生物人教版 (2019)第1节 重组DNA技术的基本工具图片ppt课件

这是一份生物人教版 (2019)第1节 重组DNA技术的基本工具图片ppt课件，共35页。PPT课件主要包含了选择与进化，采用科学绿色的手段，转基因，新的生物类型，分子水平，重组DNA技术，基因重组，DNA分子水平，生物体外，限制性内切核酸酶等内容，欢迎下载使用。
是什么原因导致了棉铃虫的抗药性？我们如何才能解决农药无法解决的虫害问题？
资料 苏云金杆菌含有Bt抗虫蛋白基因（简称Bt基因)，指导合成的伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）可破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
思考： 如何利用Bt抗虫蛋白基因培育抗虫棉？
指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
获得新的生物类型和生物产品。
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状。
①不同生物的DNA能够进行拼接吗？
②Bt基因在棉花细胞中能够表达吗？
①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位②遗传信息的传递都遵循中心法则③生物界共用一套遗传密码
不同生物的DNA分子的结构基本相同
剪切→拼接→导入→表达
一、限制性内切核酸酶--“分子手术刀”
主要从原核生物中分离纯化出来
迄今分离的限制酶有数千种
具有专一性。具体表现如下
特定切点上的磷酸二酯键
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
5、两种常用的限制酶：
限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcRI为例: E：Escherichia (属) c：cli (种) R：RY13 (品系) I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序EcRⅠ：大肠杆菌（Escherichia cli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
5、（1）EcRI限制酶的切割:
当限制酶在它识别序列得中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
5、（2）SmaI限制酶的作用
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶在它识别序列中轴线处切开时，产生的是平末端。
7、限制酶的识别序列的特点
(1)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成
1.限制性内切核酸酶----“分子手术刀”
思：仔细观察各识别区域中两条链的碱基排列顺序，你发现了什么规律？
(3)限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列
（1）写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH Ⅰ: EcR Ⅰ:Hind Ⅲ:Bgl Ⅱ:
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。（P75）
（2）要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性末端？产生几个游离的磷酸基团？
要切两个切口，产生四个黏性末端，产生四个游离的磷酸基团。
（3）如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生 黏性末端。
（4）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。
我们每天吃很多动植物食材，也摄入了它们的DNA，但是我们并没有因此就被这些DNA操控。这是因为外源DNA片段难以进入细胞内，即使进入也很难稳定存在并表达。因此，基因工程需要运输工具（分子运输车）将外源目的基因安全运输到细胞中。将外源目的基因切割并做成运输车的一部分，可以保证运输成功，这就需要用分子手术刀对DNA进行切割，并使用分子缝合针把它们缝合起来。
DNA连接酶——“分子缝合针”
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
两DNA片段要具有相同的黏性末端才能拼起来
E.cli DNA连接酶
（2）T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率 相同。
1.判断以下说法是否正确：
因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。
（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶 连接起来。
（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。
T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但效率相对较低。
②T4 DNA连接酶的缝合作用
★注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
4.运载体需具备的条件
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
①有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入（携带）目的基因；
②在受体细胞中稳定存在并能自我复 制或整合到受体DNA上，随受体 DNA同步复制；
③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA 分子的细胞；
抗性基因或荧光蛋白基因
④对受体细胞无害、易分离。
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
3.运载体需具备的条件：
①在受体细胞中稳定存在并能自我复制 或整合到受体DNA上，随受体DNA同 步复制；
②有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入（携带）目的基因；
③具有标记基因，便于筛选含有重组 DNA分子的细胞；
霍乱弧菌的质粒有多个限制酶切位点，你会用它做载体吗？
如何确定目的基因是否进入受体细胞了？
4.最常用的载体——质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
其基因属于细胞质基因。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
（1）最常用的载体是质粒 基因工程中用的质粒都是天然质粒吗？ 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。例如加上一些特殊的标记基因。（2）噬菌体（3）动植物病毒 它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
初步分离DNA和蛋白质
富含DNA的材料(如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等)、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
（1）通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
①研磨的目的：②研磨时间不宜太长：③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶：④研磨不宜太用力
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
研磨效果好（有利于充分研磨）
（2）过滤获取含DNA的上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
低温放置几分钟的作用：
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
（3）冷却酒精析出DNA
取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
鉴定结果不明显的可能原因：①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变色，影响鉴定效果。
1.怎么确认实验提取出来的是DNA所含杂质较少？若鉴定结果呈现蓝色比 较浅，说明什么问题？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因：
操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14ml/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。
操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2ml/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
方法二：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。