2021高三生物人教版一轮教师用书：选修3第1讲　基因工程



第1讲　基因工程

1.基因工程的诞生(Ⅰ)
2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)
3.基因工程的应用(Ⅱ)
4.蛋白质工程(Ⅰ)
　
1.基因的结构与功能。(生命观念)
2.基因工程的操作流程图及蛋白质的流程图等。(科学思维)
3.基因工程的应用和蛋白质工程。(科学探究)
4.正确看待转基因生物与环境安全问题。(社会责任)

基因工程的基本工具及基本程序


1．基因工程的概念
(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：
识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
种类
E·coli_DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
③运载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
3．基因工程的基本程序
(1)目的基因的获取
①从基因文库中获取
②人工合成
③利用PCR技术扩增
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成

(3)将目的基因导入受体细胞
①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法
生物类型
植物
动物
微生物
受体细胞
体细胞
受精卵
大肠杆菌或酵母菌等
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射法
感受态细胞法
(4)目的基因的检测与鉴定
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
个体水平
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交
目的基因是否翻译
抗虫或抗病接种实验
是否具有抗虫抗病特性
分子水平
4.PCR技术
(1)原理：DNA双链复制。
(2)条件

(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题
(1)获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。
(3)限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。
(4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
2．载体上标记基因的作用
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：

3．基因工程操作的四个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶或裸子植物的细胞，并将其Ti质粒上的T­DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。


1．非洲爪蟾核糖体蛋白基因可以与质粒重组，并且在大肠杆菌细胞中表达，其遗传学基础是什么？
提示：非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒均具有相同的组成单位和双螺旋结构，且不同生物的密码子相同。

2．用箭头及简要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。
提示：基因组文库的构建过程：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。
部分基因文库的构建过程为：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。

考查基因工程的工具
1．(2019·沈阳市东北育才学校高三模拟)青蒿素是最有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tms基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图。

(1)科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是______________________________________。
(2)图中结构P、T是基因成功转录的保证，其中结构P的作用__________________。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是__________。
(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，____________________是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是__________________________。
(4)T­DNA的作用是可以使______________________，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用________技术。
(5)与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是_________________________。
[解析]　(1)目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，而导入植物细胞最常用农杆菌转化法，因此，科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是农杆菌转化法。
(2)图中结构P、T与基因的转录有关，即基因成功转录的保证，T为终止子，则P为启动子，它的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是标记基因。
(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，基因表达载体的构建是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接。
(4)T­DNA的作用是可以使目的基因进入植物细胞，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用DNA分子杂交技术。
(5)冠瘿组织的生长与细胞的分裂和伸长等有关，由此推知冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进其生长。
[答案]　(1)农杆菌转化法　(2)RNA聚合酶识别和结合的部位　标记基因　(3)基因表达载体的构建(或构建基因表达载体)　可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接　(4)目的基因进入植物细胞　DNA分子杂交　(5)tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长
基因工程的操作程序
2．(2019·晋冀鲁豫高三联考)真核生物基因中通常含内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。研究发现绿色木霉合成并分泌的环氧化水解酶可降解黄曲霉素B1。现有含绿色木霉的菌液，为获得环氧化水解酶，研究小组进行以下两种尝试：
(1)方法一
①从含有绿色木霉的菌液中提取细胞的mRNA，在________酶的催化下，合成cDNA。
②以cDNA为模板，通过________技术大量扩增，获得目的基因。
③构建目的基因表达载体，导入大肠杆菌的体内。
④目的基因在大肠杆菌体内正常转录，但是翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性，需做进一步的处理加工，原因在于________。
(2)方法二
①提取绿色木霉的全部DNA，选用适当的________酶处理后，会获得一些小的DNA片段。
②选择一些合适的载体与获取的DNA片段构建基因表达载体。与从cDNA文库中获取目的基因构建表达载体所用载体相比，该载体组成不需要添加__________________成分。
③载体和这些DNA片段连接起来，导入受体菌的群体中储存。
④从这些受体菌的群体中筛选出含有目的基因的受体菌，分离出目的基因，将该目的基因和载体结合，通过________法导入大肠杆菌体内。
⑤该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于________________________________________。
[解析]　(1)以mRNA合成cDNA的过程为逆转录。以已知的cDNA为模板扩增目的基因的过程称为PCR技术。绿色木霉为真核生物，合成并分泌的环氧化水解酶为分泌蛋白，而大肠杆菌为原核生物，细胞内无内质网和高尔基体，因此在其体内翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性。
(2)由提取绿色木霉的全部DNA获取一些小的DNA片段需要用限制酶进行处理。从cDNA文库中获取目的基因中无启动子和终止子。将该目的基因导入大肠杆菌的方法为转化法。从基因组文库里分离出的该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于目的基因中存在内含子。
[答案]　(1)①逆转录　②PCR　④环氧化水解酶是分泌蛋白，需要内质网和高尔基体加工　(2)①限制　②启动子、终止子　④转化　⑤目的基因中存在内含子
3．(2019·郴州市高三二模)甘蔗黄叶综合症是一种由甘蔗黄叶病毒所引起的禾本科植物病毒，科学家通过甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因(简称CP蛋白基因)转化植物来获得抗病转基因新品种。
(1)首先从甘蔗黄叶综合症的病叶中提取RNA，此过程中为了防止RNA被分解，需加入________抑制剂，以提取的RNA为模板通过________获得cDNA。
(2)对获取的cDNA进行PCR扩增，在此反应体系中，除了模板DNA、dNTP外，还需加入________，获得大量的cDNA需要在4 ℃的低温下保存备用，原因是________________________________。
(3)将cDNA和质粒用同一种限制酶切割，产生相同的平末端，再用________将二者进行连接(填“E·coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。在培养基上接种培养大肠杆菌作为受体细胞，同时加入一定量的CaCl2低温冷却液，目的是制备________细胞，其具有的特殊功能是____________________________。
(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得________作为检测剂。
[解析]　(1)RNA酶可将RNA水解，因此为了防止RNA被分解，需加入RNA酶抑制剂；以RNA为模板获得cDNA的过程称为逆转录。
(2)采用PCR技术扩增目的基因时的条件有模板DNA、dNTP、引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)；获得大量的cDNA需要在4℃的低温下保存备用，原因是高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性。
(3)DNA连接酶包括E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端。用CaCl2处理微生物细胞可使其成为感受态细胞，其具有的特殊功能是能吸收周围环境中的DNA分子。
(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)作为检测剂。
[答案]　(1)RNA酶　逆转录　(2)引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)　高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性　(3)T4DNA连接酶　感受态　能吸收周围环境中的DNA分子　(4)CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)
基因工程的应用和蛋白质工程


1．植物基因工程
(1)培育抗虫转基因植物：用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(2)抗病转基因植物：使用最多的是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因。
(3)抗逆转基因植物：抗逆基因有抗旱基因、抗除草剂基因等。
(4)利用转基因改良植物的品质：如提高玉米中某种氨基酸含量、延长番茄储存时间、培育新花色的矮牵牛等。
2．动物基因工程
(1)提高动物生长速度：将外源生长激素基因转入动物体内，可以提高产量。
(2)用于改善畜产品的品质：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，可以使转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低。
(3)用转基因动物生产药物：将药用蛋白基因与乳腺蛋白的启动子等调控组件重组在一起，培育乳腺生物反应器。
(4)用转基因动物作器官移植的供体。
3．基因工程药品
(1)受体细胞：多为原核细胞。原因是其繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少。
(2)方式：利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。
(3)成果：利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
4．基因治疗
(1)概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。
(2)类型：体外基因治疗和体内基因治疗。
(3)实质：正常基因的表达掩盖病变基因的表达，达到治疗疾病的目的。
(4)成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者的淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。
5．蛋白质工程
(1)概念
以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
(2)流程图

写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
(3)蛋白质工程与基因工程的比较
①区别
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
②联系
a．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
b．基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。


1．利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是什么？
提示：药用蛋白基因没有转录或翻译。

2．研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程。
提示：从预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

3．请简要写出从个体水平鉴定抗虫棉是否培育成功的设计思路。
提示：取一定量长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，取等量长势一致的普通棉花植株接种等量棉铃虫作为对照组。在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并统计两组棉花叶片的受损程度。

基因工程的应用
1．(2019·河北省武邑中学高三质检)植物甲含有A基因，其编码的蛋白质中富含赖氨酸。科学家通过基因工程培育出的转基因玉米也能合成甲的富含赖氨酸的蛋白质，使玉米中赖氨酸的含量比原来提高30%。请回答：
(1)在获取目的基因时，常从甲的细胞中提取富含赖氨酸的蛋白质的mRNA，并利用mRNA人工合成cDNA。上述人工合成cDNA的过程称作________；与甲细胞中的A基因相比，cDNA中不具有调控基因表达的________________________________等组件。
(2)在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的T­DNA中，原因是__________________________。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，这种处理的作用是________________________。
(3)在获得转基因玉米后，可采用核酸分子杂交技术对玉米细胞中是否存在A基因的转录产物进行检测，检测时需用____________制作基因探针。
(4)实验发现，某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，而用乙的体细胞离体培养所产生的植株100%富含赖氨酸。将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程称为______________。若乙中的A基因都能表达，且不考虑突变和染色体交叉互换，乙自交子代富含赖氨酸的个体占15/16，原因是__________________________。
[解析]　(1)根据题意分析，上述人工合成cDNA的过程是以RNA为模板合成DNA的过程，为逆转录过程；与A基因相比，人工合成的cDNA中不含启动子、终止子和内含子。
(2)农杆菌细胞中的Ti质粒上的T­DNA(可转移DNA)能进入玉米细胞并整合到玉米染色体DNA上，因此在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的T­DNA中。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共同培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，以吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染。
(3)检测A基因(目的基因)可以用DNA分子杂交法，该过程需要用含A基因的DNA片段(或A基因)制作基因探针。
(4)将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程为植物组织培养。根据题意分析，将某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，即只有1/16(1/4×1/4)的个体不富含赖氨酸，相当于两对杂合子的自交实验，说明乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因。
[答案]　(1)逆转录　启动子、终止子、内含子　(2)T­DNA能进入并整合到玉米染色体DNA上　吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染　　(3)含A基因的DNA片段(或A基因)　(4)组织培养　乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因
2．(2019·保定市高三期末)干扰素具有抗病毒、抑制肿瘤及免疫调节等多种生物活性。质粒中的LacZ基因可表达出β­半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X­gal时，X­gal便会被β­半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌形成蓝色菌落，反之则形成白色菌落。如图是将人干扰素基因导入大肠杆菌，培养后生产干扰素的过程。

(1)在获得干扰素基因后，常采用PCR技术大量扩增。该技术的基本过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链，______________与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行______________，如此重复循环多次。
(2)过程①最好选用的限制酶是____________，在进行②过程前，需事先用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于________。为了筛选含有重组质粒的大肠杆菌，需要在培养大肠杆菌的培养基中额外加入__________________________，培养一段时间后挑选出________(填“蓝色”或“白色”)的菌落进一步培养获得大量目的菌。
(3)某些干扰素可抑制肿瘤细胞DNA的合成，通过减缓细胞______________分裂过程抑制肿瘤。还有些干扰素可提高吞噬细胞将抗原呈递给____________的能力，从而在免疫调节中发挥作用。
[解析]　(1)PCR技术的基本过程是在高温下，目的基因DNA受热变性后解链为单链；温度降低，引物与单链相应互补序列结合；然后，温度回升时，在DNA聚合酶的作用下进行互补链的合成，如此重复循环多次。
(2)为了产生相同的黏性末端，获取目的基因和切割载体时通常使用同种限制酶。由题图可知，质粒和目的基因均具有EcoRⅤ、BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶切割位点，但EcoRⅤ限制酶会破坏干扰素基因，因此过程①不能选用该酶，最好选用BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶。将重组质粒导入大肠杆菌细胞，需事先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使大肠杆菌细胞处于感受态。选用BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶切割质粒和目的基因，重组质粒中青霉素基因完好，可正常表达，对青霉素具有抗性；而LacZ基因被破坏，无法表达出β­半乳糖苷酶，无法使无色的IPTG和X­gal变蓝，显白色。因此，在培养基中加入IPTG、X­gal和青霉素，只有成功导入目的基因的重组质粒的细菌(即目的菌)才能不被青霉素杀死，同时表现为白色。
(3)癌细胞的增殖方式为有丝分裂。因此，某些干扰素可抑制肿瘤细胞DNA的合成，通过减缓细胞有丝分裂过程抑制肿瘤。还有些干扰素可提高吞噬细胞将抗原呈递给T淋巴细胞的能力，从而在免疫调节中发挥作用。
[答案]　(1)引物　互补链的合成(或延伸)　(2)BamHⅢ和EcoRⅠ　感受态　IPTG、X­gal和青霉素　白色　(3)有丝　T淋巴细胞
蛋白质工程及应用
3．香港大学的研究人员将某印度芥菜的HMGS基因编码的蛋白质的第359位氨基酸“丝氨酸”替换成“丙氨酸”后形成s359a蛋白，通过一定的方法获得新HMGS基因，然后将其导入番茄细胞，获得类胡萝卜素增加111%的转基因番茄，该番茄具有强抗氧化性。请回答下列问题：
(1)请按照蛋白质工程的原理写出获得新HMGS基因的基本途径：_______________________________________________________
_______________________________________________________
______________________________________________________。
(2)如图的4种质粒中，E表示EcoR Ⅰ的切割位点，将这些质粒用EcoR Ⅰ充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为________个，接着将新HMGS基因分别与这4组酶切产物、DNA连接酶在适宜环境下混合，编号为1、2、3、4组，结果发现除第________组外，其余3组都有含新HMGS基因的基因表达载体(重组质粒)出现。基因表达载体的组成除目的基因和标记基因外，还包括________及复制原点。

(3)若质粒3是农杆菌的Ti质粒，则图示E所处的位置在Ti质粒上的________，将含新HMGS基因的重组Ti质粒的农杆菌导入番茄细胞，成功获得含新HMGS基因的转基因番茄，将其果实色素提取后，用________法分离，可发现滤纸条上____________(填颜色)的条带比第4组的宽。
[解析]　(1)蛋白质工程的原理为从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，由此可写出获得新HMGS基因的基本途径：从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列。
(2)图中质粒1、2、3、4上的限制酶EcoR Ⅰ切割位点分别为3、2、1、0，用EcoRⅠ充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为3、2、1、0。第4组无EcoR Ⅰ切割位点，因此无法构建基因表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子以及复制原点。
(3)Ti质粒上的T­DNA可将目的基因转移到受体细胞且整合到受体细胞染色体的DNA上。色素的提取方法为纸层析法。新HMGS基因导入番茄细胞，获得的类胡萝卜素增加，因此滤纸条上橙黄色和黄色的条带比第4组的宽。
[答案]　(1)从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列[或从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)]　(2)3、2、1、0　4　启动子和终止子
(3)T­DNA　纸层析　橙黄色和黄色
真题体验| 感悟高考　淬炼考能
1．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是____________________________________________
______________________________________________________。
[解析]　(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
[答案]　(1)基因组文库　cDNA文库
(2)解旋酶　加热至90～95 ℃　氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
2．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_________________________________
_______________________________________________________
________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
[解析]　(1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。
[答案]　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化　外壳蛋白(或噬菌体蛋白)　细菌
(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
3．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1­GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析]　(1)据图示信息分析：将L1­GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1­GFP融合基因的完整，又能保证L1­GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
[答案]　(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接　(2)转录　翻译　(3)细胞核　去核卵母细胞
(4)核DNA
4．(2017·全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_________________________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是
_______________________________________________________
______________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_______________________
__________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是______________________________________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_______________________________________________________
______________________________________________________。
[解析]　(1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。
(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。
(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。
(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。
[答案]　(1)嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解　(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA　(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子　(4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常