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2020版《全程复习方略》高考生物一轮复习课堂互动探究案1基因工程 学案
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课堂互动探究案1 基因工程
基因工程的概念及操作工具(国考5年4考)
(全国卷：2018全国卷Ⅰ、Ⅱ；2016全国卷Ⅲ；2014全国卷Ⅱ；地方卷：2018北京卷；
2016天津、江苏卷；2015天津、福建、重庆、浙江、江苏卷；2014天津、北京、山东、江苏、海南卷)
【师说考问】
考问1 基因工程概念理解
基因工程的别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
原理
基因重组
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
结果
人类需要的基因产物或生物类型
供体
提供目的基因
受体
表达目的基因
本质
目的基因在受体体内的表达
优点
可定向改造生物的遗传性状
考问2 DNA重组技术的基本工具理解
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
(2)DNA连接酶
常用类型
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
连接黏性末端
连接黏性末端或平末端
结果
都缝合磷酸二酯键，如图
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
考问3 下图为限制酶和DNA连接酶的关系，据图回答
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？相同。
(2)DNA连接酶起作用时是否需要模板？不需要。
考问4 探究载体所具条件的意义
条 件
意 义
稳定并能自我复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
【题组跟进】
高考题组——研考向
基因工程操作工具的基础考查
1．[2018·北京卷，5]用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( )
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
解析：限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoⅠ和SalⅠ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的粘性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；SalⅠ将DNA片段切成4段，XhoⅠ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ，泳道②为XhoⅠ，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA为主，只在黏性末端出现部分单链，D错误。
答案：D
基因工程操作工具的综合考查
2．[2018·全国卷Ⅰ节选]回答下列问题：
(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________________(答出两点即可)。
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
3．[2018·全国卷Ⅱ，38节选]某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________________________________________________________________________。
使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
解析：(1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)世界基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。
答案：(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
4．[2016·全国卷Ⅲ，40]图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是____________________。
甲
乙
丙
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有__________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________________。
解析：(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
答案：(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
(3)E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
5．[2014·全国卷Ⅱ，40]植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题：
(1)理论上，基因组文库含有生物的__________基因；而cDNA文库中含有生物的__________基因。
(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中__________出所需的耐旱基因。
(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物__________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的__________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的__________是否得到提高。
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为31时，则可推测该耐旱基因整合到了____________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。
解析：(1)基因文库有两种：基因组文库和部分基因文库，基因组文库含有生物的全部基因；cDNA是以mRNA为模板逆转录得到的，而细胞中只有部分基因表达，所以cDNA文库含有生物的部分基因。(2)建立基因文库后要根据目的基因的特性从中筛选出目的基因。(3)目的基因与载体构建基因表达载体后，导入乙植物细胞(受体细胞)，需要进行表达产物(蛋白质)和生物个体水平(耐旱性)等的检测。(4)若是整合到同源染色体的两条上，则此耐旱二倍体植株为纯合子，自交后代不会发生性状分离，所以根据实验结果可推测：该耐旱基因整合到了同源染色体的一条上。
答案：(1)全部 部分(其他合理答案也可)
(2)筛选(其他合理答案也可)
(3)乙 表达产物(其他合理答案也可) 耐旱性
(4)同源染色体的一条上
6．[2012·全国卷，40]根据基因工程的有关知识，回答下列问题。
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有__________和__________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATT C……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是____________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即__________DNA连接酶和__________DNA连接酶。
(4)反转录作用的模板是__________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用__________技术。
(5)基因工程中除质粒外，__________和__________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是__________________________________________。
解析：此题考查基因工程应用的相关知识。(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。(2)为使运载体与目的基因相连，应使二者被切割后产生的末端相同，故用另一种限制酶切割产生的末端必须与EcoR Ⅰ切割产生的末端相同。(3)根据酶的来源不同，DNA连接酶分为E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(4)以RNA为模板，合成DNA的过程称为逆转录，若要体外获得大量DNA分子，可以使用PCR技术。(5)在基因工程中，通常利用质粒作为运载体，另外噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。(6)大肠杆菌作为受体细胞时，常用Ca2＋处理，使之成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。
答案：(1)平末端 黏性末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的末端相同
(3)T4 E·coli
(4)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR(聚合酶链式反应)
(5)动植物病毒 噬菌体
(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
[题后归纳]
1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连
接酶
磷酸二酯键
DNA片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚
合酶
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
DNA
DNA水
解酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA分子局部分解为两条长链
RNA聚
合酶
磷酸二酯键
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
2.限制酶选择的注意事项
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
模拟题组——预趋势
基因工程操作工具的基础考查
1．[经典模拟]如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
解析：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。故选C。
答案：C
2. [经典模拟]若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
解析：用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生相同的黏性末端，用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接，故A错误；用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因会产生两种DNA片段，一种含有目的基因，一种不含目的基因，且有目的基因的片段与运载体结合时容易发生反向连接，故B错误；用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，也能产生相同的黏性末端，可能会发生反向连接，故C错误；只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生不同的黏性末端，防止发生反向连接，这样目的基因插入动载体后，RNA聚合酶的移动方向肯定与图丙相同，故D正确。故选D。
答案：D
3. [经典模拟]已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为( )
解析：根据题意，该DNA用限制酶Ⅰ切割后长度不变，故为环状DNA，根据两酶的作用结果，可知酶切图谱为D。
答案：D
4. [经典模拟]下列关于载体的叙述中，错误的是( )
A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子
B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点
C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒
D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
解析：运载体与目的基因结合后，就会形成一个重组DNA分子，A正确；运载体中，对某种限制酶而言，最好只有一个切点，但还要有其他多种限制酶的切点，便于与目的基因定向连接，B正确；目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒，C正确；运载体上要具有某些标记基因，便于筛选重组子，D错误。故选D。
答案：D
基因工程操作工具的综合考查
5．[2019·山东烟台模拟]干扰素是动物和人体细胞受到病毒感染后产生的一种糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖及抗肿瘤作用。利用基因工程技术培育能生产干扰素的植物流程如图所示。请回答下列问题：
限制酶
识别序列和切割位点
EcoRⅠ
G↓ATTC
BamHⅠ
G↓ATCC
SmaⅠ
CCC↓GGG
ApaⅠ
GGGCC↓C
(1)首先获取的动物干扰素基因称为________。利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是
________________________________________________________________________。
(2)过程①中剪切质粒和目的基因时所需要的工具酶是________和________。酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列________。
(3)过程②中将重组质粒导入根瘤农杆菌时，常用______处理根瘤农杆菌，其目的是________________________________________________________________________。
(4)在培育愈伤组织的固体培养基中，除了无机盐、有机营养物质、琼脂、植物激素外，还需添加卡那霉素。卡那霉素的作用是________________________________。在分子水平上通常采用________技术检测干扰素基因是否导入受体细胞。
解析：(1)在基因工程中，获取的动物干扰基因称为目的基因。利用PCR技术扩增干扰素基因时，需要依据干扰素基因两端的部分核苷酸序列设计引物序列。(2)题干显示：干扰素基因中存在SmaⅠ的识别位点，若使用SmaⅠ切割质粒和外源DNA，则会破坏干扰素基因，因此过程①所示的构建重组质粒时不能使用SmaⅠ切割。BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点位于目的基因的两侧，质粒上也有BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点，因此过程①中剪切质粒和目的基因时所需要的工具酶是BamHⅠ和EcoRⅠ。因BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点不同，所以酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同。(3)过程②中将重组质粒导入根瘤农杆菌时，常用Ca2＋处理根瘤农杆菌，使其成为感受态细胞，最终使干扰素基因插入马铃薯细胞的DNA上。(4)重组质粒中含有的抗卡那霉素基因属于标记基因，其作用是鉴别受体细胞是否含有目的基因，便于筛选。可见，在培育愈伤组织的固体培养基中添加卡那霉素的作用是筛选出导入重组质粒的植物细胞。在分子水平上检测干扰素基因是否导入受体细胞，通常采用DNA分子杂交技术。
答案：(1)目的基因 干扰素基因两端的部分核苷酸序列
(2)BamHⅠ EcoRⅠ 不相同
(3)Ca2＋ 使其成为感受态细胞，最终使干扰素基因插入马铃薯细胞的DNA上
(4)筛选出导入重组质粒的植物细胞 DNA分子杂交
基因工程的基本操作程序及应用(国考5年8考)
(全国卷：2018全国卷Ⅰ；2017全国卷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；2016全国卷Ⅰ、Ⅲ； 2015全国卷Ⅰ；2014全国卷；
地方卷：2017北京卷；2016天津卷；2015福建、天津、四川、海南、江苏卷；2014天津、广东、重庆、北京、山东、江苏、海南卷)
【师说考问】
考问1 观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序
(1)—
↓
(2)—组成
↓
考问2 目的基因的检测和鉴定
考问3 应用
技术名称
应用
植物基因工程
培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质
动物基因工程
提高动物生长速度，改善畜产品的品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体
基因治疗
把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗
考问4 探究基因治疗与基因诊断的不同点
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗
临床实验
基因诊断
碱基互
补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
【题组跟进】
高考题组——研考向
基因工程的操作程序的考查
1．[2018·全国卷Ⅰ，38节选]回答下列问题：
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是__________________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋处理，目的是增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其它细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。 (3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(2)转化 外壳蛋白(噬菌体蛋白) 细菌
(3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
2. [2017·全国卷Ⅰ，38]真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________________作为载体，其原因是__________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有__________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________。
解析：(1)基因A的编码区中有内含子，在真核生物细胞内把内含子转录形成的RNA切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后直接参与表达，所以翻译形成的蛋白质不是蛋白A。(2)由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。(3)大肠杆菌作为受体菌是因为其具有繁殖周期短、易培养等特点。(4)检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
(3)繁殖快、容易培养
(4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
3．[2017·全国卷Ⅱ，38]几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是________________________。
解析：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解
(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA
(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子
(4)磷酸二酯键
(5)目的基因的转录或翻译异常
4．[2017·全国卷Ⅲ，38节选]编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是__________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为__________________________，加入了________________作为合成DNA的原料。
解析：(1)题干信息基因序列(TTCG……)，结合转录过程中的碱基配对原则，可知其转录出的mRNA上没有起始密码子AUG。(2)PCR需要的条件包括引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、四种脱氧核糖核苷酸。
答案：(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子
(2)模板 dNTP
5．[2016·全国卷Ⅰ，40]某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________________________；并且__________和________________________________________________________________________
的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自__________。
解析：(1)作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；③具1～多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞(受体细胞)完成DNA复制。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素
(3)受体细胞
基因工程的应用
6．[2015·全国卷Ⅰ，40]HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：
(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的__________，以其作为模板，在__________的作用下合成__________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。
(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是__________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是________________________________________。
(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分__________细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。
(4)人的免疫系统有__________癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。
解析：(1)HIV是RNA病毒，其核酸是单链RNA，而在基因工程中构建目的基因表达载体时，载体一般用的是质粒，为双链DNA，故先用逆转录酶催化HIV的RNA逆转录成为DNA分子，再进行基因工程操作。(2)本题涉及到了免疫学方面知识，抗原进入机体后可以产生特异性免疫反应，产生相应的抗体，抗体与抗原特异性结合。(3)HIV主要破坏人体T细胞。(4)免疫系统除了具有防卫功能外，还有监控和清除功能：监控并清除体内已经衰老或因其他因素而被破坏的细胞，以及癌变的细胞。
答案：(1)RNA 逆转录酶 cDNA(或DNA)
(2)抗体 抗原抗体特异性结合
(3)T(或T淋巴)
(4)监控和清除
7．[2016·天津卷，7]人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径：
(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取__________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是__________(填写字母，单选)。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子
C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过生物膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是____________________。
(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与________的生物学功能一致。
解析：(1)总cDNA是由细胞内mRNA经逆转录获得。DNA两条链是反向平行的，另一条引物扩增方向应向左。(2)据题意，启动子具有物种特异性，它应与受体细胞启动子一致，应选B。(3)在农杆菌转化时，加入某物质，其目的应为“促进”或“有利于”转化，推测酚类物质可吸引农杆菌侵染水稻受体细胞。(4)水稻是真核细胞，具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体。Ⅱ途径受体为大肠杆菌，没有上述细胞器。(5)制备的rHSA应具有与HSA相同的生物学功能才具有医用价值。
答案：(1)总RNA(或mRNA)
(2)B
(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化
(4)水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工
(5)HSA
模拟题组——预趋势
基因工程的操作程序的基础考查
1．[2019·湖南永州高三模拟]抗菌肽对治疗癌症有一定作用，下图表示抗菌肽合成过程，相关说法正确的是( )
A．用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶
B．基因表达载体包含起始密码和终止密码
C．用显微注射法导入基因表达载体
D．筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质
解析：PCR技术中采用的是高温变性，因此用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶，A正确；基因表达载体包含启动子和终止子，而起始密码和终止密码位于mRNA上，B错误；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法，C错误；筛选菌种时用基因探针检测相关基因或mRNA，不能用基因探针检测蛋白质，D错误。
答案：A
2．[经典模拟]如图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析，下列叙述正确的是( )
A．过程①需要DNA连接酶
B．过程②需要限制性核酸内切酶
C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的
D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同
解析：过程①仅仅是单链a和单链b之间形成氢键，不需要DNA连接酶，A错误；过程②与过程①的本质相同，故不需要DNA限制性核酸内切酶，B错误；图中显示的是人工合成基因的流程图，因此需要了解目的基因Ⅰ的碱基序列，C正确；形成重组DNA分子的过程中，质粒与目的基因Ⅰ的碱基序列是不可能相同的，D错误。故选C。
答案：C
3．[2019·天津市和平区模拟]基因疫苗由病毒核酸的一段无毒序列制成，由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。以下叙述错误的是( )
A．被导入细胞后，能与宿主染色体整合
B．接种后若感染此病原微生物，则体内记忆细胞会产生大量抗体
C．基因疫苗引起免疫反应前必须经过转录和翻译的过程
D．将疫苗基因转移到植物，可以生产可食用的疫苗
解析：病毒感染宿主细胞后，其基因可以高效的整合到宿主染色体中，因此可以在宿主细胞内持续稳定的表达外源基因，A 正确；接种疫苗后人体产生针对该病原体的特异性免疫，若感染此病原微生物，则体内记忆细胞会迅速增殖分化成浆细胞，浆细胞产生大量抗体，B错误；疫苗中的病毒基因片段能编码引起保护性免疫反应的病原体抗原，其化学本质是蛋白质，所以基因疫苗引起免疫反应前经过转录和翻译的过程，C正确；将疫苗基因转移到水果和西红柿等植物细胞，可生产可食用疫苗，D正确。
答案：B
基因工程综合考查
4．[2019·江西新余模拟]内皮素(ET)是一种含21个氨基酸的多肽。内皮素主要通过与靶细胞膜上的内皮素受体结合而发挥生物学效应。ETA是内皮素的主要受体，科研人员试图通过构建表达载体，实现ETA基因在细胞中高效表达，为后期ETA的体外研究奠定基础。其过程如下(图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaⅠ的识别序列为C↓CCGGG，限制酶XhoⅠ的识别序列为C↓TCGAG)。请分析回答：
(1)完成过程①需要的酶是________。
(2)过程③中，限制酶XhoⅠ切割DNA，使________键断开，形成的黏性末端是________________。用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是________________________。
(3)过程④中需要________酶，去构建重组质粒。过程⑥中，要用________预先处理大肠杆菌，使其处于容易吸收外界的DNA的状态。
(4)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，目的是__________________。
(5)人皮肤黑色素细胞上有内皮素的特异受体，内皮素与黑色素细胞膜上的受体结合后，会刺激黑色素细胞的分化、增殖并激活酪氨酸酶的活性，从而使黑色素急剧增加。美容时可以利用注射ETA达到美白祛斑效果，试解释原因：________________________________，抑制了内皮素对黑色素细胞的增殖和黑色素的形成。
解析：(1)图中过程①是逆转录，需要逆转录酶的催化。(2)限制酶能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定脱氧核苷酸之间切断磷酸二酯键；根据题意可知限制酶XhoⅠ切割DNA形成的黏性末端是－AGCT(或)；用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是可以使目的基因定向连接到载体上(或防止含目的基因的外源DNA片段和质粒自身环化)。(3)过程④是将目的基因与质量连接构建基因表达载体，需要DNA连接酶催化；过程⑥中，要用CaCl2预先处理大肠杆菌，使其成为处于容易吸收外界DNA的感受态的细胞。(4)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，可以检测ETA基因能否表达及表达量。(5)注射的ETA能与内皮素结合，减少了内皮素与黑色素细胞膜上内皮素受体的结合，抑制了内皮素对黑色素细胞的增殖和黑色素的形成，从而达到美容的目的。
答案：(1)逆转录酶
(2)磷酸二酯 —AGCT(或) 可以使目的基因定向连接到载体上
(3)DNA连接 Ca2＋(或CaCl2)
(4)检测ETA基因能否表达及表达量
(5)ETA能与内皮素结合，减少了内皮素与黑色素细胞膜上内皮素受体的结合
5．[2019·云南师大附中高考适应卷]天然玫瑰因缺少控制合成蓝色色素的基因B而不能开蓝色花。科学家从开蓝色花的矮牵牛中提取了基因B后，利用生物工程技术培育出了开蓝色花的玫瑰。下图为该育种过程的操作流程。
注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活。限制酶EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ的识别序列及切割位点均不相同。
请回答下列问题：
(1)图中将基因B导入玫瑰细胞的方法称为________。选择Ti质粒作为运载体的原因是Ti质粒上的________可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
(2)在构建重组Ti质粒时，应选用图中的________(限制酶)。有人用该种限制酶分别切割Ti质粒和基因B后混合，加入DNA连接酶进行反应，用得到的混合物直接转化细菌甲。结果得到了四种细菌甲：未被转化的、含环状基因B的、含Ti质粒的和含重组Ti质粒的。筛选目的细菌甲时，先用含________的固体培养基培养，不能生长的是________的细菌甲；然后再将能生长的细菌甲接种到含________的固体培养基中，目的细菌甲在此培养基中________(填“能”或“不能”)生长。
(3)由玫瑰韧皮部细胞形成组织乙的过程，实质是______的过程。
解析：(1)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，将目的基因导入Ti质粒的T－DNA上，因为T－DNA能够转移到受体细胞染色体DNA上。(2)在构建重组Ti质粒时，应选用图中的BamHⅠ，这样构建的基因表达载体，含有标记基因氨苄青霉素抗性基因，而不含四环素抗性基因，在含有氨苄青霉素的固体培养基培养，能生长；而在含有四环素的固体培养基中不能生长，这样才能选出含有目的基因的重组质粒。如果用HindⅢ，不能判断是否将目的基因插入到质粒中，所以应用BamHⅠ切割目的基因和Ti质粒。 (3)由图可知组织乙是愈伤组织，玫瑰韧皮部细胞形成组织乙就是脱分化形成愈伤组织的过程，其实质是让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞。
答案：(1)农杆菌转化法 T－DNA
(2)BamHⅠ 氨苄青霉素 未被转化的和含环状基因B 四环素 不能
(3)让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞 蛋白质工程、转基因技术的安全性及生物武器(国考5年1考)
(全国卷：2015全国卷Ⅱ；地方卷：2015海南卷；2014重庆卷；2013广东、江苏卷)
【师说考问】
考问1 蛋白质工程概念理解
蛋白质工程
具体内容
别称
第二代基因工程
目标
生产符合人类生产和生活需要的一种新的蛋白质
原理
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质结构进行改造，必须从基因入手
基础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
手段
基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质
关键技术
基因工程
基础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
结果
改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质
考问2 操作过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
考问3 转基因技术的安全性
(1)安全性问题
①食物安全：滞后效应、过敏原、营养成分改变等。
②生物安全：对生物多样性的影响等。
③环境安全：对生态系统稳定性的影响等。
(2)理性看待转基因技术
①需要正确的社会舆论导向：趋利避害，不能因噎废食。
②制定政策和法规，最大程度保证转基因技术和产品的安全性。
考问4 生物武器
(1)生物武器的种类(连线)
(2)生物武器的特点
①致病力强、传染性大；②污染面广、危害时间长；③难以防治；④具有一定的潜伏期；⑤受自然条件影响大。
考问5 探究蛋白质工程与基因工程的区别和联系
项目
蛋白质工程
基因工程
区
别
过程
预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→推测相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需要的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
生产自然界中没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过基因修饰或基因合成来实现
考问6 填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.氨基酸序列，E.预期功能。
【题组跟进】
高考题组——研考向
蛋白质工程的考查
1．[2015·全国卷Ⅱ]已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氮酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰__________基因或合成__________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括____________________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：__________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________和__________进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物____________进行鉴定。
解析：(1)对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行改造，可达到改变蛋白质的功能的目的。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因，可以对P基因进行修饰改造，也可以用人工方法合成P1基因；中心法则的全部内容包括DNA和RNA的复制、DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质结构和推测氨基酸序列，推测相应的核苷酸序列，并合成基因。经表达产生的蛋白质，还要对其进行生物功能鉴定。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也给分)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
转基因技术安全性的考查
2．[2014·重庆卷]生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述，错误的是( )
A．应严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质
B．当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，但不反对治疗性克隆
C．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
解析：在转基因过程中，避免基因污染和对人类的影响，必须严格选择目的基因，A正确；我国不反对治疗性克隆，坚决反对生殖性克隆，B正确；反对设计试管婴儿的原因之一是防止选择性设计婴儿，违背伦理道德，C正确；生物武器是指有意识的利用微生物、毒素、昆虫侵袭敌人的军队、人口、农作物或者牲畜等目标，以达到战争目的的一类武器，干扰素为淋巴因子，非生物武器，D错误。
答案：D
[题后归纳]
1．转基因生物存在安全性问题的原因
(1)目前对基因的结构、调控机制及基因间的相互作用了解有限。
(2)目的基因往往是异种生物的基因。
(3)外源基因插入宿主细胞基因组的部位往往是随机的。
2．转基因生物的优缺点
优点
缺点
①解决粮食短缺问题；
②大大减少农药的使用量，减少环境污染；
③增加食物营养，提高附加值；
④增加食物种类，提升食物品质；
⑤提高生产效率，带动相关产业发展
①可能出现新的过敏原或重组形成新病毒；
②可能产生抗除草剂的杂草；
③可能使疾病的传播跨越物种障碍；
④可能会损害生物多样性；
⑤可能会对人类生活环境造成二次污染
3.[2013·江苏卷，15]下列关于转基因生物安全性的叙述中，错误的是( )
A．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D．目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
解析：为了维护消费者对转基因产品的知情权和选择权，我国对转基因食品和转基因农产品实行了标识制度，A项正确；只有经确定是安全的转基因食品才能向消费者出售，可能存在危害的转基因产品不允许出售，B项错误；为保障转基因生物安全，可开展风险评估、预警跟踪和风险管理等措施，C项正确；转基因生物是否安全的争论主要集中在它是否能保证食用安全及环境安全上，D项正确。
答案：B
模拟题组——预趋势
蛋白质工程的考查
1．[2019·河南鹤壁高三模拟]下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法不正确的是( )
A．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
B．蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
C．a、b过程分别是转录、翻译
D．蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
解析：蛋白质工程中了解蛋白质分子结构如蛋白质的空间结构、氨基酸的排列顺序等，对于合成或改造基因至关重要；蛋白质工程的进行离不开基因工程，对蛋白质的改造是通过对基因的改造来实现的；图中a、b过程分别是转录、翻译过程；蛋白质工程中可根据已经明确的蛋白质的结构构建出一种全新的基因。
答案：B
2．[2019·广西调研]科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提髙了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是__________，该过程需要加入的酶是__________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成____________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是__________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是__________，PCR定点突变技术属于________的范畴。
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用____________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是____________。
解析：(1)PCR技术是DNA扩增的技术，所以其原理是DNA双链复制，但是该过程需要热稳定DNA聚合酶(或Taq酶)的催化。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(2)由于蛋白质空间结构较为复杂，改造困难，所以该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造；和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是能生产出自然界不存在的蛋白质，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。
(3)将基因表达载体导入植物细胞常用农杆菌转化法；植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性。
答案：(1)DNA双链复制 热稳定DNA聚合酶(或Taq酶) 引物 (2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难 能生产出自然界不存在的蛋白质 蛋白质工程 (3)农杆菌转化法 植物细胞的全能性
转基因的安全性问题考查
3．病毒疫苗的研制是现代生物技术应用最广泛的领域，现在研发的第二、三代病毒疫苗都基于DNA重组技术而建立。请分析回答下列问题：
(1)第二代疫苗是以编码病毒抗原蛋白的RNA为模板，经__________酶的作用获得目的基因，再利用____________________这些工具酶构建重组质粒。形成的重组质粒与经过____________________处理的大肠杆菌细胞混合转化大肠杆菌，扩增大肠杆菌以获得大量的抗原蛋白。
(2)在构建好的重组质粒中，引导目的基因表达的序列是__________，它是__________的识别和结合位点。
(3)第三代疫苗即“DNA疫苗”，是将编码某种抗原蛋白的DNA注射到动物体内，该DNA可在生物体内________出相应的抗原蛋白。
(4)现代对于基因工程产品安全性的争论越来越激烈，目前转基因生物的安全性主要体现在__________、__________、__________三个方面。
答案：(1)逆转录 限制酶和DNA连接酶 氯化钙溶液(Ca2＋)
(2)启动子 RNA聚合酶
(3)转录、翻译
(4)食物安全 生物安全 环境安全
DNA的粗提取与鉴定及PCR技术(国考5年未考)
(地方卷：2016北京卷；2015山东、江苏卷；2014江苏卷；2012江苏卷)
【师说考问】
考问1 实验原理
(1)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解规律
2 mol/L
NaCl溶液
0.14 mol/L
NaCl溶液
DNA
溶解
析出
蛋白质
NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大
部分发生盐析沉淀
溶解
(2)DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。
(3)DNA与二苯胺沸水浴加热，呈蓝色。
考问2 操作流程
材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织
↓
鸡血细胞→加蒸馏水→用玻璃棒
搅拌→用纱布过滤→收集滤液
↓
去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质
↓
DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液
↓
DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管置于沸水中加热5 min，溶液变成蓝色
考问3 PCR技术(多聚酶链式反应)扩增DNA片段
(1)PCR原理：在一定的缓冲溶液中提供DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，热稳定DNA聚合酶，同时控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(2)PCR反应过程
①变性：当温度上升到90_℃以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：
②复性：系统温度下降至50_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
③延伸：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
(3)结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。
②两引物间固定长度的DNA序列呈指数扩增(即2n)。
考问4 DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏
水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布
过滤4次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl
溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
【题组跟进】
高考题组——研考向
DNA 粗提取过程的考查
1．[2015·江苏卷](多选)图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述正确的是( )
A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
解析：图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放其中的核物质，图2中加入蒸馏水的目的是降低NaCl的浓度，使DNA的溶解度降低而析出，A错误；DNA溶于水，图1中完成过滤后DNA溶解于滤液中，需保留滤液，B正确；图2中DNA已析出，则过滤后弃去滤液，保留含DNA的黏稠物，C正确；在图1中鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉，其中的木瓜蛋白酶能分解DNA中的杂质蛋白，有利于去除杂质蛋白质，D正确。
答案：BCD
2．[2014·江苏卷]下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是( )
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
解析：原则上含DNA的生物材料都行，只是DNA含量高的成功的可能性更大，所以酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，故A正确；DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，也可溶解于蒸馏水中，故B正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会破裂，因DNA在蒸馏水中溶解度较大，故不会析出，C错误； DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，故D正确。
答案：C
PCR技术的应用
3．[2016·北京卷，31]嫁接是我国古代劳动人民早已使用的一项农业生产技术，目前也用于植物体内物质转运的基础研究。研究者将具有正常叶形的番茄(X)作为接穗，嫁接到叶形呈鼠耳形的番茄(M)砧木上，结果见图1。
(1)上述嫁接体能够成活，是因为嫁接部位的细胞在恢复分裂、形成__________组织后，经__________形成上下连通的输导组织。
(2)研究者对X和M植株的相关基因进行了分析，结果见图2。由图可知，M植株的P基因发生了类似于染色体结构变异中的__________变异，部分P基因片段与L基因发生融合，形成P－L基因(P－L)。以P－L为模板可转录出__________，在__________上翻译出蛋白质，M植株鼠耳叶形的出现可能与此有关。
(3)嫁接体正常叶形的接穗上长出了鼠耳形的新叶。为探明原因，研究者进行了相关检测，结果见下表。
实验材料
检测对象
M植株的叶
X植株的叶
接穗新生叶
PL mRNA
有
无
有
PL DNA
有
无
无
①检测P－L mRNA需要先提取总RNA，再以mRNA为模板__________出cDNA，然后用PCR技术扩增目的片段。
②检测P－L DNA需要提取基因组DNA，然后用PCR技术对图2中__________(选填序号)位点之间的片段扩增。
A．Ⅰ～Ⅱ B．Ⅱ～Ⅲ
C．Ⅱ～Ⅳ D．Ⅲ～Ⅳ
(4)综合上述实验，可以推测嫁接体中P－L基因的mRNA____________________。
解析：(1)上述嫁接体能够成活，是因为嫁接部位的细胞在恢复分裂，形成愈伤组织后，经过细胞分化形成上下连通的输导组织。(2)由图可知，P基因的片段在L之前，一条染色体中有两个P基因，类似于染色体结构变异中的重复。P－L基因转录出来的产物是mRNA，在核糖体上翻译为蛋白质。(3)①以mRNA为模板合成cDNA的过程为“反转录”。②为了检测P－L DNA，应当确保PCR产物中有P－L DNA相连接的部分序列。符合要求的只有Ⅱ～Ⅳ位点之间的序列。(4)在M中有P－L DNA，而X中没有P－L DNA，接穗新生叶中也没有P－L DNA，但是有P－L mRNA，说明砧木中产生的mRNA，可转移至接穗新生叶中发挥作用，进而影响新生叶的形态。
答案：(1)愈伤 细胞分化
(2)重复 mRNA(P－L mRNA) 核糖体
(3)①反转录(逆转录) ②C
(4)从砧木被运输到接穗新生叶中，发挥作用，影响新生叶的形态
模拟题组——预趋势
DNA的粗提取与鉴定过程分析
1．[经典模拟]下列关于DNA粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是( )
选项
试剂
操作
作用
A
柠檬酸钠溶液
与鸡血混合
防止血液凝固
B
蒸馏水
与鸡血细胞混合
保持细胞形状
C
蒸馏水
加入到溶解有DNA的NaCl溶液中
析出蛋白质
D
冷却的酒精
加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中
产生特定的颜色反应
解析：蒸馏水与鸡血细胞混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B项错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C项错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D项错误。
答案：A
2．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺，混匀
加4 mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5分钟
沸水浴5分钟
实验现象
实验结论
(1)根据右图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是______________________________________________，同时说明DNA对高温有较强的________。
(4)A试管在实验中的作用是________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。
解析：A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
答案：(1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(2)溶液颜色基本不变
(3)加快颜色反应速度 耐受性
(4)对照
(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
PCR技术
3．[经典模拟]利用PCR技术可以快速扩增特定基因，下列有关PCR技术的叙述正确的是( )
A．需要加入解旋酶使模板DNA序列解旋
B．需要不断加入作为引物的核苷酸序列
C．反应需要的DNA聚合酶必须不断的加进反应体系中
D．反应必须在相对稳定的温度条件下进行
解析：PCR技术利用高温将氢键打开，不需要解旋酶的催化，A错误；模板链只要加入一次，而引物片段必须不断加入，DNA聚合酶、DNA连接酶可以反复使用，B正确；反应需要的DNA聚合酶可以反复使用，不需要不断的加进到反应当中，C错误；PCR技术在这个过程中温度不断的发生改变，而且变化较大，D错误。
答案：B
4．SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，可用SRY－PCR法鉴定胚胎性别，其基本程序如图。相关说法正确的是( )
A．PCR扩增的操作步骤依次是：高温变性、中温复性、低温延伸
B．上述过程需要使用的工具酶之一是RNA聚合酶
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．SRY探针能与雄性胚胎样品中的DNA配对
解析：PCR扩增的操作步骤依次是高温变性、低温复性及适温延伸等，A错误；上述过程需要使用的工具酶之一是热稳定DNA聚合酶，B错误；PCR技术的原理是DNA双链的复制，其产物是大量的DNA，所以需要以脱氧核糖核苷酸为原料，C错误；SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，SRY探针是用位于Y染色体上的性别决定基因(SRY基因)制成的，因此SRY探针能与雄性胚胎样品中的DNA配对，D正确。
答案：D
课堂总结 网络建构
[网络建构]
[答题必备]
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．目的基因的获取有从基因文库中获取和人工合成两类方法。
5．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。
6．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
基因工程的概念及操作工具(国考5年4考)
(全国卷：2018全国卷Ⅰ、Ⅱ；2016全国卷Ⅲ；2014全国卷Ⅱ；地方卷：2018北京卷；
2016天津、江苏卷；2015天津、福建、重庆、浙江、江苏卷；2014天津、北京、山东、江苏、海南卷)
【师说考问】
考问1 基因工程概念理解
基因工程的别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
原理
基因重组
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
结果
人类需要的基因产物或生物类型
供体
提供目的基因
受体
表达目的基因
本质
目的基因在受体体内的表达
优点
可定向改造生物的遗传性状
考问2 DNA重组技术的基本工具理解
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
(2)DNA连接酶
常用类型
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
连接黏性末端
连接黏性末端或平末端
结果
都缝合磷酸二酯键，如图
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
考问3 下图为限制酶和DNA连接酶的关系，据图回答
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？相同。
(2)DNA连接酶起作用时是否需要模板？不需要。
考问4 探究载体所具条件的意义
条 件
意 义
稳定并能自我复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
【题组跟进】
高考题组——研考向
基因工程操作工具的基础考查
1．[2018·北京卷，5]用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( )
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
解析：限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoⅠ和SalⅠ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的粘性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；SalⅠ将DNA片段切成4段，XhoⅠ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ，泳道②为XhoⅠ，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA为主，只在黏性末端出现部分单链，D错误。
答案：D
基因工程操作工具的综合考查
2．[2018·全国卷Ⅰ节选]回答下列问题：
(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________________(答出两点即可)。
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
3．[2018·全国卷Ⅱ，38节选]某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________________________________________________________________________。
使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
解析：(1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)世界基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。
答案：(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
4．[2016·全国卷Ⅲ，40]图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是____________________。
甲
乙
丙
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有__________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________________。
解析：(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
答案：(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
(3)E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
5．[2014·全国卷Ⅱ，40]植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题：
(1)理论上，基因组文库含有生物的__________基因；而cDNA文库中含有生物的__________基因。
(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中__________出所需的耐旱基因。
(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物__________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的__________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的__________是否得到提高。
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为31时，则可推测该耐旱基因整合到了____________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。
解析：(1)基因文库有两种：基因组文库和部分基因文库，基因组文库含有生物的全部基因；cDNA是以mRNA为模板逆转录得到的，而细胞中只有部分基因表达，所以cDNA文库含有生物的部分基因。(2)建立基因文库后要根据目的基因的特性从中筛选出目的基因。(3)目的基因与载体构建基因表达载体后，导入乙植物细胞(受体细胞)，需要进行表达产物(蛋白质)和生物个体水平(耐旱性)等的检测。(4)若是整合到同源染色体的两条上，则此耐旱二倍体植株为纯合子，自交后代不会发生性状分离，所以根据实验结果可推测：该耐旱基因整合到了同源染色体的一条上。
答案：(1)全部 部分(其他合理答案也可)
(2)筛选(其他合理答案也可)
(3)乙 表达产物(其他合理答案也可) 耐旱性
(4)同源染色体的一条上
6．[2012·全国卷，40]根据基因工程的有关知识，回答下列问题。
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有__________和__________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATT C……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是____________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即__________DNA连接酶和__________DNA连接酶。
(4)反转录作用的模板是__________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用__________技术。
(5)基因工程中除质粒外，__________和__________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是__________________________________________。
解析：此题考查基因工程应用的相关知识。(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。(2)为使运载体与目的基因相连，应使二者被切割后产生的末端相同，故用另一种限制酶切割产生的末端必须与EcoR Ⅰ切割产生的末端相同。(3)根据酶的来源不同，DNA连接酶分为E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(4)以RNA为模板，合成DNA的过程称为逆转录，若要体外获得大量DNA分子，可以使用PCR技术。(5)在基因工程中，通常利用质粒作为运载体，另外噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。(6)大肠杆菌作为受体细胞时，常用Ca2＋处理，使之成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。
答案：(1)平末端 黏性末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的末端相同
(3)T4 E·coli
(4)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR(聚合酶链式反应)
(5)动植物病毒 噬菌体
(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
[题后归纳]
1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连
接酶
磷酸二酯键
DNA片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚
合酶
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
DNA
DNA水
解酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA分子局部分解为两条长链
RNA聚
合酶
磷酸二酯键
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
2.限制酶选择的注意事项
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
模拟题组——预趋势
基因工程操作工具的基础考查
1．[经典模拟]如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
解析：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。故选C。
答案：C
2. [经典模拟]若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
解析：用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生相同的黏性末端，用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接，故A错误；用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因会产生两种DNA片段，一种含有目的基因，一种不含目的基因，且有目的基因的片段与运载体结合时容易发生反向连接，故B错误；用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，也能产生相同的黏性末端，可能会发生反向连接，故C错误；只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生不同的黏性末端，防止发生反向连接，这样目的基因插入动载体后，RNA聚合酶的移动方向肯定与图丙相同，故D正确。故选D。
答案：D
3. [经典模拟]已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为( )
解析：根据题意，该DNA用限制酶Ⅰ切割后长度不变，故为环状DNA，根据两酶的作用结果，可知酶切图谱为D。
答案：D
4. [经典模拟]下列关于载体的叙述中，错误的是( )
A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子
B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点
C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒
D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
解析：运载体与目的基因结合后，就会形成一个重组DNA分子，A正确；运载体中，对某种限制酶而言，最好只有一个切点，但还要有其他多种限制酶的切点，便于与目的基因定向连接，B正确；目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒，C正确；运载体上要具有某些标记基因，便于筛选重组子，D错误。故选D。
答案：D
基因工程操作工具的综合考查
5．[2019·山东烟台模拟]干扰素是动物和人体细胞受到病毒感染后产生的一种糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖及抗肿瘤作用。利用基因工程技术培育能生产干扰素的植物流程如图所示。请回答下列问题：
限制酶
识别序列和切割位点
EcoRⅠ
G↓ATTC
BamHⅠ
G↓ATCC
SmaⅠ
CCC↓GGG
ApaⅠ
GGGCC↓C
(1)首先获取的动物干扰素基因称为________。利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是
________________________________________________________________________。
(2)过程①中剪切质粒和目的基因时所需要的工具酶是________和________。酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列________。
(3)过程②中将重组质粒导入根瘤农杆菌时，常用______处理根瘤农杆菌，其目的是________________________________________________________________________。
(4)在培育愈伤组织的固体培养基中，除了无机盐、有机营养物质、琼脂、植物激素外，还需添加卡那霉素。卡那霉素的作用是________________________________。在分子水平上通常采用________技术检测干扰素基因是否导入受体细胞。
解析：(1)在基因工程中，获取的动物干扰基因称为目的基因。利用PCR技术扩增干扰素基因时，需要依据干扰素基因两端的部分核苷酸序列设计引物序列。(2)题干显示：干扰素基因中存在SmaⅠ的识别位点，若使用SmaⅠ切割质粒和外源DNA，则会破坏干扰素基因，因此过程①所示的构建重组质粒时不能使用SmaⅠ切割。BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点位于目的基因的两侧，质粒上也有BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点，因此过程①中剪切质粒和目的基因时所需要的工具酶是BamHⅠ和EcoRⅠ。因BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点不同，所以酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同。(3)过程②中将重组质粒导入根瘤农杆菌时，常用Ca2＋处理根瘤农杆菌，使其成为感受态细胞，最终使干扰素基因插入马铃薯细胞的DNA上。(4)重组质粒中含有的抗卡那霉素基因属于标记基因，其作用是鉴别受体细胞是否含有目的基因，便于筛选。可见，在培育愈伤组织的固体培养基中添加卡那霉素的作用是筛选出导入重组质粒的植物细胞。在分子水平上检测干扰素基因是否导入受体细胞，通常采用DNA分子杂交技术。
答案：(1)目的基因 干扰素基因两端的部分核苷酸序列
(2)BamHⅠ EcoRⅠ 不相同
(3)Ca2＋ 使其成为感受态细胞，最终使干扰素基因插入马铃薯细胞的DNA上
(4)筛选出导入重组质粒的植物细胞 DNA分子杂交
基因工程的基本操作程序及应用(国考5年8考)
(全国卷：2018全国卷Ⅰ；2017全国卷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；2016全国卷Ⅰ、Ⅲ； 2015全国卷Ⅰ；2014全国卷；
地方卷：2017北京卷；2016天津卷；2015福建、天津、四川、海南、江苏卷；2014天津、广东、重庆、北京、山东、江苏、海南卷)
【师说考问】
考问1 观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序
(1)—
↓
(2)—组成
↓
考问2 目的基因的检测和鉴定
考问3 应用
技术名称
应用
植物基因工程
培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质
动物基因工程
提高动物生长速度，改善畜产品的品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体
基因治疗
把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗
考问4 探究基因治疗与基因诊断的不同点
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗
临床实验
基因诊断
碱基互
补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
【题组跟进】
高考题组——研考向
基因工程的操作程序的考查
1．[2018·全国卷Ⅰ，38节选]回答下列问题：
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是__________________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋处理，目的是增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其它细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。 (3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(2)转化 外壳蛋白(噬菌体蛋白) 细菌
(3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
2. [2017·全国卷Ⅰ，38]真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________________作为载体，其原因是__________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有__________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________。
解析：(1)基因A的编码区中有内含子，在真核生物细胞内把内含子转录形成的RNA切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后直接参与表达，所以翻译形成的蛋白质不是蛋白A。(2)由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。(3)大肠杆菌作为受体菌是因为其具有繁殖周期短、易培养等特点。(4)检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
(3)繁殖快、容易培养
(4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
3．[2017·全国卷Ⅱ，38]几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是________________________。
解析：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解
(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA
(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子
(4)磷酸二酯键
(5)目的基因的转录或翻译异常
4．[2017·全国卷Ⅲ，38节选]编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是__________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为__________________________，加入了________________作为合成DNA的原料。
解析：(1)题干信息基因序列(TTCG……)，结合转录过程中的碱基配对原则，可知其转录出的mRNA上没有起始密码子AUG。(2)PCR需要的条件包括引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、四种脱氧核糖核苷酸。
答案：(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子
(2)模板 dNTP
5．[2016·全国卷Ⅰ，40]某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________________________；并且__________和________________________________________________________________________
的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自__________。
解析：(1)作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；③具1～多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞(受体细胞)完成DNA复制。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素
(3)受体细胞
基因工程的应用
6．[2015·全国卷Ⅰ，40]HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：
(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的__________，以其作为模板，在__________的作用下合成__________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。
(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是__________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是________________________________________。
(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分__________细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。
(4)人的免疫系统有__________癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。
解析：(1)HIV是RNA病毒，其核酸是单链RNA，而在基因工程中构建目的基因表达载体时，载体一般用的是质粒，为双链DNA，故先用逆转录酶催化HIV的RNA逆转录成为DNA分子，再进行基因工程操作。(2)本题涉及到了免疫学方面知识，抗原进入机体后可以产生特异性免疫反应，产生相应的抗体，抗体与抗原特异性结合。(3)HIV主要破坏人体T细胞。(4)免疫系统除了具有防卫功能外，还有监控和清除功能：监控并清除体内已经衰老或因其他因素而被破坏的细胞，以及癌变的细胞。
答案：(1)RNA 逆转录酶 cDNA(或DNA)
(2)抗体 抗原抗体特异性结合
(3)T(或T淋巴)
(4)监控和清除
7．[2016·天津卷，7]人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径：
(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取__________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是__________(填写字母，单选)。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子
C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过生物膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是____________________。
(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与________的生物学功能一致。
解析：(1)总cDNA是由细胞内mRNA经逆转录获得。DNA两条链是反向平行的，另一条引物扩增方向应向左。(2)据题意，启动子具有物种特异性，它应与受体细胞启动子一致，应选B。(3)在农杆菌转化时，加入某物质，其目的应为“促进”或“有利于”转化，推测酚类物质可吸引农杆菌侵染水稻受体细胞。(4)水稻是真核细胞，具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体。Ⅱ途径受体为大肠杆菌，没有上述细胞器。(5)制备的rHSA应具有与HSA相同的生物学功能才具有医用价值。
答案：(1)总RNA(或mRNA)
(2)B
(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化
(4)水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工
(5)HSA
模拟题组——预趋势
基因工程的操作程序的基础考查
1．[2019·湖南永州高三模拟]抗菌肽对治疗癌症有一定作用，下图表示抗菌肽合成过程，相关说法正确的是( )
A．用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶
B．基因表达载体包含起始密码和终止密码
C．用显微注射法导入基因表达载体
D．筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质
解析：PCR技术中采用的是高温变性，因此用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶，A正确；基因表达载体包含启动子和终止子，而起始密码和终止密码位于mRNA上，B错误；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法，C错误；筛选菌种时用基因探针检测相关基因或mRNA，不能用基因探针检测蛋白质，D错误。
答案：A
2．[经典模拟]如图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析，下列叙述正确的是( )
A．过程①需要DNA连接酶
B．过程②需要限制性核酸内切酶
C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的
D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同
解析：过程①仅仅是单链a和单链b之间形成氢键，不需要DNA连接酶，A错误；过程②与过程①的本质相同，故不需要DNA限制性核酸内切酶，B错误；图中显示的是人工合成基因的流程图，因此需要了解目的基因Ⅰ的碱基序列，C正确；形成重组DNA分子的过程中，质粒与目的基因Ⅰ的碱基序列是不可能相同的，D错误。故选C。
答案：C
3．[2019·天津市和平区模拟]基因疫苗由病毒核酸的一段无毒序列制成，由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。以下叙述错误的是( )
A．被导入细胞后，能与宿主染色体整合
B．接种后若感染此病原微生物，则体内记忆细胞会产生大量抗体
C．基因疫苗引起免疫反应前必须经过转录和翻译的过程
D．将疫苗基因转移到植物，可以生产可食用的疫苗
解析：病毒感染宿主细胞后，其基因可以高效的整合到宿主染色体中，因此可以在宿主细胞内持续稳定的表达外源基因，A 正确；接种疫苗后人体产生针对该病原体的特异性免疫，若感染此病原微生物，则体内记忆细胞会迅速增殖分化成浆细胞，浆细胞产生大量抗体，B错误；疫苗中的病毒基因片段能编码引起保护性免疫反应的病原体抗原，其化学本质是蛋白质，所以基因疫苗引起免疫反应前经过转录和翻译的过程，C正确；将疫苗基因转移到水果和西红柿等植物细胞，可生产可食用疫苗，D正确。
答案：B
基因工程综合考查
4．[2019·江西新余模拟]内皮素(ET)是一种含21个氨基酸的多肽。内皮素主要通过与靶细胞膜上的内皮素受体结合而发挥生物学效应。ETA是内皮素的主要受体，科研人员试图通过构建表达载体，实现ETA基因在细胞中高效表达，为后期ETA的体外研究奠定基础。其过程如下(图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaⅠ的识别序列为C↓CCGGG，限制酶XhoⅠ的识别序列为C↓TCGAG)。请分析回答：
(1)完成过程①需要的酶是________。
(2)过程③中，限制酶XhoⅠ切割DNA，使________键断开，形成的黏性末端是________________。用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是________________________。
(3)过程④中需要________酶，去构建重组质粒。过程⑥中，要用________预先处理大肠杆菌，使其处于容易吸收外界的DNA的状态。
(4)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，目的是__________________。
(5)人皮肤黑色素细胞上有内皮素的特异受体，内皮素与黑色素细胞膜上的受体结合后，会刺激黑色素细胞的分化、增殖并激活酪氨酸酶的活性，从而使黑色素急剧增加。美容时可以利用注射ETA达到美白祛斑效果，试解释原因：________________________________，抑制了内皮素对黑色素细胞的增殖和黑色素的形成。
解析：(1)图中过程①是逆转录，需要逆转录酶的催化。(2)限制酶能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定脱氧核苷酸之间切断磷酸二酯键；根据题意可知限制酶XhoⅠ切割DNA形成的黏性末端是－AGCT(或)；用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是可以使目的基因定向连接到载体上(或防止含目的基因的外源DNA片段和质粒自身环化)。(3)过程④是将目的基因与质量连接构建基因表达载体，需要DNA连接酶催化；过程⑥中，要用CaCl2预先处理大肠杆菌，使其成为处于容易吸收外界DNA的感受态的细胞。(4)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，可以检测ETA基因能否表达及表达量。(5)注射的ETA能与内皮素结合，减少了内皮素与黑色素细胞膜上内皮素受体的结合，抑制了内皮素对黑色素细胞的增殖和黑色素的形成，从而达到美容的目的。
答案：(1)逆转录酶
(2)磷酸二酯 —AGCT(或) 可以使目的基因定向连接到载体上
(3)DNA连接 Ca2＋(或CaCl2)
(4)检测ETA基因能否表达及表达量
(5)ETA能与内皮素结合，减少了内皮素与黑色素细胞膜上内皮素受体的结合
5．[2019·云南师大附中高考适应卷]天然玫瑰因缺少控制合成蓝色色素的基因B而不能开蓝色花。科学家从开蓝色花的矮牵牛中提取了基因B后，利用生物工程技术培育出了开蓝色花的玫瑰。下图为该育种过程的操作流程。
注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活。限制酶EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ的识别序列及切割位点均不相同。
请回答下列问题：
(1)图中将基因B导入玫瑰细胞的方法称为________。选择Ti质粒作为运载体的原因是Ti质粒上的________可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
(2)在构建重组Ti质粒时，应选用图中的________(限制酶)。有人用该种限制酶分别切割Ti质粒和基因B后混合，加入DNA连接酶进行反应，用得到的混合物直接转化细菌甲。结果得到了四种细菌甲：未被转化的、含环状基因B的、含Ti质粒的和含重组Ti质粒的。筛选目的细菌甲时，先用含________的固体培养基培养，不能生长的是________的细菌甲；然后再将能生长的细菌甲接种到含________的固体培养基中，目的细菌甲在此培养基中________(填“能”或“不能”)生长。
(3)由玫瑰韧皮部细胞形成组织乙的过程，实质是______的过程。
解析：(1)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，将目的基因导入Ti质粒的T－DNA上，因为T－DNA能够转移到受体细胞染色体DNA上。(2)在构建重组Ti质粒时，应选用图中的BamHⅠ，这样构建的基因表达载体，含有标记基因氨苄青霉素抗性基因，而不含四环素抗性基因，在含有氨苄青霉素的固体培养基培养，能生长；而在含有四环素的固体培养基中不能生长，这样才能选出含有目的基因的重组质粒。如果用HindⅢ，不能判断是否将目的基因插入到质粒中，所以应用BamHⅠ切割目的基因和Ti质粒。 (3)由图可知组织乙是愈伤组织，玫瑰韧皮部细胞形成组织乙就是脱分化形成愈伤组织的过程，其实质是让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞。
答案：(1)农杆菌转化法 T－DNA
(2)BamHⅠ 氨苄青霉素 未被转化的和含环状基因B 四环素 不能
(3)让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞 蛋白质工程、转基因技术的安全性及生物武器(国考5年1考)
(全国卷：2015全国卷Ⅱ；地方卷：2015海南卷；2014重庆卷；2013广东、江苏卷)
【师说考问】
考问1 蛋白质工程概念理解
蛋白质工程
具体内容
别称
第二代基因工程
目标
生产符合人类生产和生活需要的一种新的蛋白质
原理
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质结构进行改造，必须从基因入手
基础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
手段
基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质
关键技术
基因工程
基础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
结果
改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质
考问2 操作过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
考问3 转基因技术的安全性
(1)安全性问题
①食物安全：滞后效应、过敏原、营养成分改变等。
②生物安全：对生物多样性的影响等。
③环境安全：对生态系统稳定性的影响等。
(2)理性看待转基因技术
①需要正确的社会舆论导向：趋利避害，不能因噎废食。
②制定政策和法规，最大程度保证转基因技术和产品的安全性。
考问4 生物武器
(1)生物武器的种类(连线)
(2)生物武器的特点
①致病力强、传染性大；②污染面广、危害时间长；③难以防治；④具有一定的潜伏期；⑤受自然条件影响大。
考问5 探究蛋白质工程与基因工程的区别和联系
项目
蛋白质工程
基因工程
区
别
过程
预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→推测相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需要的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
生产自然界中没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过基因修饰或基因合成来实现
考问6 填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.氨基酸序列，E.预期功能。
【题组跟进】
高考题组——研考向
蛋白质工程的考查
1．[2015·全国卷Ⅱ]已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氮酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰__________基因或合成__________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括____________________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：__________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________和__________进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物____________进行鉴定。
解析：(1)对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行改造，可达到改变蛋白质的功能的目的。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因，可以对P基因进行修饰改造，也可以用人工方法合成P1基因；中心法则的全部内容包括DNA和RNA的复制、DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质结构和推测氨基酸序列，推测相应的核苷酸序列，并合成基因。经表达产生的蛋白质，还要对其进行生物功能鉴定。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也给分)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
转基因技术安全性的考查
2．[2014·重庆卷]生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述，错误的是( )
A．应严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质
B．当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，但不反对治疗性克隆
C．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
解析：在转基因过程中，避免基因污染和对人类的影响，必须严格选择目的基因，A正确；我国不反对治疗性克隆，坚决反对生殖性克隆，B正确；反对设计试管婴儿的原因之一是防止选择性设计婴儿，违背伦理道德，C正确；生物武器是指有意识的利用微生物、毒素、昆虫侵袭敌人的军队、人口、农作物或者牲畜等目标，以达到战争目的的一类武器，干扰素为淋巴因子，非生物武器，D错误。
答案：D
[题后归纳]
1．转基因生物存在安全性问题的原因
(1)目前对基因的结构、调控机制及基因间的相互作用了解有限。
(2)目的基因往往是异种生物的基因。
(3)外源基因插入宿主细胞基因组的部位往往是随机的。
2．转基因生物的优缺点
优点
缺点
①解决粮食短缺问题；
②大大减少农药的使用量，减少环境污染；
③增加食物营养，提高附加值；
④增加食物种类，提升食物品质；
⑤提高生产效率，带动相关产业发展
①可能出现新的过敏原或重组形成新病毒；
②可能产生抗除草剂的杂草；
③可能使疾病的传播跨越物种障碍；
④可能会损害生物多样性；
⑤可能会对人类生活环境造成二次污染
3.[2013·江苏卷，15]下列关于转基因生物安全性的叙述中，错误的是( )
A．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D．目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
解析：为了维护消费者对转基因产品的知情权和选择权，我国对转基因食品和转基因农产品实行了标识制度，A项正确；只有经确定是安全的转基因食品才能向消费者出售，可能存在危害的转基因产品不允许出售，B项错误；为保障转基因生物安全，可开展风险评估、预警跟踪和风险管理等措施，C项正确；转基因生物是否安全的争论主要集中在它是否能保证食用安全及环境安全上，D项正确。
答案：B
模拟题组——预趋势
蛋白质工程的考查
1．[2019·河南鹤壁高三模拟]下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法不正确的是( )
A．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
B．蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
C．a、b过程分别是转录、翻译
D．蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
解析：蛋白质工程中了解蛋白质分子结构如蛋白质的空间结构、氨基酸的排列顺序等，对于合成或改造基因至关重要；蛋白质工程的进行离不开基因工程，对蛋白质的改造是通过对基因的改造来实现的；图中a、b过程分别是转录、翻译过程；蛋白质工程中可根据已经明确的蛋白质的结构构建出一种全新的基因。
答案：B
2．[2019·广西调研]科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提髙了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是__________，该过程需要加入的酶是__________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成____________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是__________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是__________，PCR定点突变技术属于________的范畴。
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用____________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是____________。
解析：(1)PCR技术是DNA扩增的技术，所以其原理是DNA双链复制，但是该过程需要热稳定DNA聚合酶(或Taq酶)的催化。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(2)由于蛋白质空间结构较为复杂，改造困难，所以该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造；和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是能生产出自然界不存在的蛋白质，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。
(3)将基因表达载体导入植物细胞常用农杆菌转化法；植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性。
答案：(1)DNA双链复制 热稳定DNA聚合酶(或Taq酶) 引物 (2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难 能生产出自然界不存在的蛋白质 蛋白质工程 (3)农杆菌转化法 植物细胞的全能性
转基因的安全性问题考查
3．病毒疫苗的研制是现代生物技术应用最广泛的领域，现在研发的第二、三代病毒疫苗都基于DNA重组技术而建立。请分析回答下列问题：
(1)第二代疫苗是以编码病毒抗原蛋白的RNA为模板，经__________酶的作用获得目的基因，再利用____________________这些工具酶构建重组质粒。形成的重组质粒与经过____________________处理的大肠杆菌细胞混合转化大肠杆菌，扩增大肠杆菌以获得大量的抗原蛋白。
(2)在构建好的重组质粒中，引导目的基因表达的序列是__________，它是__________的识别和结合位点。
(3)第三代疫苗即“DNA疫苗”，是将编码某种抗原蛋白的DNA注射到动物体内，该DNA可在生物体内________出相应的抗原蛋白。
(4)现代对于基因工程产品安全性的争论越来越激烈，目前转基因生物的安全性主要体现在__________、__________、__________三个方面。
答案：(1)逆转录 限制酶和DNA连接酶 氯化钙溶液(Ca2＋)
(2)启动子 RNA聚合酶
(3)转录、翻译
(4)食物安全 生物安全 环境安全
DNA的粗提取与鉴定及PCR技术(国考5年未考)
(地方卷：2016北京卷；2015山东、江苏卷；2014江苏卷；2012江苏卷)
【师说考问】
考问1 实验原理
(1)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解规律
2 mol/L
NaCl溶液
0.14 mol/L
NaCl溶液
DNA
溶解
析出
蛋白质
NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大
部分发生盐析沉淀
溶解
(2)DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。
(3)DNA与二苯胺沸水浴加热，呈蓝色。
考问2 操作流程
材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织
↓
鸡血细胞→加蒸馏水→用玻璃棒
搅拌→用纱布过滤→收集滤液
↓
去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质
↓
DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液
↓
DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管置于沸水中加热5 min，溶液变成蓝色
考问3 PCR技术(多聚酶链式反应)扩增DNA片段
(1)PCR原理：在一定的缓冲溶液中提供DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，热稳定DNA聚合酶，同时控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(2)PCR反应过程
①变性：当温度上升到90_℃以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：
②复性：系统温度下降至50_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
③延伸：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
(3)结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。
②两引物间固定长度的DNA序列呈指数扩增(即2n)。
考问4 DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏
水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布
过滤4次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl
溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
【题组跟进】
高考题组——研考向
DNA 粗提取过程的考查
1．[2015·江苏卷](多选)图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述正确的是( )
A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
解析：图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放其中的核物质，图2中加入蒸馏水的目的是降低NaCl的浓度，使DNA的溶解度降低而析出，A错误；DNA溶于水，图1中完成过滤后DNA溶解于滤液中，需保留滤液，B正确；图2中DNA已析出，则过滤后弃去滤液，保留含DNA的黏稠物，C正确；在图1中鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉，其中的木瓜蛋白酶能分解DNA中的杂质蛋白，有利于去除杂质蛋白质，D正确。
答案：BCD
2．[2014·江苏卷]下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是( )
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
解析：原则上含DNA的生物材料都行，只是DNA含量高的成功的可能性更大，所以酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，故A正确；DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，也可溶解于蒸馏水中，故B正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会破裂，因DNA在蒸馏水中溶解度较大，故不会析出，C错误； DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，故D正确。
答案：C
PCR技术的应用
3．[2016·北京卷，31]嫁接是我国古代劳动人民早已使用的一项农业生产技术，目前也用于植物体内物质转运的基础研究。研究者将具有正常叶形的番茄(X)作为接穗，嫁接到叶形呈鼠耳形的番茄(M)砧木上，结果见图1。
(1)上述嫁接体能够成活，是因为嫁接部位的细胞在恢复分裂、形成__________组织后，经__________形成上下连通的输导组织。
(2)研究者对X和M植株的相关基因进行了分析，结果见图2。由图可知，M植株的P基因发生了类似于染色体结构变异中的__________变异，部分P基因片段与L基因发生融合，形成P－L基因(P－L)。以P－L为模板可转录出__________，在__________上翻译出蛋白质，M植株鼠耳叶形的出现可能与此有关。
(3)嫁接体正常叶形的接穗上长出了鼠耳形的新叶。为探明原因，研究者进行了相关检测，结果见下表。
实验材料
检测对象
M植株的叶
X植株的叶
接穗新生叶
PL mRNA
有
无
有
PL DNA
有
无
无
①检测P－L mRNA需要先提取总RNA，再以mRNA为模板__________出cDNA，然后用PCR技术扩增目的片段。
②检测P－L DNA需要提取基因组DNA，然后用PCR技术对图2中__________(选填序号)位点之间的片段扩增。
A．Ⅰ～Ⅱ B．Ⅱ～Ⅲ
C．Ⅱ～Ⅳ D．Ⅲ～Ⅳ
(4)综合上述实验，可以推测嫁接体中P－L基因的mRNA____________________。
解析：(1)上述嫁接体能够成活，是因为嫁接部位的细胞在恢复分裂，形成愈伤组织后，经过细胞分化形成上下连通的输导组织。(2)由图可知，P基因的片段在L之前，一条染色体中有两个P基因，类似于染色体结构变异中的重复。P－L基因转录出来的产物是mRNA，在核糖体上翻译为蛋白质。(3)①以mRNA为模板合成cDNA的过程为“反转录”。②为了检测P－L DNA，应当确保PCR产物中有P－L DNA相连接的部分序列。符合要求的只有Ⅱ～Ⅳ位点之间的序列。(4)在M中有P－L DNA，而X中没有P－L DNA，接穗新生叶中也没有P－L DNA，但是有P－L mRNA，说明砧木中产生的mRNA，可转移至接穗新生叶中发挥作用，进而影响新生叶的形态。
答案：(1)愈伤 细胞分化
(2)重复 mRNA(P－L mRNA) 核糖体
(3)①反转录(逆转录) ②C
(4)从砧木被运输到接穗新生叶中，发挥作用，影响新生叶的形态
模拟题组——预趋势
DNA的粗提取与鉴定过程分析
1．[经典模拟]下列关于DNA粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是( )
选项
试剂
操作
作用
A
柠檬酸钠溶液
与鸡血混合
防止血液凝固
B
蒸馏水
与鸡血细胞混合
保持细胞形状
C
蒸馏水
加入到溶解有DNA的NaCl溶液中
析出蛋白质
D
冷却的酒精
加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中
产生特定的颜色反应
解析：蒸馏水与鸡血细胞混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B项错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C项错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D项错误。
答案：A
2．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺，混匀
加4 mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5分钟
沸水浴5分钟
实验现象
实验结论
(1)根据右图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是______________________________________________，同时说明DNA对高温有较强的________。
(4)A试管在实验中的作用是________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。
解析：A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
答案：(1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(2)溶液颜色基本不变
(3)加快颜色反应速度 耐受性
(4)对照
(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
PCR技术
3．[经典模拟]利用PCR技术可以快速扩增特定基因，下列有关PCR技术的叙述正确的是( )
A．需要加入解旋酶使模板DNA序列解旋
B．需要不断加入作为引物的核苷酸序列
C．反应需要的DNA聚合酶必须不断的加进反应体系中
D．反应必须在相对稳定的温度条件下进行
解析：PCR技术利用高温将氢键打开，不需要解旋酶的催化，A错误；模板链只要加入一次，而引物片段必须不断加入，DNA聚合酶、DNA连接酶可以反复使用，B正确；反应需要的DNA聚合酶可以反复使用，不需要不断的加进到反应当中，C错误；PCR技术在这个过程中温度不断的发生改变，而且变化较大，D错误。
答案：B
4．SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，可用SRY－PCR法鉴定胚胎性别，其基本程序如图。相关说法正确的是( )
A．PCR扩增的操作步骤依次是：高温变性、中温复性、低温延伸
B．上述过程需要使用的工具酶之一是RNA聚合酶
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．SRY探针能与雄性胚胎样品中的DNA配对
解析：PCR扩增的操作步骤依次是高温变性、低温复性及适温延伸等，A错误；上述过程需要使用的工具酶之一是热稳定DNA聚合酶，B错误；PCR技术的原理是DNA双链的复制，其产物是大量的DNA，所以需要以脱氧核糖核苷酸为原料，C错误；SRY基因为Y染色体上的性别决定基因，SRY探针是用位于Y染色体上的性别决定基因(SRY基因)制成的，因此SRY探针能与雄性胚胎样品中的DNA配对，D正确。
答案：D
课堂总结 网络建构
[网络建构]
[答题必备]
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．目的基因的获取有从基因文库中获取和人工合成两类方法。
5．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。
6．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
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