的变异类型是 。
(2)大豆甲的基因型为 。第三组子代的表型是 。
(3)对大豆中基因D、d通过PCR扩增，再用Sac Ⅰ（5'-GAGCT'C-3'）限制酶切割后电泳，获得三种类型结果如图。

①Ⅲ对应的基因型是 。
②欲获得适合盐碱大田种植的稳定遗传大豆，请从甲、乙、丙中选择材料，运用一次杂交或自交手段和电泳技术等，选育出所需要品系。
简要写出实验思路 。
【答案】(1) 基因突变 基因重组
(2) MDd 全为不耐盐碱
(3) DD 选用体甲（MDd）进行自交，将获得的子代个体作为实验材料分别提取DNA，并用Sac Ⅰ限制酶切割后电泳，电泳图中看到两个条带电泳结果的个体即为适合盐碱大田种植的稳定遗传大豆
【分析】基因突变是DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，从而引起基因结构的改变。基因重组是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组合。染色体变异可以分为染色体结构变异和染色体数目变异。
【详解】（1）根据题意可知基因D是通过替换基因d中一个碱基对获得的，该变异类型属于基因突变，导入向导DNA序列和M获得耐盐碱性状大豆属于利用的是基因工程技术，该技术原理是基因重组。
（2）题干提供信息是用导入一个M基因的耐盐碱大豆与野生大豆杂交，野生大豆的基因型应该是dd，导入一个M基因的耐盐碱大豆的基因中肯定含有M基因和D基因，由于第一组子代个体耐盐碱：不耐盐碱=1：1，由此推测第一组甲产生的配子中同时含M与D的配子占比为1/2，实验应该是测交方式进行的，即Dd：dd=1：1，且D基因应该与M基因连锁在同一条染色体上，这样含耐碱性基因D的全部个体才能表现出耐碱性来，故大豆甲的基因型应表示为MDd。实验二的子代表现为耐盐碱：不耐盐碱=1：3，可推测乙个体产生的配子中同时含D与M基因的配子占比为1/4，可推测M基因所在的染色体与D所在的染色体为非同源染色体，且乙的基因型为MDd，减数分裂产生的配子及类型比为MD：d：D：Md=1：1：1：1，所以乙与野生型大豆dd个体杂交产生的后代中耐盐碱：不耐盐碱=1：3。导入一个M基因的耐盐碱大豆细胞中还存在另外一种情况就是M与d连锁在同一条染色体上，即丙个体，其基因型为DdM，产生的配子种类及类型比为D：Md=1：1,与野生型大豆个体dd杂交后产生的后代基因型为Dd和Mdd，两者中均没有D基因的表达，故第三组子代的表型是全为不耐盐碱的。
（3）①根据题干提供的基因D与d的序列，在基因D序列上有一个Sac Ⅰ的酶切位点，酶切后电泳，可以看到两个条带，而基因d的序列中无Sac Ⅰ的酶切位点，所以不会被酶切。故若电泳图中看到两个条带电泳结果的表示纯合突变植株DD，一个条带电泳结果的表示野生型植株dd，三个条带电泳结果的表示杂合植株Dd，所以Ⅲ对应的基因型是DD。
②欲获得适合盐碱大田种植的稳定遗传大豆，根据（2）问中的分析，可知应选用D基因与M基因连锁在同一条染色体上的个体甲（MDd）进行自交，将获得的子代个体（包括MMDD、MDd、dd三种基因型）作为实验材料分别提取DNA，并用Sac Ⅰ（5'-GAGCT↓C-3'）限制酶切割后电泳，电泳图中看到两个条带电泳结果的表示植株MMDD，该个体为纯合体，即适合盐碱大田种植的稳定遗传大豆。
30．（2024·四川巴中·一模）我国培育的多年生稻入选《科学》“2022年度十大科学突破”，多年生稻通过地下茎无性繁殖，种一次每年能收两季，连续收获四年产量不减，既可以避免年年制种又可以减少劳动强度。其品种之一“云大107”聚集多年生、稻穗优良等性状，培育过程如图所示：

请回答下列问题：
(1)已知乙、丁的一年生性状是多年生野生稻甲的突变体，多年生对一年生为 （填“显性”、“隐性”），据图分析乙、丁的一年生性状是否为甲的同一基因突变产生？ ，你作出判断的依据是 。
(2)稻穗优良性状由D/d、E/e、F/f基因调控，且三种显性基因同时存在时稻穗性状优良，可达到水稻高产效应，其中丙的基因型为ddeeff。图中戊与丁首次回交得到的子代中纯合个体所占比例为 ，图中最后将选择的多年生稻穗优良栽培新品种进行自交的目的是 。
(3)育种工作者克隆出导致乙一年生性状产生的基因，与多年生基因相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因内部出现了一个原基因没有的限制酶X的酶切位点。据此，检测丙基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→ →电泳。丙中杂合子电泳条带数目应为 条。
【答案】(1) 显性 否 若乙、丁的一年生性状为甲的同一基因突变产生，则丙与丁杂交，后代会出现一年生性状
(2) 1/8 得到能够稳定遗传的多年生稻穗优良栽培新品种
(3) 限制酶X处理 3
【分析】1、基因突变是DNA分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。
2、 电泳的原理是根据DNA的长度不一，将DNA进行以条带的形式区分开来。
【详解】（1）根据图中一对相对性状的多年生纯合体甲与一年生纯合体乙杂交，子代全为多年生稻，可判断多年生对一年生为显性。
据图分析乙、丁的一年生性状不是甲的同一基因突变产生，因为若乙、丁的一年生性状为甲的同一基因突变产生，则丙与丁杂交，后代会出现一年生性状，而实际的结果是全为多年生性状。
（2）丙的基因型为ddeeff，丁为稻穗优良纯合体，基因型为DDEEFF，两者的子代戊基因型为DdEeFf，戊与丁首次回交得到的子代中纯合个体（DDEEFF）所占比例为1/2 × 1/2 × 1/2=1/8，图中最后将选择的多年生稻穗优良栽培新品种进行自交的目的是得到能够稳定遗传的多年生稻穗优良栽培新品种。
（3）检测丙基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→限制酶X处理→电泳。丙中杂合子多年生基因一条带，一年生基因因出现一个限制酶X的酶切位点会出现2条带，因此一共出现电泳条带数目应为3条。
31．（2024·福建厦门·二模）酿酒酵母细胞质钙离子浓度的调控与酿酒酵母的抗逆性、生长增殖过程有关。Cchlp是一种位于酿酒酵母细胞膜的钙离子通道蛋白、调控细胞外钙离子流入细胞质。研究小组利用基因工程获取Cchlp抗原、制备Cchlp单克隆抗体来检测酿酒酵母Cehlp的表达情况。其中制备Cch1p抗原的流程如图1所示：
请回答以下问题：
(1)过程①需要 酶进行催化，并添加 作为原料，从而获得多种eDNA单链。
(2)Cchlp含2039个氨基酸，其中抗原区域约含300个氨基酸。现根据抗原区域氨基酸序列，查找对应基因序列，设计如下引物进行PCR。（引物F为基因上游引物，引物R为基因下游引物）
引物 F：5'-AGGAGG……CCATT-3'
引物 R：5'-GATTCC……GGGTT-3'
为使PCR获得的Cchlp抗原基因能与PET-28a质粒正确连接，应在引物中加入合适的限制酶识别序列。加入限制酶序列后引物F序列为5'-GACACCATATGAGGAGG……CCATT-3'（下划线部分为限制酶识别序列），引物R序列应为____。
A．5'-AGGACG……CCATTCATATGGACAC-3'
B．5'-GACACCTCGAGGATTCC……GGGTT-3'
C．5'-GATTCC……GGGTTCTCGAGGAGAC-3'
D．5'-GACACCCCGGGGATTCC……GGGTT-3'
(3)将PCR产物和标准参照物分别加入泳道1、泳道2进行电泳。
加样孔位于 （填写“甲”或“乙”）端。泳道1条带中的PCR产物 （填写“一定”或“可能”或“不”）是目的基因，理由是 。
(4)应在含 的固体培养基中培养重组大肠杆菌，经鉴定获得含目的基因的大肠杆菌，分离提纯得到Cchlp抗原。
(5)利用杂交瘤细胞技术制备Cch1p单克隆抗体的过程中有两次需要用到Cchlp抗原，请写出其使用方法 。
【答案】(1) 反转录酶（逆转录酶） （四种）脱氧核苷酸（或dNTP）
(2)B
(3) 甲 可能 Cch1p抗原区域约300个氨基酸，可知其对应的基因片段长度约900个碱基对。图2结果显示PCR产物长度约900个碱基对左右，与预期相符。但是PCR结果不能说明产物的碱基对序列与Cch1p抗原基因一致，还需进一步测序才能确定
(4)卡那霉素
(5)①使用Cch1p抗原对小鼠进行免疫；②对杂交瘤细胞应使用Cch1p抗原进行抗体阳性检测
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）过程①表示反转录（逆转录）过程，需要反转录酶（逆转录酶）进行催化，产物为DNA，需要添加（四种）脱氧核苷酸（或dNTP）作为原料。
（2）为使PCR获得的Cchlp抗原基因能与PET-28a质粒正确连接，需要使用两种不同的限制酶进行切割质粒和Cchlp抗原基因，结合图1，选择的限制酶为Nde Ⅰ和Xh Ⅰ，所以在PCR扩增Cchlp抗原基因时在引物上需要添加相应的序列，结合上游加入限制酶序列后引物序列为5'-GACACCATATGAGGACG……CCATT-3'可知，5'端可以被限制酶Nde Ⅰ识别切割，下游引物的5'端在原有引物序列的基础上需要添加限制酶Xh Ⅰ的识别序列，结合图1和选项，B符合条件，所以引物R序列应为5'-GACACCTCGAGGATTCC……GGGTT-3'，B正确，ACD错误。
故选B。
（3）电泳条带的远近与分子质量大小有关，所以加样孔位于甲端。Cch1p抗原区域约300个氨基酸，可知其对应的基因片段长度约900个碱基对。图2结果显示PCR产物长度约900个碱基对左右，与预期相符，所以可能是目的基因。但是PCR结果不能说明产物的碱基对序列与Cch1p抗原基因一致，还需进一步测序才能确定。
（4）根据图1可知，PET-28a质粒上含有卡那霉素抗性基因，所以应在含卡那霉素的固体培养基中培养重组大肠杆菌，经鉴定获得含目的基因的大肠杆菌，分离提纯得到Cchlp抗原。
（5）利用杂交瘤细胞技术制备Cch1p单克隆抗体的过程中有两次需要用到Cchlp抗原，请写出其使用方法：①使用Cch1p抗原对小鼠进行免疫；②对杂交瘤细胞应使用Cch1p抗原进行抗体阳性检测。
32．（2025·黑龙江·模拟预测）CD87是一种癌细胞膜上的受体蛋白，与癌细胞的转移和增殖有关。研发针对CD87的抗体类药物能提高癌症的治愈率。
(1)单克隆抗体制备过程如图所示，其中HAT培养基用于筛选杂交瘤细胞。

细胞①表示小鼠的 细胞，获取杂交瘤细胞后，需在全营养培养基中培养一段时间，目的是 。经过筛选的杂交瘤细胞可通过注入小鼠腹腔或在培养液中进行扩大培养并不断产生单克隆抗体。
(2)双特异性抗体是指同时具有两种抗原结合位点的人造抗体，研究人员利用基因工程等技术制备具有CD3和CD87结合位点的双特异性抗体(见图2)。备注：CD3是T细胞表面特异性抗原，在所有T细胞膜上均有表达，该抗原被激活后，能极大促进T细胞的免疫效力。
①设计目的基因序列：通过查阅基因数据库，获得CD3和CD87蛋白对应的碱基序列和氨基酸序列，为使两种抗体蛋白能结合形成有功能的抗体，利用计算机辅助设计技术，进行蛋白质工程，其基本流程是 。蛋白质工程的基础是 。
②获取目的基因：利用 获取目的基因后，通过PCR扩增，采用的引物如图3所示。

③构建重组质粒：选用含LacO位点的质粒作为载体。LacO位点常与阻遏蛋白(LacⅠ基因表达产物)结合，阻止RNA聚合酶的移动，环境中的乳糖能解除阻遏蛋白的作用。将目的基因与质粒连接，形成图4所示的重组质粒。LacO位点的作用是 。
④重组质粒的导入和检测：将重组质粒与经CaCl2处理的大肠杆菌共培养一段时间后，将菌种接种在含四环素的培养基中培养，获得的大肠杆菌需鉴定是否含有重组质粒，原因是 。提取大肠杆菌总DNA后，根据表中4种限制酶的识别序列，采用 酶进行酶切，电泳后若存在 bp左右长度的条带，则说明导入了重组质粒。
⑤双特异性抗体的生产：将筛选出的大肠杆菌扩大培养后，接种在发酵罐中进行大规模发酵。
(3)相对于单克隆抗体，图示双特异性抗体在治疗癌症时的效果更好，推测原因是 。
【答案】(1) （已免疫的）B淋巴 (扩大培养)增加杂交瘤细胞数量
(2) 从预期蛋白质的功能出发→设计预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 蛋白质分子结构规律及其与生物功能之间的关系 人工合成 调控目的基因的转录 含有空质粒和质粒与质粒连接产物的大肠杆菌也能在含四环素的培养基中存活 BamHI和XhI 1150
(3)该双特异性抗体既能结合癌细胞表面的受体蛋白CD87，又能结合T细胞表面的特异性抗原CD3，且CD3抗原被激活后，能极大促进T细胞的免疫效力，从而实现定向杀伤癌细胞作用
【分析】单克隆抗体的制备过程是：对小动物注射抗原，从该动物的脾脏中获取效应B细胞，将效应B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能产生单一抗体的杂交瘤细胞，克隆化培养杂交瘤细胞（体内培养和体外培养），最后获取单克隆抗体。诱导动物细胞融合的方法有：物理法（离心、振动）、化学法（聚乙二醇）、生物法（灭活的病毒）。
【详解】（1）单克隆抗体制备过程中，利用可以无限增长的骨髓瘤细胞与能产生特定抗体的已免疫的B淋巴细胞融合形成杂交瘤细胞，经过多次筛选，可获得既可产生特定抗体，又可无限增殖的杂交瘤细胞，因此故细胞①表示经过免疫的小鼠B淋巴细胞；在全营养培养基中，细胞可获得其生长发育所需的全部营养物质，容易存活增殖，因此获取杂交瘤细胞后，需在全营养培养基中培养一段时间，目的是扩大培养增加杂交瘤细胞数量。
（2）①天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：基因→表达（转录和翻译）→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。而蛋白质工程却与之相反，它的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质；蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造，蛋白质的结构决定蛋白质的功能，故蛋白质工程的基础是：蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系。
②根据题意，这里的目的基因是根据设计的蛋白质结构，推测出应有的氨基酸序列，再找到目的基因的碱基序列，因此获取目的基因的方法是根据目的基因的碱基序列利用人工合成法获取目的基因后，通过PCR扩增。
③根据题意，LacO位点常与阻遏蛋白结合，阻止RNA聚合酶的移动，环境中的乳糖能解除阻遏蛋白的作用，由此可见LacO位点的作用是调控目的基因的转录。
④题图中，terr是四环素抗性基因，因含有空质粒和质粒与质粒连接产物的大肠杆菌也含有四环素抗性基因，也能在含四环素的培养基中存活，故在含四环素的培养基中培养一段时间获得的大肠杆菌需鉴定是否含有重组质粒；对比引物1和引物2虚线框序列和4种限制酶识别可知，引物1中含有BamHⅡ的识别序列5'-GGATCC-3'，引物2中含有XhⅠ的识别序列5'-CTCGAG-3'，因此采用BamHI和XhI酶进行酶切；因目的基因长度为1140bp，用BamHⅡ切割图中目的基因（包含引物1序列）的左端后，在长度为1140的目的基因的左端多出14个脱氧核苷酸，即7对含氮碱基，在目的基因的右端（含引物2所含序列）用XhⅠ切割后，在原目的基因的右端之后多出6个脱氧核苷酸，即多出3个碱基对，因此电泳后若存在1140+7+3=1150bp左右长度的条带，则说明其含有目的基因，即导入了重组质粒。
（3）相对于单克隆抗体，图示双特异性抗体具备CD3和CD87结合位点，其中CD3是T细胞表面特异性抗原，在所有T细胞膜上均有表达，因此双特异性抗体既可特异性结合T细胞表面的CD3，该抗原被激活后，能极大促进T细胞的免疫效力，又能特异性结合癌细胞表面的受体蛋白CD87，从而实现定向杀伤癌细胞作用，在治疗癌症时取得更好的效果。
组别
研究对象
处理方式
血糖/mml∙L-1
甘油三酯/mml∙L-1
胰岛素/mml∙L-1
胰岛素/mml∙L-1
一
正常大鼠
葡萄糖
4.3
0.6
121
-6.25
二
模型大鼠
葡萄糖
6.6
0.9
264
-7.46
三
模型大鼠
葡萄糖+罗格列酮
4.2
0.5
133
-6.33
四
模型大鼠
葡萄糖+格列奇特
4.1
0.6
245
-7.31
五
模型大鼠
葡萄糖+荔枝核皂苷
5.2
0.5
156
-6.40
限制酶
EcRⅠ
XbaⅠ
SpeⅠ
BamHⅠ
识别序列及切割位点
限制酶
SnaBI
AvrII
SacI
Bg1II
识别序
列及酶
切位点
识别序列及切割位点
名称
HindIII
A↓AGCTT
PvitlI
CAG↓CTG
KpnI
G↓GTACC
PstI
CTGC↓AG
BamHI
G↓GATCC
突变基因
A
B
D
碱基变化
C→CG
C→T
CTT→C
蛋白质
与野生型分子结构无差异
与野生型有一个氨基酸不同
长度比野生型明显变短
代系
F1
F2
表型
黄绿色果皮
黄绿色果皮
浅绿色果皮
白色果皮
数量
全部
138
45
59
杂交组合
F1表现型
F2表现型
甲×乙
不甜
1/4甜、3/4不甜
甲×丙
甜
3/4甜，1/4不甜
乙×丙
甜
13/16甜、3/16不甜
F1（AaBb）自交后代表型比例
原因分析
9:7
两个显性基因同时存在时表现为一种性状，其他基因型表现为另一种性状（9A_B_）：（3A_bb+3aaB_+1aabb）
12:3:1
只要A（B）存在就表现为一种性状，其他正常表现（9A_B_+3A_bb）：
3aaB_：1aabb
9:3:4
a（b）成对存在时表现为一种性状，其他正常表现（9A_B_）：（3A_bb）：
（3aaB_+1aabb）或（9A_B_）：3aaB_：（3A_bb+1aabb）
9:6:1
单独存在A或B时表现为同一种性状，其余正常表现
（9A_B_）：（3A_bb+3aaB_）：1aabb
15:1
存在显性基因（A或B）时为同一种性状，其余正常表现
（9A_B_+3A_bb+3aaB_）：1aabb
13:3
只存在一种显性基因（如A）时表现为一种性状，其余基因型表现为另一种性状（9A_B_+3aaB_+1aabb）：3A_bb
组别
亲本耐盐碱大豆
子代
第一组
甲
耐盐碱：不耐盐碱=1：1
第二组
乙
耐盐碱：不耐盐碱=1：3
第三组
丙
？
酶
识别序列
EcRⅠ
5＇-G^AATTC-3＇
BgⅢ
5＇-A^GATCT-3＇
BamHⅠ
5＇-G^GATCC-3＇
XhⅠ
5＇-C^TCGAG-3＇
备注：“^”表示酶切位点