2021版新高考生物培优大一轮复习讲义：原选修1、选修3部分内容第3讲基因工程

第3讲　基因工程

基因工程的基本工具及基本程序

1．基因工程的概念

(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

(2)优点

①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。

②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。

2．基因工程的基本工具

(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。

①来源：主要来自原核生物。

②特点：具有专一性，表现在两个方面：

识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。

切割——特定核苷酸序列中的特定位点。

③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

④结果：产生黏性末端或平末端。

(2)DNA连接酶

(3)载体

①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

②质粒的特点

③运载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。

3．基因工程的基本程序

(1)目的基因的获取

①从基因文库中获取

②人工合成

③利用PCR技术扩增

(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心

①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

②基因表达载体的组成

(3)将目的基因导入受体细胞

①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。

②转化方法

(4)目的基因的检测与鉴定

4．PCR技术

(1)原理：DNA双链复制。

(2)条件

(3)过程

(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题

(1)获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。

(2)获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。

(3)限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。

(4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。

2．载体上标记基因的作用

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：

3．基因工程操作的四个易错点

(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。

(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。

(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶或裸子植物的细胞，并将其Ti质粒上的T­DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。

(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子

启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。

1．非洲爪蟾核糖体蛋白基因可以与质粒重组，并且在大肠杆菌细胞中表达，其遗传学基础是什么？

[提示]　非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒均具有相同的组成单位和双螺旋结构，且不同生物的密码子相同。

2．用箭头及简要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。

[提示]　基因组文库的构建过程：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。

部分基因文库的构建过程为：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。

考查基因工程的工具

1．(多选)转座子是一段可移动的DNA序列，这段DNA序列可以从原位上单独复制或断裂下来，插入另一位点。转座子可在真核细胞染色体内部和染色体间转移，在细菌的拟核DNA、质粒或噬菌体之间自行移动。有的转座子中含有抗生素抗性基因，可以很快地传播到其他细菌细胞。下列推测合理的是(　　)

A．转座子不能独立进行DNA复制

B．转座子可造成染色体变异或基因重组

C．转座子可用于基因工程的研究

D．细菌的抗药性可来自转座子或者自身的基因突变

BCD　[根据题干中“转座子是一段可移动的DNA序列，这段DNA序列可以从原位上单独复制或断裂下来”，说明转座子可以独立进行DNA复制，A错误；根据题干中“转座子可在真核细胞染色体内部和染色体间转移”，说明转座子可造成真核生物染色体变异或基因重组，B正确；根据题干中“转座子可在细菌的拟核DNA、质粒或噬菌体之间自行移动”，说明转座子可用于基因工程的研究，C正确；根据题干中“有的转座子中含有抗生素抗性基因，可以很快地传播到其他细菌细胞”，说明细菌的抗药性可来自转座子或者自身的基因突变，D正确。]

2．(2019·沈阳市东北育才学校高三模拟)青蒿素是最有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tms基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图。

(1)科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是____________

_________________________。

(2)图中结构P、T是基因成功转录的保证，其中结构P的作用______________

___________________。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是________________。

(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，________________________是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是_______________________________。

(4)T­DNA的作用是可以使______________________，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用________技术。

(5)与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是__________。

[解析]　(1)目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，而导入植物细胞最常用农杆菌转化法，因此，科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是农杆菌转化法。(2)图中结构P、T与基因的转录有关，即基因成功转录的保证，T为终止子，则P为启动子，它的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是标记基因。 (3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，基因表达载体的构建是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接。(4)T­DNA的作用是可以使目的基因进入植物细胞，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用DNA分子杂交技术。(5)冠瘿组织的生长与细胞的分裂和伸长等有关，由此推知冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进其生长。

[答案]　(1)农杆菌转化法　(2)RNA聚合酶识别和结合的部位　标记基因　(3)基因表达载体的构建(或构建基因表达载体)　可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接　(4)目的基因进入植物细胞　DNA分子杂交　(5)tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长

基因工程的操作程序

3．(2019·晋冀鲁豫高三联考)真核生物基因中通常含内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。研究发现绿色木霉合成并分泌的环氧化水解酶可降解黄曲霉素B1。现有含绿色木霉的菌液，为获得环氧化水解酶，研究小组进行以下两种尝试：

(1)方法一

①从含有绿色木霉的菌液中提取细胞的mRNA，在________酶的催化下，合成cDNA。

②以cDNA为模板，通过________技术大量扩增，获得目的基因。

③构建目的基因表达载体，导入大肠杆菌的体内。

④目的基因在大肠杆菌体内正常转录，但是翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性，需做进一步的处理加工，原因在于_____________________________。

(2)方法二

①提取绿色木霉的全部DNA，选用适当的________酶处理后，会获得一些小的DNA片段。

②选择一些合适的载体与获取的DNA片段构建基因表达载体。与从cDNA文库中获取目的基因构建表达载体所用载体相比，该载体组成不需要添加__________________成分。

③载体和这些DNA片段连接起来，导入受体菌的群体中储存。

④从这些受体菌的群体中筛选出含有目的基因的受体菌，分离出目的基因，将该目的基因和载体结合，通过________法导入大肠杆菌体内。

⑤该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于________________________________________。

[解析]　(1)以mRNA合成cDNA的过程为逆转录。以已知的cDNA为模板扩增目的基因的过程称为PCR技术。绿色木霉为真核生物，合成并分泌的环氧化水解酶为分泌蛋白，而大肠杆菌为原核生物，细胞内无内质网和高尔基体，因此在其体内翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性。(2)由提取绿色木霉的全部DNA获取一些小的DNA片段需要用限制酶进行处理。从cDNA文库中获取目的基因中无启动子和终止子。将该目的基因导入大肠杆菌的方法为转化法。从基因组文库里分离出的该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于目的基因中存在内含子。

[答案]　(1)①逆转录　②PCR　④环氧化水解酶是分泌蛋白，需要内质网和高尔基体加工　(2)①限制　②启动子、终止子　④转化　⑤目的基因中存在内含子

4．(2019·郴州市高三二模)甘蔗黄叶综合症是一种由甘蔗黄叶病毒所引起的禾本科植物病毒，科学家通过甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因(简称CP蛋白基因)转化植物来获得抗病转基因新品种。

(1)首先从甘蔗黄叶综合症的病叶中提取RNA，此过程中为了防止RNA被分解，需加入________抑制剂，以提取的RNA为模板通过________获得cDNA。

(2)对获取的cDNA进行PCR扩增，在此反应体系中，除了模板DNA、dNTP外，还需加入________，获得大量的cDNA需要在4 ℃的低温下保存备用，原因是________________________________。

(3)将cDNA和质粒用同一种限制酶切割，产生相同的平末端，再用________将二者进行连接(填“E·coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。在培养基上接种培养大肠杆菌作为受体细胞，同时加入一定量的CaCl2低温冷却液，目的是制备________细胞，其具有的特殊功能是____________________________。

(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得________作为检测剂。

[解析]　(1)RNA酶可将RNA水解，因此为了防止RNA被分解，需加入RNA酶抑制剂；以RNA为模板获得cDNA的过程称为逆转录。(2)采用PCR技术扩增目的基因时的条件有模板DNA、dNTP、引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)；获得大量的cDNA需要在4℃的低温下保存备用，原因是高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性。(3)DNA连接酶包括E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端。用CaCl2处理微生物细胞可使其成为感受态细胞，其具有的特殊功能是能吸收周围环境中的DNA分子。(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)作为检测剂。

[答案]　(1)RNA酶　逆转录　(2)引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)　高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性　(3)T4DNA连接酶　感受态　能吸收周围环境中的DNA分子　(4)CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)

基因工程的应用和蛋白质工程

1．植物基因工程

(1)培育抗虫转基因植物：用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。

(2)抗病转基因植物：使用最多的是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因。

(3)抗逆转基因植物：抗逆基因有抗旱基因、抗除草剂基因等。

(4)利用转基因改良植物的品质：如提高玉米中某种氨基酸含量、延长番茄储存时间、培育新花色的矮牵牛等。

2．动物基因工程

(1)提高动物生长速度：将外源生长激素基因转入动物体内，可以提高产量。

(2)用于改善畜产品的品质：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，可以使转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低。

(3)用转基因动物生产药物：将药用蛋白基因与乳腺蛋白的启动子等调控组件重组在一起，培育乳腺生物反应器。

(4)用转基因动物作器官移植的供体。

3．基因工程药品

(1)受体细胞：多为原核细胞。原因是其繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少。

(2)方式：利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。

(3)成果：利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。

4．基因治疗

(1)概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。

(2)类型：体外基因治疗和体内基因治疗。

(3)实质：正常基因的表达掩盖病变基因的表达，达到治疗疾病的目的。

(4)成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者的淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。

5．蛋白质工程

(1)概念

以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。

(2)流程图

写出流程图中字母代表的含义：

A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。

(3)蛋白质工程与基因工程的比较

①区别

②联系

a．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。

b．基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。

1．利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是什么？

[提示]　药用蛋白基因没有转录或翻译。

2．研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程。

[提示]　从预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

3．请简要写出从个体水平鉴定抗虫棉是否培育成功的设计思路。

[提示]　取一定量长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，取等量长势一致的普通棉花植株接种等量棉铃虫作为对照组。在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并统计两组棉花叶片的受损程度。

基因工程的应用

1．(2019·河北省武邑中学高三质检)植物甲含有A基因，其编码的蛋白质中富含赖氨酸。科学家通过基因工程培育出的转基因玉米也能合成甲的富含赖氨酸的蛋白质，使玉米中赖氨酸的含量比原来提高30%。请回答：

(1)在获取目的基因时，常从甲的细胞中提取富含赖氨酸的蛋白质的mRNA，并利用mRNA人工合成cDNA。上述人工合成cDNA的过程称作______；与甲细胞中的A基因相比，cDNA中不具有调控基因表达的___________等组件。

(2)在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的T­DNA中，原因是__________________________。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，这种处理的作用是________________________。

(3)在获得转基因玉米后，可采用核酸分子杂交技术对玉米细胞中是否存在A基因的转录产物进行检测，检测时需用____________制作基因探针。

(4)实验发现，某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，而用乙的体细胞离体培养所产生的植株100%富含赖氨酸。将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程称为______________。若乙中的A基因都能表达，且不考虑突变和染色体交叉互换，乙自交子代富含赖氨酸的个体占15/16，原因是____________________________________________。

[解析]　(1)根据题意分析，上述人工合成cDNA的过程是以RNA为模板合成DNA的过程，为逆转录过程；与A基因相比，人工合成的cDNA中不含启动子、终止子和内含子。

(2)农杆菌细胞中的Ti质粒上的T­DNA(可转移DNA)能进入玉米细胞并整合到玉米染色体DNA上，因此在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的T­DNA中。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共同培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，以吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染。

(3)检测A基因(目的基因)可以用DNA分子杂交法，该过程需要用含A基因的DNA片段(或A基因)制作基因探针。

(4)将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程为植物组织培养。根据题意分析，将某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，即只有1/16(1/4×1/4)的个体不富含赖氨酸，相当于两对杂合子的自交实验，说明乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因。

[答案]　(1)逆转录　启动子、终止子、内含子　(2)T­DNA能进入并整合到玉米染色体DNA上　吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染　　(3)含A基因的DNA片段(或A基因)　(4)组织培养　乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因

2．(2019·保定市高三期末)干扰素具有抗病毒、抑制肿瘤及免疫调节等多种生物活性。质粒中的LacZ基因可表达出β­半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X­gal时，X­gal便会被β­半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌形成蓝色菌落，反之则形成白色菌落。如图是将人干扰素基因导入大肠杆菌，培养后生产干扰素的过程。

(1)在获得干扰素基因后，常采用PCR技术大量扩增。该技术的基本过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链，____________与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行____________，如此重复循环多次。

(2)过程①最好选用的限制酶是____________，在进行②过程前，需事先用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于________。为了筛选含有重组质粒的大肠杆菌，需要在培养大肠杆菌的培养基中额外加入________________________________，培养一段时间后挑选出________(填“蓝色”或“白色”)的菌落进一步培养获得大量目的菌。

(3)某些干扰素可抑制肿瘤细胞DNA的合成，通过减缓细胞______________分裂过程抑制肿瘤。还有些干扰素可提高吞噬细胞将抗原呈递给____________的能力，从而在免疫调节中发挥作用。

[解析]　(1)PCR技术的基本过程是在高温下，目的基因DNA受热变性后解链为单链；温度降低，引物与单链相应互补序列结合；然后，温度回升时，在DNA聚合酶的作用下进行互补链的合成，如此重复循环多次。

(2)为了产生相同的黏性末端，获取目的基因和切割载体时通常使用同种限制酶。由题图可知，质粒和目的基因均具有EcoRⅤ、BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶切割位点，但EcoRⅤ限制酶会破坏干扰素基因，因此过程①不能选用该酶，最好选用BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶。将重组质粒导入大肠杆菌细胞，需事先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使大肠杆菌细胞处于感受态。选用BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶切割质粒和目的基因，重组质粒中青霉素基因完好，可正常表达，对青霉素具有抗性；而LacZ基因被破坏，无法表达出β­半乳糖苷酶，无法使无色的IPTG和X­gal变蓝，显白色。因此，在培养基中加入IPTG、X­gal和青霉素，只有成功导入目的基因的重组质粒的细菌(即目的菌)才能不被青霉素杀死，同时表现为白色。

(3)癌细胞的增殖方式为有丝分裂。因此，某些干扰素可抑制肿瘤细胞DNA的合成，通过减缓细胞有丝分裂过程抑制肿瘤。还有些干扰素可提高吞噬细胞将抗原呈递给T淋巴细胞的能力，从而在免疫调节中发挥作用。

[答案]　(1)引物　互补链的合成(或延伸)　(2)BamHⅢ和EcoRⅠ　感受态　IPTG、X­gal和青霉素　白色　(3)有丝　T淋巴细胞

蛋白质工程及应用

3．香港大学的研究人员将某印度芥菜的HMGS基因编码的蛋白质的第359位氨基酸“丝氨酸”替换成“丙氨酸”后形成s359a蛋白，通过一定的方法获得新HMGS基因，然后将其导入番茄细胞，获得类胡萝卜素增加111%的转基因番茄，该番茄具有强抗氧化性。请回答下列问题：

(1)请按照蛋白质工程的原理写出获得新HMGS基因的基本途径：_________

_________________________________________________________________

________________________________________________________________。

(2)如图的4种质粒中，E表示EcoR Ⅰ的切割位点，将这些质粒用EcoR Ⅰ充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为________个，接着将新HMGS基因分别与这4组酶切产物、DNA连接酶在适宜环境下混合，编号为1、2、3、4组，结果发现除第________组外，其余3组都有含新HMGS基因的基因表达载体(重组质粒)出现。基因表达载体的组成除目的基因和标记基因外，还包括________及复制原点。

(3)若质粒3是农杆菌的Ti质粒，则图示E所处的位置在Ti质粒上的________，将含新HMGS基因的重组Ti质粒的农杆菌导入番茄细胞，成功获得含新HMGS基因的转基因番茄，将其果实色素提取后，用________法分离，可发现滤纸条上____________(填颜色)的条带比第4组的宽。

[解析]　(1)蛋白质工程的原理为从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，由此可写出获得新HMGS基因的基本途径：从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列。

(2)图中质粒1、2、3、4上的限制酶EcoR Ⅰ切割位点分别为3、2、1、0，用EcoRⅠ充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为3、2、1、0。第4组无EcoR Ⅰ切割位点，因此无法构建基因表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子以及复制原点。

(3)Ti质粒上的T­DNA可将目的基因转移到受体细胞且整合到受体细胞染色体的DNA上。色素的提取方法为纸层析法。新HMGS基因导入番茄细胞，获得的类胡萝卜素增加，因此滤纸条上橙黄色和黄色的条带比第4组的宽。

[答案]　(1)从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列[或从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)]　(2)3、2、1、0　4　启动子和终止子

(3)T­DNA　纸层析　橙黄色和黄色

DNA的粗提取与鉴定

1．基本原理

(1)DNA的粗提取：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。

(2)DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异

(3)DNA的鉴定：DNA＋二苯胺蓝色。

2．实验流程

材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织

破碎细胞(以鸡血为例)：鸡血细胞→加蒸馏水→用玻璃棒搅拌→用纱布过滤→收集滤液

去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质

DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液

DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管在沸水中加热5 min，溶液变成蓝色

明确实验中三种重复操作的目的和作用

1．加2次蒸馏水

(1)加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破。

(2)加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出。

2．用纱布过滤3次

(1)过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液。

(2)滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)。

(3)过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液。

3．用4次NaCl溶液

(1)用2 mol/L的NaCl溶液，过滤除去不溶的杂质。

(2)用0.14 mol/L的NaCl溶液，析出DNA。

(3)用2 mol/L的NaCl溶液，溶解DNA。

(4)用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于DNA的鉴定。

　如图为某兴趣小组开展“DNA的粗提取与鉴定”实验过程中的一些操作示意图。

　               A　　　　　B　　　C　　　　D　　　　E

正确的操作顺序是什么？说明理由。

[提示]　C→B→E→D→A。DNA粗提取时，先用蒸馏水处理鸡血细胞，使其吸水涨破，释放DNA，然后过滤，去除杂质，获得滤液，接着加入2 mol/L的NaCl，再加入蒸馏水，使其析出，将析出的DNA溶解于2 mol/L的NaCl，最后加入95%的冷酒精，析出纯净的DNA，即正确的操作顺序是C→B→E→D→A。

考查DNA的粗提取与鉴定的原理及操作流程

1．(多选)研究人员比较了不同贮藏条件对棉叶DNA纯度及提取率(提取率越高，获得的DNA越多)的影响，实验结果见图。下列有关叙述正确的是(　　)

A．提纯DNA时可加入酒精去除不溶的蛋白质、酚类等物质

B．新鲜棉叶提取的DNA纯度最高，提取DNA的量也最多

C．木瓜蛋白酶和不同浓度的NaCl溶液均可用于提纯DNA

D．用二苯胺试剂鉴定，颜色最深的是冷冻3d处理后提取的DNA

CD　[提纯DNA时，加入酒精，可以去除可溶性的蛋白质、酚类等物质，A项错误；据图可知，新鲜棉叶提取的DNA纯度最高，但提取DNA的量不高，B项错误；木瓜蛋白酶可除去蛋白质，DNA不溶于0.14 mol/L的NaCl溶液，易溶于2 mol/L的NaCl溶液，木瓜蛋白酶和不同浓度的NaCl溶液均可用于提纯DNA，C项正确；冷冻3d处理后提取的DNA最多，用二苯胺试剂鉴定时颜色最深，D项正确。]

2．如图是南通某中学生物兴趣小组进行的DNA粗提取实验，其中SDS(一种表面活性剂)除了能瓦解细胞膜和核膜，还能与脂质和蛋白质结合。当SDS遇到钾离子时，钾离子可以置换SDS中的钠离子，产生不溶于水的PDS沉淀。请回答下列问题：

(1)实验中，向剪碎的猪肝中加入食盐的主要作用是________。将猪肝匀浆放入65 ℃水浴锅中水浴10 min以除去部分杂质的主要实验原理是____________

___________________________________________________________________。

(2)方法一的步骤①中加入洗涤剂的作用是____________________。方法三的步骤③中，离心后应取________。

(3)方法一、二获得的絮状物均带黄色，从DNA在细胞中的存在形式分析，杂质分子最可能是________，可用________试剂鉴定。

(4)要比较三种方法获得的絮状物中DNA含量，请写出实验思路：________

_______________________________________________________________。

[解析]　(1)DNA粗提取的原理主要有DNA分子在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低而蛋白质等杂质在此浓度中溶解度比较大；蛋白质在高于60 °C溶液中容易变性、沉淀，而DNA能耐受较高的温度；DNA不溶于酒精，而蛋白质等物质可溶。

(2)根据题意，SDS与钾离子发生转换反应，产生PDS沉淀，因此可以通过沉淀、离心，去除实验中加入的SDS，在离心后取含有DNA的上清液。

(3)DNA在真核细胞中主要存在于细胞核内，与蛋白质结合形成染色体，因此，与DNA分子结合较牢的杂质最主要的是蛋白质。蛋白质可用双缩脲试剂进行鉴定。

(4)由于DNA遇二苯胺在水浴加热条件下发生反应，出现蓝色，并且蓝色深浅与DNA含量呈正相关，因此实验中可以通过将等量的三种絮状物溶解，加二苯胺试剂并水浴加热，比较蓝色深浅，实现对三种絮状物中DNA含量的比较。

[答案]　(1)溶解DNA　蛋白质在65 ℃高温下会变性，而DNA能耐受这一温度　(2)瓦解细胞膜和核膜　上清液　(3)蛋白质　双缩脲　(4)分别取等量的三种絮状物，并用等量的2 mol/L NaCl溶液溶解；再向各试管中加入等量的二苯胺试剂并水浴加热；比较三支试管中蓝色的深浅

真题体验| 感悟高考　淬炼考能

1．(2019·江苏高考)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是(　　)

A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌

B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株

C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛

D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗

D　[将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入大肠杆菌获得的转基因菌，可以通过二分裂将胰岛素基因传给后代，A不符合题意；将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得的植株所有细胞均含有花青素代谢基因，花青素代谢基因会随该植物传给后代，B不符合题意；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛所有细胞均含有肠乳糖酶基因，可以遗传给后代，C不符合题意；该患者进行基因治疗时，只有淋巴细胞含有该腺苷酸脱氨酶基因，性原细胞不含该基因，故不能遗传给后代，D符合题意。故选D。]

2．(2008·全国高考)已知某种限制酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如下图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是 (　　)

线性DNA分子的酶切示意图

A．3　　　　B．4　　　　C．9　　 D．12

C　[切点有以下多种情况：(1)只切开一个位点，则有三种情况，即切在a、bcd间，则片段为a、bcd两种；切点在ab、cd间，则片段为ab、cd两种。切点在abc、d间，则片段为abc、d两种。(2)切开两个位点，则有三种情况，即切在a、b、cd间，则片段为a、b、cd三种；切点在a、bc、d间，则片段为a、bc、d三种；切点在ab、c、d间，则片段为ab、c、d三种。(3)切开三个位点，即切点在a、b、c、d间，则片段为a、b、c、d四种。综合以上，不重复的片段共有9种。故选C。]

3．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。

(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。

(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。

(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_____________________________________________________________________

___________________________________________________________________。

[解析]　(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。

[答案]　(1)基因组文库　cDNA文库

(2)解旋酶　加热至90～95 ℃　氢键

(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活

4．(2020·山东等级考模拟)基因定点整合可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。苯丙酮尿症是由PKU基因突变引起的，将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上，替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。定点整合的过程是：从染色体DNA上突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因HSV－tk1、HSV－tk2连接，中间插入正常PKU基因和标记基因neor，构建出如图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换，如图所示。

(1)构建重组载体时，常用的工具酶有______________________。该实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞以培育出转基因小鼠，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞____________。

(2)为获得小鼠的胚胎干细胞，可将小鼠囊胚中的______取出，并用______________处理使其分散成单个细胞进行培养，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，这种现象称为________。

(3)用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现PKU基因错误整合。错误整合时，载体的两个HSV－tk中至少会有一个与neor一起整合到染色体DNA上。已知含有neor的细胞具有G418的抗性。HSV－tk1、HSV－tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是______________的胚胎干细胞，理由_____________________________________。

(4)将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，从个体生物学水平检测，若小鼠______________，说明PKU基因成功表达。

[答案]　(1)限制酶、DNA连接酶　全能性强

(2)内细胞团　胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)　贴壁生长(细胞贴壁)

(3)PKU基因正确整合(或PKU基因定点整合)　在含有G418的培养液中培养时，不含neor的细胞全部死亡，含有PKU基因的细胞可以存活下来；在含有G418和DHPG的培养液中培养时，错误整合的细胞因含HSV－tk而死亡   

(4)不患苯丙酮尿症(或尿液中不含大量苯丙酮酸)