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专题20现代生物科技专题-三年（2019-2021）高考生物真题分项汇编（解析版）
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这是一份专题20现代生物科技专题-三年（2019-2021）高考生物真题分项汇编（解析版），共46页。试卷主要包含了 小题等内容，欢迎下载使用。
专题20 现代生物科技专题
1. （2021·6浙江月选考）采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子官，才可获得表达 EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光，能表达 EGFP 的即为雄性小鼠胚胎
【答案】 B
【解析】 B受精卵经体外培养至囊胚期，须将其植入同期发情小鼠的子官
2．（2021·1月浙江选考）下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是（ ）
A．步骤①的操作不需要在无菌环境中进行
B．步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离
C．步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理
D．步骤④培养过程中不会发生细胞转化
【答案】C
【分析】
动物细胞培养过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。
【详解】
A、动物细胞培养过程需要无菌操作，故步骤①的操作需要在无菌环境中进行，A错误；
B、动物细胞培养过程需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物组织，分散成单个细胞，制成细胞悬液，B错误；
C、传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，使之分散成单个细胞，再分瓶培养，C正确；
D、步骤④为传代培养过程，该过程中部分细胞可能发生细胞转化，核型改变，D错误。
故选C。
3．（2021·湖南高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：
（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是_________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的_________断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_________。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_________（答出两点即可），功能上具有_________。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的_________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路_________。
【答案】（1）限制性核酸内切酶（限制酶） 磷酸二酯键
（2）清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害
（3）动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答） 发育的全能性
（4）B 用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活
【分析】
1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、核移植：
（1）概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物；
（2）原理：动物细胞核的全能性；
（3）动物细胞核移植可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。原因：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。
【详解】
（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
（3）由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
（4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活。
【点睛】
本题结合图示考查基因工程、核移植、胚胎移植、单克隆抗体的相关知识，涉及知识点较多，但难度不大，要求考生掌握基础知识，属于考纲中识记与理解层次。
4．（2021·全国乙卷高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
【答案】（1）EcoRI、PstI EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV
（2）磷酸二酯键
（3）自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
（4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【分析】
基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
【详解】
（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【点睛】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
5．（2021·广东高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】（1）基因文库中获取、人工合成法
（2）盐析法、酶解法或高温变性
（3）感受态 抗原-抗体杂交技术
（4）有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】
本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
6．（2021·全国甲卷高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是_________，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是_______ 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_______ 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】（1）④②③①
（2）Taq酶（热稳定DNA聚合酶） 延伸 Taq酶从引物起始进行互补链的合成
（3）两条单链DNA
（4）一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【分析】
PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
【详解】
（1）PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
（2）在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶），PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成。
（3）DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。
（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【点睛】
本题考查PCR技术及应用，难度较小，解答本题的关键是明确PCR技术的原理，具体反应过程，以及在临床病原菌检测中的应用。
7．（2021·河北高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。
【答案】（1）基因组文库
（2）限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定
（3）农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散
（4）耐性 茎叶
（5）YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【分析】
1、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是部分基因文库。
2、据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。
【详解】
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】
本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。
8. （2021·6浙江月选考）（15 分）回答下列（二）小题：
（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成__________，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克降，质粒载体应含有__________________________________________________（答出2 点即可）。提取质粒后，采用__________法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马伍囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
（二）（1）富营养化
（2）重组DNA分子 限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因 显微注射
（3）胰蛋白酶 原代 饲养层细胞
9．（2021·1月浙江高考真题）回答下列（二）小题：
（二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。
（1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。
（2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。
（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
【答案】（二）（1）遗传 间种
（2）DNA聚合酶 愈伤组织
（3）继代 杀灭发根农杆菌 转速 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度
【解析】（二）（1）生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。
（2）分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。
（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
10．（2020年山东省高考生物试卷（新高考)·13）两种远缘植物的细胞融合后会导致一方的染色体被排出。若其中一个细胞的染色体在融合前由于某种原因断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中。依据该原理，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，过程如下图所示。下列说法错误的是（ ）
A．过程①需使用纤维素酶和果胶酶处理细胞
B．过程②的目的是使中间偃麦草的染色体断裂
C．过程③中常用灭活的病毒诱导原生质体融合
D．耐盐小麦的染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段
【答案】C
【解析】
【分析】
从图中看出①是去掉植物细胞壁，②是用紫外线诱导染色体变异，③融合形成杂种细胞。
【详解】
A、过程1是获得植物细胞的原生质体，需要用纤维素酶和果胶酶将细胞壁分解，A正确；
B、根据题干信息“将其中一个细胞的染色体在融合前断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，”故过程②通过紫外线照射是使中间偃麦草的染色体断裂，B正确；
C、灭活的病毒诱导是动物细胞融合特有的方法，诱导植物原生质体融合常用物理法、化学法，C错误；
D、实验最终将不抗盐的普通小麦和抗盐的偃麦草整合形成耐盐小麦，说明耐盐小麦染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段，D正确。
故选C。
【点睛】
本题的难点是对过程②的分析，考生需要结合题干中的信息作答。
11．（2020年山东省高考生物试卷（新高考)·14）经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚，通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。下列说法错误的是（ ）
A．用促性腺激素处理雌鼠可以获得更多的卵子
B．体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理
C．胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植
D．遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得
【答案】C
【解析】
【分析】
1、胚胎移植的基本程序主要包括：
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。
②配种或人工授精。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来（也叫冲卵）。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。
⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
2、体外受精主要包括：卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精。
【详解】
A、促性腺激素可以使雌鼠超数排卵，获得更多的卵子，A正确；
B、精子只有获能后才能完成受精，故体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理，B正确；
C、胚胎移植通常选择囊胚期之前的阶段，如桑椹胚或囊胚阶段，C错误；
D、转基因技术可以定向改造小鼠的基因，所以遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得，D正确。
故选C。
【点睛】
本题考查胚胎工程的基本知识，考生需要识记基本操作，D项中需要结合基因工程的目的进行解答。
12．（2020年江苏省高考生物试卷·23）小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种功能细胞、制备流程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子
B．细胞a和细胞b内含有的核基因不同，所以全能性高低不同
C．用胰蛋白酶将细胞a的膜白消化后可获得分散的胚胎干细胞
D．胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养
【答案】ABC
【解析】
【分析】
1、胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）。
2、ES细胞在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态．在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸、丁酰环腺苷酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡机理提供了有效的手段。
【详解】
A、为了获得更多的囊胚，可以采用激素促进成熟雌性个体超数排卵，然后将卵细胞从母体内取出，在试管内与人工采集的精子进行体外受精，培育成胚胎，A错误；
B、细胞a和细胞b是由同一个受精卵经过有丝分裂形成的，故核基因相同，B错误；
C、运用细胞培养技术可以从哺乳动物的早期胚胎中获得胚胎干细胞，首先必须用胰蛋白酶处理内细胞团，分解细胞间的胶原蛋白等，使之分散成单个细胞，C错误；
D、动物细胞培养时需要在5% CO2的培养箱中进行培养，以维持培养液的pH，D正确。
故选ABC。
13．（2020年天津高考生物试卷·1）在克隆哺乳动物过程中，通常作为核移植受体细胞的是去核的（ ）
A．卵原细胞
B．初级卵母细胞
C．次级卵母细胞
D．卵细胞
【答案】C
【解析】
【分析】
体细胞核移植过程：
【详解】
在克隆哺乳动物过程中，通常选择减数第二次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞，即次级卵母细胞。
故选C。
14．阅读下列材料，回答下列小题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进展。
资料一：人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规模爆发。
资料二：小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。
资料三：疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5种不同抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1中。在按蚊肠道内，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫。因AS1可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一般可被阻断。
11．（2020年天津高考生物试卷）目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是（ ）
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
12．在利用种间关系进行生物防治的措施中，下列分析错误的是（ ）
A．施用绿僵菌工程菌减少虫害，不改变绿僵菌与害虫之间存在寄生关系
B．引入Fhb7增强小麦的抗菌性，目的是调节真菌对植物的寄生能力
C．AS1工程菌分泌的多种表达产物不改变AS1与按蚊之间存在共生关系
D．使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是调节按蚊对人的寄生能力
【答案】
11．B
12．D
【解析】
【分析】
1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、生物的种间关系包括竞争、捕食、互利共生和寄生。互利共生是指两种生物共居一起，彼此创造有利的生活条件，较之单独生活时更为有利；相互依赖，相互依存，一旦分离，双方都不能正常地生活。寄生是指一种生物生活在另一种生物的体内或体表，并从后者摄取营养以维持生活的种间关系。前者称寄生物，后者称寄主。大都为一方受益，一方受害，甚至引起寄主患病或死亡。
11．
A、目的基因可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增或是人工合成，A错误；
B、资料一中神经毒素基因AalT导入绿僵菌中可以增强绿僵菌致死害虫的效应，资料二中Fhb7基因导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，资料三，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，因此上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活，B正确；
C、基因AalT导入绿僵菌中可用感受态细胞法，Fhb7基因导入小麦可用农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中可用感受态细胞法，C错误；
D、要想达到生物防治的目的不一定要将目的基因导入防治对象，如资料一，可将目的基因导入能寄生在多种害虫体内的绿僵菌中，如资料三，可将目的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，这种方法同样可以达到生物防治的目的，D错误。
故选B。
12．
A、导入AalT基因的绿僵菌只是增强了致死害虫的效应，没有改变绿僵菌与害虫之间存在的寄生关系，A正确；
B、Fhb7基因导入小麦后，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，调节了真菌对植物的寄生能力，B正确；
C、AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，并不会改变AS1与按蚊之间存在的共生关系，C正确；
D、使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是阻断疟疾的传播，不会改变按蚊对人的寄生能力，D错误。
故选D。
15．（2020年浙江省高考生物试卷（7月选考)·15）下列关于病毒的叙述，错误的是（ ）
A．有的病毒经灭活处理后，可用于细胞工程中介导动物细胞的融合
B．适当增加机体内参与免疫的细胞数量与活性，可提高对新型冠状病毒的抵御能力
C．在某人的分泌物中检测到新型冠状病毒，推测该病毒的增殖不依赖于宿主细胞
D．用高温高压处理病毒使其失去感染能力，原因之一是病毒的蛋白质发生了热变性
【答案】C
【解析】
【分析】
诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心、 震动、 电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
【详解】
A、有的病毒经灭活处理后，可用于细胞工程中介导动物细胞的融合，如灭活的病毒， A正确；
B、适当增加机体内参与免疫的细胞数量与活性，可以参与免疫调节中的体液和细胞免疫，尽可能杀死更多的病毒，可提高对新型冠状病毒的抵御能力，B正确；
C、在某人的分泌物中检测到新型冠状病毒，是因为病毒浸入细胞后大量繁殖，病毒从细胞中释放出来，不能说明该病毒的增殖不依赖于宿主细胞，C错误；
D、用高温高压处理病毒使其失去感染能力，原因之一是病毒的蛋白质在高温高压下，空间结构发生变化，肽链松散，发生了变性，D正确。
故选C。
16．（2020年浙江省高考生物试卷（7月选考)·24）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
【答案】D
【解析】
【分析】
基因工程中通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按一定的程序进行操作，包括目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。
【详解】
A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；
B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；
C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；
D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。
故选D。
17．（2019北京卷·4）甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株。再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种，以下对相关操作及结果的叙述，错误的是
A．将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C．调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株
D．经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
【答案】D
【解析】
【分析】由题意可知，同时抗甲、乙的植物新品种的培养过程为：把含抗甲的目的基因的重组质粒导入植物细胞，获得抗甲植株，同时把含抗乙的目的基因的重组质粒导入植物细胞，获得抗乙植株，通过杂交获得F1（二倍体植株），取F1的花粉经花药离体培养获得单倍体植株，用秋水仙素处理单倍体植株获得纯合的同时抗甲、乙的植物新品种（二倍体）。
【详解】要获得转基因的抗甲或抗乙植株，需要构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点），再把基因表达载体导入受体细胞中，A正确；对转基因植株进行检测时，可以通过抗病接种实验进行个体水平的检测，B正确；对F1的花粉进行组织培养时，需要经过脱分化和再分化过程，其中生长素/细胞分裂素比例高时利于根的分化，比例低时利于芽的分化，C正确；经花粉离体培养获得的植株是单倍体，D错误。因此，本题答案选D。
18．（2019江苏卷·16）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
【答案】D
【解析】
【分析】转基因技术的原理是基因重组。基因重组和基因突变、染色体变异均属于可遗传的变异。
基因治疗：指把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
【详解】将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入大肠杆菌获得的转基因菌，可以通过二分裂将胰岛素基因传给后代，A不符合题意；将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得的植株所有细胞均含有花青素代谢基因，花青素代谢基因会随该植物传给后代，B不符合题意；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛所有细胞均含有肠乳糖酶基因，可以遗传给后代，C不符合题意；该患者进行基因治疗时，只有淋巴细胞含有该腺苷酸脱氨酶基因，性原细胞不含该基因，故不能遗传给后代，D符合题意。
19．（2019江苏卷·23）下图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT-），在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述正确的是
A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合
B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长
C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产
D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础
【答案】ACD
【解析】
【分析】（1）动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性、细胞的增殖，诱导手段有电激、聚乙二醇、灭活的病毒等，结果产生杂交细胞，主要用于制备单克隆抗体。
（2）单克隆抗体制备的原理包括：①免疫理：B淋巴细胞能产生特异性抗体；②细胞融合原理：利用病毒对宿主细胞的穿透性使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合；③动物细胞培养技术：对杂交瘤细胞进行体内、体外培养。
（3）制备单克隆抗体过程中的几种细胞：①免疫B细胞（浆细胞）：能产生单一抗体，但不能无限增殖；②骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能产生抗体；③杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能在体外培养条件下无限增殖。
【详解】诱导动物细胞融合的方法有电激、聚乙二醇、灭活的病毒（如灭活的仙台病毒）等，A正确；
两两融合的细胞包括免疫B细胞与免疫B细胞融合的具有同种核的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的具有同种核的细胞、免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，骨髓瘤细胞虽然能无限增殖，但缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，免疫B细胞虽然有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，但不具有无限增殖的本领，所以在HAT筛选培养液中，两两融合的具有同种核的细胞都无法生长，只有杂交瘤细胞才能生长，B错误；因每个免疫B细胞只分泌一种特异性抗体，因此在HAT筛选培养液中筛选出来的众多的杂交瘤细胞所分泌的抗体，不一定都是人类所需要的，还需要进一步把能分泌人类所需要抗体的杂交瘤细胞筛选出来，C正确；动物细胞融合是以细胞膜的流动性为基础的，D正确。
20．（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅰ)·38）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。
回答下列问题：
（1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是_________________。
（2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_________________。
（3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于_________________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是_________________。
（4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有________________（答出2点即可）。
【答案】（1）诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞
（2）取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液
（3）选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的反应具有特异性
（4）将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养
【解析】
【分析】
由图可知，筛选1指用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，筛选2指进行克隆化培养和专一抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
【详解】
（1）实验前给小鼠甲注射病毒A，是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。
（2）取小鼠的脾脏，剪碎组织，用胰蛋白酶处理获得单个细胞，加入培养液可以制成单细胞悬液。
（3）图中筛选1需要用到选择培养基，只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，该过程要用到抗原抗体杂交，故筛选所依据的原理是抗原-抗体反应具有特异性。
（4）获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，可以在体外培养液中进行培养，或在小鼠的腹腔中进行培养，使杂交瘤细胞大量增殖。
【点睛】
制备单克隆抗体的过程中，需要用到动物细胞融合和动物细胞培养，需要用到两次筛选，第一次筛选的目的是获得杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
21．（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅱ)·38）植树造林、“无废弃物农业”、污水净化是建设美丽中国的重要措施。回答下列有关生态工程的问题：
（1）在植树造林时，一般认为，全部种植一种植物的做法是不可取的。因为与混合种植方式所构建的生态系统相比，按照种植一种植物方式所构建的生态系统，其抵抗力稳定性___________。抵抗力稳定性的含义是___________。
（2）“无废弃物农业”是我国利用生态工程的原理进行农业生产的一种模式，其做法是收集有机物质。包括人畜粪便、枯枝落叶等，采用堆肥和沤肥等多种方式，把它们转变为有机肥料，再施用到农田中。施用有机肥料的优点是________________（答出3点即可）。在有机肥料的形成过程中，微生物起到了重要作用，这些微生物属于生态系统组分中的________。
（3）在污水净化过程中，除发挥污水处理厂的作用外，若要利用生物来回收污水中的铜、镉等金属元素，请提供一个方案：_______________。
【答案】（1）低 生态系统抵抗外界干扰并使自身的结构与功能保持原状或不受损害的能力
（2）改善了土壤结构；培育了土壤微生物；实现了土壤养分的循环利用 分解者
（3）种植能吸收这些金属元素的水生植物，再从植物中回收金属
【解析】
【分析】
1、生态系统的稳定性：包括抵抗力稳定性和恢复力稳定性。
2、生态工程的基本原理：
①物质循环再生原理：物质能在生态系统中循环往复，分层分级利用；
②物种多样性原理：物种繁多复杂的生态系统具有较高的抵抗力稳定性；
③协调与平衡原理：生态系统的生物数量不能超过环境承载力（环境容纳量）的限度；
④整体性原理：生态系统建设要考虑自然、经济、社会的整体影响；
⑤系统学和工程学原理：系统的结构决定功能原理：要通过改善和优化系统结构改善功能；
系统整体性原理：系统各组分间要有适当的比例关系，使得能量、物质、信息等的转换和流通顺利完成，并实现总体功能大于各部分之和的效果，即“1+1＞2”。
【详解】
（1）生态系统的抵抗力稳定性取决于生态系统中物种组成的复杂程度，种植一种植物，生态系统的生物种类过少，抵抗力稳定性较低；所谓抵抗力稳定性是指生态系统抵抗外界干扰并使自身的结构与功能保持原状或不受损害的能力。
（2）由于有机肥料中有机物较多，故施用有机肥料可以改善土壤结构、培育土壤微生物、实现了土壤养分的循环利用。分解人畜粪便、枯枝败叶中的有机物质的微生物属于分解者。
（3）利用生物来回收污水中的金属元素，可以通过种植能吸收这些金属元素的水生植物，再从植物中回收金属。
【点睛】
本题考查生态系统和生态工程的相关知识，要求考生识记生态系统的结构、稳定性以及生态工程的基本原理及生态恢复工程的实例，掌握生态农业的意义，能结合所需的知识准确答题。
22．（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅲ)·38）W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。
（1）步骤①中需要使用的工具酶有________________。步骤②和③所代表的操作分别是________________和________________。步骤④称为________________。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的______________（答出2点即可）的限制。
（3）一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________________（填相同或不同），原因是_________。
（4）从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有_____________（答出2点即可）。
【答案】（1）限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射 体外培养 胚胎移植
（2）性别、年龄
（3）相同 两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵
（4）体外受精、胚胎移植
【解析】
【分析】
1、膀胱反应器有着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易,不会对动物造成伤害。此外,该系统可从动物一出生就收集产物,不论动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显著的优势在于从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。
2、基因工程技术的基本步骤包括：目的基因的获取；基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
3、分析题图可知，步骤①为将W基因与运载体结合，构建基因表达载体；步骤②为将重组表达载体导入受精卵，常用显微注射法；步骤③为体外培养；步骤④为胚胎移植。
【详解】
（1）由分析可知，步骤①为构建基因表达载体，需使用同种限制酶切割目的基因和运载体，再由DNA连接酶连接粘性末端，形成重组表达载体；步骤②为显微注射；步骤③为体外培养；步骤④为胚胎移植。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W，可从动物一出生就收集产物,不受动物的性别和年龄的限制。
（3）在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是由同一个受精卵有丝分裂产生的体细胞，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息相同。
（4）由分析可知，步骤③为体外培养，步骤④为胚胎移植，均属于胚胎工程。
【点睛】
本题考查基因工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记基因工程的基本工具和操作步骤，掌握胚胎工程各项技术的相关细节，能结合所学的知识准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查。
23．（2020年山东省高考生物试卷（新高考)·25）水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
（1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_____________。
（2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了______，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列___ (填：发生或不发生)改变，原因是_____________。
（3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_____过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_____________。
（4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_____，原因是_____________。
【答案】（1）限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化
（2）RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 （3）逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合）
（4）品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
【解析】
【分析】
基因工程的操作步骤：
1、获取目的基因（从基因组文库中获取、利用PCR技术扩增目的基因、化学合成法）；
2、基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；一个完整的基因表达载体包括：
（1）启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动目的基因的转录；（2）目的基因：编码蛋白质的基因；（3）终止子：位于基因的尾端，其作用使转录在需要的地方停止；（4）标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。
3、将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
4、目的基因的检测与鉴定 （DNA分子杂交技术,分子杂交技术、抗原抗体杂交）。
【详解】
（1）将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。
（2）根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平，在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。
（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术转移性扩增出Wx基因的cDNA。
（4）识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
【点睛】
本题考查基因工程的知识点，要求学生掌握基因工程的操作工具和操作步骤是解决问题的关键。识记并理解基因工程中工具酶的种类和作用，把握基因表达载体构建的过程，理解启动子的功能和编码蛋白质的基因的结构，这是该题考查的难点；把握PCR扩增技术的操作过程和引物的作用，这是突破第（3）问的关键。
24．（2020年天津高考生物试卷）某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时，参照品种B的最佳激素配比（见下表）进行预实验。
品种B组织培养阶段
细胞分裂素浓度（μmol/L）
生长素浓度（μmol/L）
Ⅰ诱导形成愈伤组织
m1
n1
Ⅱ诱导形成幼芽
m2
n2
Ⅲ诱导生根
m3
n3
据表回答：
（1）Ⅰ阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是________________。
（2）在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段中发生基因选择性表达的是________________阶段。
（3）为确定品种A的Ⅰ阶段的最适细胞分裂素浓度，参照品种B的激素配比（m1>2．0），以0．5 μmol/L为梯度，设计5个浓度水平的实验，细胞分裂素最高浓度应设为________μmol/L。
（4）Ⅲ阶段时，科研人员分别选用浓度低于或高于n3 μmol/L的生长素处理品种A幼芽都能达到最佳生根效果，原因是处理幼芽时，选用低浓度生长素时的处理方法为________，选用高浓度生长素时的处理方法为________。
（5）在________阶段用秋水仙素对材料进行处理，最易获得由单个细胞形成的多倍体。
【答案】（1）细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织
（2）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
（3）m1+1.0
（4）浸泡法（长时间处理） 沾蘸法（短时间处理）
（5）Ⅰ
【解析】
【分析】
愈伤组织是由一团未分化的细胞组成的，在组织培养中，条件适宜就会分化成各种组织。如果培养基中细胞分裂素和生长素的比例合适，会促进愈伤组织的生长，分化出根和茎叶；细胞分裂素太多时，有利于芽的分化、抑制根的形成；生长素用量太多时，有利于根的分化、抑制芽的形成；而当生长素少，细胞分裂素也不多时，则愈伤组织继续生长，不发生分化。基因的选择性表达是指基因在特定的时间和空间条件下有选择表达的现象，据此分析。
【详解】
（1）在诱导愈伤组织形成时，通常采用茎尖、幼叶做外植体，因为这些部位的细胞分裂能力强、分化程度低，全能性容易表达，容易诱导产生愈伤组织。
（2）Ⅰ过程愈伤组织形成是离体的植物细胞脱分化的结果，脱分化过程中细胞的结构和功能发生的明显改变，成为未分化状态；Ⅱ、Ⅲ过程形成幼芽、根的过程存在细胞的分化，分化和脱分化都存在基因的选择性表达，故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段都存在基因的选择性表达。
（3）根据题意，表中数据为品种B的最佳激素配比，若要确定品种A的Ⅰ阶段最佳细胞分裂素浓度，以0.5μmol/L为梯度，可参考m1为中间值，故实验中细胞分裂素最高浓度可设为m1+1.0μmol/L。
（4）实验中用生长素处理插条的方法可选用浸泡法或沾蘸法，浸泡法时间长、所需浓度低，而沾蘸法处理时间短、所需浓度高；因此Ⅲ过程中分别选用浓度低于或高于n3μmol/L的生长素处理品种A的幼苗芽，选用低浓度生长素时的处理方法为浸泡法，时间长，而选用高浓度生长素时处理方法为沾蘸法，时间短，都能达到比较适宜的浓度，达到最佳生根效果。
（5）秋水仙素可抑制纺锤体形成，导致染色体加倍形成多倍体，愈伤组织分裂旺盛，故在Ⅰ阶段用秋水仙素处理，最易获得由单个细胞形成的多倍体。
【点睛】
本题以植物组织培养为背景，主要考查组织培养过程激素的使用，意在考查考生能理解所学知识的要点,把握知识间 的内在联系和分析数据、处理数据的能力。
25．（2020年浙江省高考生物试卷（7月选考)）回答下列（二）小题：
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，
应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。
（2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。
（4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。
（二）（1）抗性基因
（2）全能性表达充分 显微注射
（3）短 脱分化
（4）生长素 根的分生组织 B
【解析】
（二）（1）设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。
（2）转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故选B。
26．（2020年江苏省高考生物试卷）新型冠状病毒可通过表面的刺突蛋白（S蛋白）与人呼吸道粘膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图1为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题：
（1）图1中人体内抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被__________细胞表面的受体识别后激活该细胞。
（2）B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的__________，形成__________细胞。
（3）为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的__________；采集血液样本主要用于血清学检查，检测__________。
（4）据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射__________免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得__________细胞。因为同一种抗原可能激活__________细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。
【答案】（1）T
（2）增殖、分化 浆细胞和记忆
（3）核酸 抗新型冠状病毒抗体
（4）刺突蛋白（或S蛋白） 杂交瘤 多种B
【解析】
【分析】
本题以新冠病毒为载体考查体液免疫、核酸检测和单克隆抗体的有关知识。体液免疫包括三个阶段：（1）感应阶段：除少数抗原可以直接刺激B细胞外，大多数抗原被吞噬细胞摄取和处理，并暴露出其抗原决定簇；吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞；（2）反应阶段：B细胞接受抗原刺激后，开始进行一系列的增殖、分化，形成记忆细胞和浆细胞；（3）效应阶段：浆细胞分泌抗体与相应的抗原特异性结合，发挥免疫效应。制备单克隆抗体的具体过程：1、用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞；2 、将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；3、在HAT选择性培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖；4、在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增；5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。
【详解】
（1）据题图1可知，人体内抗原递呈细胞吞噬新冠病毒，并将新冠病毒的抗原暴露，呈递给T细胞，被T细胞表面的受体识别后激活T细胞；
（2）激活的T细胞释放淋巴因子，并将抗原呈递给B细胞，B细胞识别入侵的病毒后，迅速增殖分化成浆细胞和记忆细胞；
（3）临床上为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测疑似患者的呼吸道是否有新冠病毒的核酸，采集血液样本主要用于血清学检查，检测血清中是否产生抗新型冠状病毒的抗体；
（4）据题中图2所示，结合单克隆抗体制备方法，要研制抗刺突蛋白单克隆抗体，需先注射新冠病毒的刺突蛋白（或S蛋白），以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得融合的、未融合的细胞，用HAT筛选培养基培养，未融合的B细胞不能长期生存而死亡，未融合的骨髓瘤细胞不能合成DNA而死亡，只有杂交瘤细胞能成活；由于同一种抗原可能激活多种B细胞，筛选出的融合的骨髓瘤细胞就可能分泌多种抗体，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞。
27．（2020年江苏省高考生物试卷）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）：
请据图回答问题：
（1）步骤I用的EcoR I是一种__________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。
（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。
（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（从引物①②③④中选择，填编号）。
DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
PCR引物
①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′
②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′
④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′
（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。
A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′
B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′
C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′
D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′
【答案】（1）限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列
（2）磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸
（3）②④
（4）B
【解析】
【分析】
采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸、终止，PCR技术扩增目的基因的原理：DNA双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。
【详解】
（1）EcoR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。
（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。
（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。
【点睛】
本题主要考查PCR的过程和应用，意在强化考生对PCR技术的理解，要求考生能分析题图提取有效信息，从引物碱基序列、延伸方向等方面进行分析和解答，对考生的理解和分析能力提出了较高要求。
28．（2019全国卷Ⅰ·38）
基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。
【答案】（1）基因组文库 cDNA文库
（2）解旋酶 加热至90~95 ℃ 氢键
（3）Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
【解析】
【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取（基因文库获取、PCR、人工合成）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平—DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原抗体杂交法和个体水平—抗虫、抗病接种实验等）。
【详解】（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库（CDNA文库），前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。
（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。
（3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。
【点睛】PCR的原理是DNA双链的复制，故类似于细胞内的DNA复制过程，需要模板、原料等条件。由于该过程中特殊的高温条件，需要用耐高温的DNA聚合酶。
29．（2019全国卷II·38）植物组织培养技术在科学研究和生产实践中得到了广泛的应用。回答下列问题。
（1）植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有______________________（答出2点即可）。
（2）通过组织培养技术，可把植物组织细胞培养成胚状体，再通过人工种皮（人工薄膜）包装得到人工种子（如图所示），这种人工种子在适宜条件下可萌发生长。人工种皮具备透气性的作用是_______________________________。人工胚乳能够为胚状体生长提供所需的物质，因此应含有植物激素、___________和___________等几类物质
（3）用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植物的___________进行组织培养。
（4）植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是_________________________________________________（用流程图表示）。
【答案】（1）能保持植物原有的遗传特性，繁殖速度快
（2）有利于胚状体进行呼吸作用 矿质元素 糖
（3）茎尖
（4）含目的基因的细胞愈伤组织小植株
【解析】
【分析】植物组织培养的流程是：离体的植物器官、组织或细胞经脱分化形成愈伤组织，经再分化形成芽、根或胚状体，进而形成完整植株。植物组织培养技术在微型繁殖、制造人工种子、作物脱毒等方面具有广泛的应用。微型繁殖属于无性生殖的范畴，能够保持亲本的优良特性，实现种苗的快速大量繁殖。人工种子是以通过植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子，其中的如果胚乳可为“种子”的萌发提所需的供营养物质。以无病毒或病毒极少的茎尖为材料进行组织培养可获得高产优质的无病毒植株。
【详解】（1）植物微型繁殖是指用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有：保持优良品种的遗传特性；高效快速地实现种苗的大量繁殖。
（2）人工种子的胚状体在进行细胞呼吸时，需要从外界环境吸收O2，并将产生的CO2释放到外界环境中，因此人工种皮具备透气性的作用是：有利于胚状体进行呼吸作用，以保持胚状体的活力。人工胚乳的作用是为胚状体的发育提供营养，因此应含有植物激素、矿质元素、糖等物质。
（3）植物分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒，因此为了获得脱毒苗，可以选取植物的茎尖进行组织培养。
（4）将含有目的基因的植物细胞培养为一个完整的转基因植物，需借助植物组织培养技术才能实现，其基本程序是：。
【点睛】解题的关键是识记并理解植物组织培养的过程和植物组织培养技术在微型繁殖、制造人工种子、作物脱毒等方面的实际应用。在此基础上，从题意中提取有效信息，进而对各问题情境进行分析解答。
30．（2019全国卷III·38）培养胡萝卜根组织可获得试管苗，获得试管苗的过程如图所示。
回答下列问题。
（1）利用胡萝卜根段进行组织培养可以形成试管苗。用分化的植物细胞可以培养成完整的植株，这是因为植物细胞具有__________。
（2）步骤③切取的组织块中要带有形成层，原因是____________。
（3）从步骤⑤到步骤⑥需要更换新的培养基，其原因是____________。在新的培养基上愈伤组织通过细胞的____________过程，最终可形成试管苗。
（4）步骤⑥要进行照光培养，其作用是____________。
（5）经组织培养得到的植株，一般可保持原品种的__________，这种繁殖方式属于____________繁殖。
【答案】（1）全能性（或答：形成完整植株所需的全部基因）
（2）形成层容易诱导形成愈伤组织
（3）诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化形成试管苗所需的生长素和细胞分裂素的比例不同 分化（或答：再分化）
（4）诱导叶绿素的形成，使试管苗能够进行光合作用
（5）遗传特性 无性
【解析】
【分析】根据题干信息分析，培养胡萝卜组织获得试管苗的过程利用了植物组织培养技术，该技术的原理是植物细胞的全能性；该过程中离体的组织块脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成胚状体，最终培育成试管苗。
【详解】（1）根据题意分析，用胡萝卜的组织细胞可以培育成完整的植株，其原理是植物细胞的全能性。
（2）形成层细胞具有分裂能力，分化程度低，易形成愈伤组织，因此步骤③中切取胡萝卜块时强调要切取含有形成层的部分。
（3）步骤⑤为脱分化过程，步骤⑥为再分化过程，由于营养物质的消耗以及两个过程需要激素的比例要求等有所不同，因此由步骤⑤到步骤⑥的过程需要更换新的培养基；愈伤组织形成试管苗的过程为再分化。
（4）步骤⑥为再分化过程，需要进行光照，以利于叶绿素的合成。
（5）植物组织培养技术属于无性繁殖，获得的后代可以保持亲本的优良性状。
【点睛】解答本题的关键是掌握植物组织培养的详细过程及其原理，明确离体的组织需要经过脱分化和再分化过程才能发育为完整的植株，并能够对不同过程进行合理的分析。
31．（2019北京卷·31）光合作用是地球上最重要的化学反应，发生在高等植物、激类和光合细菌中。
（1）地球上生命活动所需的能量主要来源于光反应吸收的____________，在碳（暗）反应中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2与RuBP（C5）结合，生成2分子C3，影响该反应的外部因素，除光照条件外还包括_________________________（写出两个）；内部因素包括_____________（写出两个）。
（2）R酶由8个大亚基蛋白（L）和8个小亚基蛋白（S）组成。高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因编码并在___________中由核糖体合成后进入叶绿体，在叶绿体的___________中与L组装成有功能的酶。
（3）研究发现，原核生物蓝藻（蓝细菌）R酶的活性高于高等植物，有人设想通过基因工程技术将蓝藻R酶的S、L基因转入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人员将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。转基因植株能够存活并生长。检测结果表明，转基因植株中的R酶活性高于未转基因的正常植株。
①由上述实验能否得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测？请说明理由。
②基于上述实验，下列叙述中能够体现生物统一性的选项包括____________。
a．蓝藻与甲都以DNA作为遗传物质
b．蓝藻与甲都以R酶催化CO2的固定
c．蓝藻R酶大亚基蛋白可在甲的叶绿体中合成
d．在蓝藻与甲的叶肉细胞中R酶组装的位置不同
【答案】（1）光能 温度、CO2浓度 R酶活性、R酶含量、C5含量、pH（其中两个）
（2）细胞质 基质
（3）①不能，转入蓝藻S、L基因的同时没有去除甲的S基因，无法排除转基因植株R酶中的S是甲的S基因的表达产物的可能性。
②a、b、c
【解析】
【分析】本题主要考查光合作用、基因工程及基因对性状的控制的有关知识。影响光合作用的外界因素主要有光照、温度、水、无机盐和CO2浓度等，内部因素主要有色素的含量和种类、酶的含量及活性；要将新的基因转入，首先得将“原配”基因从受体植株的细胞核和它的叶绿体基因组中给敲除掉。然后导入目的基因，等待它们将老片段“替换”掉了之后，用专门的培养基筛选出只含有这种叶绿体的细胞，再通过组织培养最终获得R酶活性很高的转基因植株。
【详解】（1）地球上生物生命活动所需的能量来自有机物，有机物主要来自植物的光合作用，光合作用合成有机物需要光反应吸收光能，转化为ATP的化学能，然后ATP为暗反应中C3的还原提供能量，合成糖类。在暗反应中，RuBP 羧化酶（R酶）催化CO2与RuBP（C5）结合，生成2分子C3，这是光合作用的暗反应的二氧化碳的固定。暗反应的进行需要相关酶的催化，二氧化碳做原料，需要光反应提供[H]和ATP，光反应需要色素、酶、水、光照等，故影响该反应的外部因素有光照、温度、CO2浓度、水、无机盐等；内部因素包括色素含量及种类、酶的含量及活性等。
（2）高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因通过转录成mRNA ，mRNA 进入细胞质基质，与核糖体结合，合成为S蛋白；因R酶是催化CO2与C5结合的，在叶绿体基质中进行，故S蛋白要进入叶绿体，在叶绿体的基质中与L组装成有功能的酶。
（3）①据题设条件可知，将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，只去除甲的L基因，没有去除甲的S基因。因此，转基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除转基因植株中R酶是由蓝藻的L蛋白和甲的S蛋白共同组成。故由上述实验不能得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测。
②根据上述实验，可以看出蓝藻的基因能导入到甲的DNA中，说明蓝藻和甲植株都以DNA为遗传物质；蓝藻中 R酶的活性高于高等植物，说明两者都以R酶催化CO2的固定；由于蓝藻S、L基因均转入甲的叶绿体DNA中，且去除了甲的L基因，结果转基因植株合成了R酶，说明蓝藻R酶大亚基蛋白L在甲的叶绿体中合成，以上体现了生物界的统一性。在蓝藻中R酶组装是在细胞质基质，甲的叶肉细胞组装R酶是在叶绿体基质，则说明了不同生物之间具有差异性。因此，选abc。
【点睛】解答本题关键抓住“将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。”这一条件，得知甲的S基因还在，可以合成S蛋白，推知转基因植株中有活性的R酶并不完全是由蓝藻的S、L组装而成。
32．（2019天津卷·9）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中 （单选）。
A．含B基因的染色体缺失
B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变
D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或 中提取总RNA，构建 文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3） 在过程①、②转化筛选时，过程 中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程 在培养基中应加入卡那霉素。
（4） 获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是 （多选）。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明 。
【答案】（1）D
（2）精子 cDNA
（3）② ①
（4）BCD
（5）B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
【解析】
【分析】基因工程的基本操作程序：
1、目的基因的获取：（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建:（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。（3）基因表达载体的构建过程：
3、将目的基因导入受体细胞:（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
【详解】（1）通过题干信息可知，B基因可以在体细胞和精子中，说明含B基因的染色体未缺失，也没有发生基因突变，AC错误；基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶，不是DNA聚合酶，B错误；B基因在卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D正确；故选D。
（2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA，从而构建CDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。
（3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程②表示将筛选出含有重组质粒的农杆菌，将其T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上。
（4）获得转基因植株，鉴定筛选方式有：①DNA分子杂交技术，即以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交，故A错误；B正确；②用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，即以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交，C正确；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，通过（2）可知B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因，即可通过Luc基因表达，检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，D正确；故选BCD。
（5）当从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含有一个染色体组，推断该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
【点睛】本题考查了基因工程的相关知识，要求考生能够识记基因工程的操作步骤；明确农杆菌转化法在植物基因工程中的应用；并能够掌握植物组织培养技术的过程等知识。
33．（2019江苏卷·29）利用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。下图为基因编辑猪培育流程，请回答下列问题：
（1）对1号猪使用_________处理，使其超数排卵，收集并选取处在__________时期的卵母细胞用于核移植。
（2）采集2号猪的组织块，用__________处理获得分散的成纤维细胞，放置于37 ℃的CO2培养箱中培养，其中CO2的作用是________。
（3）为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行__________。产出的基因编辑猪的性染色体来自于_________号猪。
（4）为检测病毒外壳蛋白基因是否被导入4号猪并正常表达，可采用的方法有__________（填序号）。
①DNA测序 ②染色体倍性分析
③体细胞结构分析 ④抗原—抗体杂交
【答案】（1）促性腺激素 减数第二次分裂中期
（2）胰蛋白酶（胶原蛋白酶） 维持培养液的pH
（3）分割 2
（4）①④
【解析】
【分析】据图分析，图示基因编辑猪培育过程涉及的技术手段有转基因技术、核移植技术、早期胚胎培养技术和胚胎移植技术等，利用转基因技术将病毒外壳蛋白基因（目的基因）导入2号猪的体细胞核中，然后将2号猪的体细胞核移植到1号猪的去核卵母细胞中，再将重组细胞培养到囊胚并移植到3号猪的子宫中去，最后分娩产生了4号转基因克隆猪。
【详解】（1）据图分析可知，1号猪提供的是卵母细胞，对其注射促性腺激素可使其超数排卵，获得的卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期才能进行核移植。
（2）将2号猪的组织块分散成单个的成纤维细胞需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，该细胞的培养应在37℃含5%的CO2的恒温培养箱中进行，其中CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（3）利用胚胎分割技术对图示早期胚胎进行分割，可以获得更多的基因编辑猪；据图分析可知，核移植的细胞核来自于2号猪，因此产出的基因编辑猪的性染色体来自于2号猪。
（4）检测病毒外壳蛋白基因（目的基因）是否导入4号猪，可以采用DNA分子杂交法检测目的基因的序列；目的基因表达的最终产物是蛋白质（病毒外壳蛋白），可以利用抗原-抗体杂交法进行检测，故选①④。
【点睛】解答本题的关键是掌握转基因技术、动物细胞培养、胚胎移植等过程，能够弄清楚题图中不同的猪提供的结构和作用，明确核移植时的卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期，并能够选择正确的方法检测目的基因是否表达。
34．（2019江苏卷·31）（8分）图1为T细胞通过表面受体（TCR）识别抗原递呈细胞呈递的肿瘤抗原后被激活，进而攻击肿瘤细胞的示意图。图2为肿瘤细胞的一种免疫逃逸机制示意图。肿瘤细胞大量表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞活化，逃避T细胞的攻击。请回答下列问题：
（1）图1中抗原递呈细胞通过_________方式摄取肿瘤抗原。
（2）图1中T细胞识别肿瘤抗原后被激活，增殖并__________形成效应T细胞群和__________细胞群。
（3）图1中效应T细胞通过TCR只能识别带有同样抗原的肿瘤细胞，故发挥的免疫作用具有_________性，效应T细胞分泌毒素，使肿瘤细胞__________死亡。
（4）为阻断图2中肿瘤细胞的免疫逃逸通路，利用单克隆抗体制备技术，制备了抗PD-L1抗体。该抗体注入体内后通过__________传送与__________结合，可解除T细胞的活化抑制。
（5）为应用于肿瘤的临床免疫治疗，需对该抗体进行人源化改造，除抗原结合区域外，其他部分都替换为人抗体区段，目的是__________。
【答案】（1）胞吞
（2）分化 记忆
（3）特异 裂解
（4）体液 肿瘤细胞表面的PD-L1
（5）降低免疫排斥
【解析】
【分析】由图1可知，TCR是T细胞表面的特异性受体，可以识别肿瘤抗原。TCR识别吞噬细胞处理呈递的肿瘤抗原后，可以增殖分化出记忆T细胞和效应T细胞，效应T细胞可以识别并攻击肿瘤细胞，引起肿瘤细胞的裂解死亡。
由图2可知，肿瘤细胞表面的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1蛋白特异性结合，抑制T细胞增殖分化，从而逃避免疫系统的攻击。
【详解】（1）抗原属于大分子物质，抗原呈递细胞通过胞吞摄取肿瘤抗原，处理后呈递给T细胞，引起T细胞的增殖分化。
（2）图1中，T细胞表面的TCR识别肿瘤抗原后，可以增殖分化出记忆T细胞和效应T细胞。其中的效应T细胞会攻击肿瘤细胞，引起其裂解死亡。
（3）效应T细胞通过TCR特异性识别携带同种肿瘤抗原的肿瘤细胞，该过程具有特异性。由图可知，效应T细胞可以分泌毒素，引起肿瘤细胞的裂解死亡。
（4）由图2可知，肿瘤细胞表面的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1蛋白特异性结合，抑制T细胞增殖分化，从而逃避免疫系统的攻击，故可以通过注射抗PD-L1抗体阻断肿瘤细胞的逃逸通路。抗PD-L1抗体进入人体后，通过体液运输与肿瘤细胞表面的PD-1蛋白结合，从而接触T细胞的活化抑制。
（5）由于单克隆抗体是利用鼠的骨髓瘤细胞与浆细胞融合的杂交瘤细胞分泌产生，对人来说是异物，为了降低免疫排斥，需要对单克隆抗体进行改造，出抗原结合区域外，其他部分都替换成人抗体区段。
【点睛】由图分析可知，肿瘤细胞的一种免疫逃逸机制即通过肿瘤细胞表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1蛋白特异性结合，抑制T细胞增殖分化，从而逃避T细胞的攻击，故可以用抗PD-L1蛋白或抗PD-1蛋白的抗体进行治疗。
35．（2019江苏卷·33）（8分）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________未端。
（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。
菌落类型平板类型
A
B
C
无抗生素
﹢
﹢
﹢
氨苄青霉素
﹢
﹢
﹣
四环素
﹢
﹣
﹣
氨苄青霉素+四环素
﹢
﹣
﹣
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_______________。
【答案】（1）平
（2）胸腺嘧啶（T） DNA连接
（3）B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒
（4）乙丙 目的基因反向连接
【解析】
【分析】基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后悔破坏了四环素抗性基因（tetr）。
【详解】（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）据图分析，目的基因两侧为粘性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要个加一个碱基T形成具有粘性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
【点睛】解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤，尤其是对核心步骤—构建基因表达载体步骤的理解，明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用，进而结合题干要求分析答题。
36．（2019浙江4月选考·32）回答下列（二）小题：
（二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
（1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______技术获得特异性探针，并将______中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。
（2）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测______（A．质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物）。
（3）植物细胞在培养过程中往往会发生______，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
（4）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是______。
【答案】（二）（1）单克隆抗体 基因文库
（2）B
（3）变异 高浓度致病真菌 花粉离体
（4）胚的离体培养
【解析】
【分析】（二）目的基因表达产物在分子水平的检测包括DNA分子杂交、DNA-RNA分子杂交和抗原抗体杂交；生物变异在生产上应用时，可通过杂交育种、单倍体育种的方式获得稳定遗传的植株，单倍体育种的速度更快，相对的操作更加复杂。
【详解】（二）（1）抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因；
（2）质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A选项错误；转录产物为RNA，可以通过DNA-RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B选项正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C选项错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D选项错误；故正确的选项选择B；
（3）抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选；
（4）要利用胚的发育获得植株，可利用胚细胞的全能性，采用胚的离体培养获得植株。
专题20 现代生物科技专题
1. （2021·6浙江月选考）采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子官，才可获得表达 EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光，能表达 EGFP 的即为雄性小鼠胚胎
【答案】 B
【解析】 B受精卵经体外培养至囊胚期，须将其植入同期发情小鼠的子官
2．（2021·1月浙江选考）下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是（ ）
A．步骤①的操作不需要在无菌环境中进行
B．步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离
C．步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理
D．步骤④培养过程中不会发生细胞转化
【答案】C
【分析】
动物细胞培养过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。
【详解】
A、动物细胞培养过程需要无菌操作，故步骤①的操作需要在无菌环境中进行，A错误；
B、动物细胞培养过程需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物组织，分散成单个细胞，制成细胞悬液，B错误；
C、传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，使之分散成单个细胞，再分瓶培养，C正确；
D、步骤④为传代培养过程，该过程中部分细胞可能发生细胞转化，核型改变，D错误。
故选C。
3．（2021·湖南高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：
（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是_________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的_________断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_________。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_________（答出两点即可），功能上具有_________。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的_________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路_________。
【答案】（1）限制性核酸内切酶（限制酶） 磷酸二酯键
（2）清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害
（3）动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答） 发育的全能性
（4）B 用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活
【分析】
1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、核移植：
（1）概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物；
（2）原理：动物细胞核的全能性；
（3）动物细胞核移植可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。原因：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。
【详解】
（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
（3）由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
（4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活。
【点睛】
本题结合图示考查基因工程、核移植、胚胎移植、单克隆抗体的相关知识，涉及知识点较多，但难度不大，要求考生掌握基础知识，属于考纲中识记与理解层次。
4．（2021·全国乙卷高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
【答案】（1）EcoRI、PstI EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV
（2）磷酸二酯键
（3）自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
（4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【分析】
基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
【详解】
（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【点睛】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
5．（2021·广东高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】（1）基因文库中获取、人工合成法
（2）盐析法、酶解法或高温变性
（3）感受态 抗原-抗体杂交技术
（4）有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】
本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
6．（2021·全国甲卷高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是_________，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是_______ 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_______ 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】（1）④②③①
（2）Taq酶（热稳定DNA聚合酶） 延伸 Taq酶从引物起始进行互补链的合成
（3）两条单链DNA
（4）一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【分析】
PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
【详解】
（1）PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
（2）在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶），PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成。
（3）DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。
（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【点睛】
本题考查PCR技术及应用，难度较小，解答本题的关键是明确PCR技术的原理，具体反应过程，以及在临床病原菌检测中的应用。
7．（2021·河北高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。
【答案】（1）基因组文库
（2）限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定
（3）农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散
（4）耐性 茎叶
（5）YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【分析】
1、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是部分基因文库。
2、据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。
【详解】
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】
本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。
8. （2021·6浙江月选考）（15 分）回答下列（二）小题：
（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成__________，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克降，质粒载体应含有__________________________________________________（答出2 点即可）。提取质粒后，采用__________法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马伍囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
（二）（1）富营养化
（2）重组DNA分子 限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因 显微注射
（3）胰蛋白酶 原代 饲养层细胞
9．（2021·1月浙江高考真题）回答下列（二）小题：
（二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。
（1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。
（2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。
（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
【答案】（二）（1）遗传 间种
（2）DNA聚合酶 愈伤组织
（3）继代 杀灭发根农杆菌 转速 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度
【解析】（二）（1）生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。
（2）分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。
（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
10．（2020年山东省高考生物试卷（新高考)·13）两种远缘植物的细胞融合后会导致一方的染色体被排出。若其中一个细胞的染色体在融合前由于某种原因断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中。依据该原理，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，过程如下图所示。下列说法错误的是（ ）
A．过程①需使用纤维素酶和果胶酶处理细胞
B．过程②的目的是使中间偃麦草的染色体断裂
C．过程③中常用灭活的病毒诱导原生质体融合
D．耐盐小麦的染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段
【答案】C
【解析】
【分析】
从图中看出①是去掉植物细胞壁，②是用紫外线诱导染色体变异，③融合形成杂种细胞。
【详解】
A、过程1是获得植物细胞的原生质体，需要用纤维素酶和果胶酶将细胞壁分解，A正确；
B、根据题干信息“将其中一个细胞的染色体在融合前断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，”故过程②通过紫外线照射是使中间偃麦草的染色体断裂，B正确；
C、灭活的病毒诱导是动物细胞融合特有的方法，诱导植物原生质体融合常用物理法、化学法，C错误；
D、实验最终将不抗盐的普通小麦和抗盐的偃麦草整合形成耐盐小麦，说明耐盐小麦染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段，D正确。
故选C。
【点睛】
本题的难点是对过程②的分析，考生需要结合题干中的信息作答。
11．（2020年山东省高考生物试卷（新高考)·14）经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚，通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。下列说法错误的是（ ）
A．用促性腺激素处理雌鼠可以获得更多的卵子
B．体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理
C．胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植
D．遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得
【答案】C
【解析】
【分析】
1、胚胎移植的基本程序主要包括：
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。
②配种或人工授精。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来（也叫冲卵）。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。
⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
2、体外受精主要包括：卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精。
【详解】
A、促性腺激素可以使雌鼠超数排卵，获得更多的卵子，A正确；
B、精子只有获能后才能完成受精，故体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理，B正确；
C、胚胎移植通常选择囊胚期之前的阶段，如桑椹胚或囊胚阶段，C错误；
D、转基因技术可以定向改造小鼠的基因，所以遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得，D正确。
故选C。
【点睛】
本题考查胚胎工程的基本知识，考生需要识记基本操作，D项中需要结合基因工程的目的进行解答。
12．（2020年江苏省高考生物试卷·23）小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种功能细胞、制备流程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子
B．细胞a和细胞b内含有的核基因不同，所以全能性高低不同
C．用胰蛋白酶将细胞a的膜白消化后可获得分散的胚胎干细胞
D．胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养
【答案】ABC
【解析】
【分析】
1、胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）。
2、ES细胞在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态．在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸、丁酰环腺苷酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡机理提供了有效的手段。
【详解】
A、为了获得更多的囊胚，可以采用激素促进成熟雌性个体超数排卵，然后将卵细胞从母体内取出，在试管内与人工采集的精子进行体外受精，培育成胚胎，A错误；
B、细胞a和细胞b是由同一个受精卵经过有丝分裂形成的，故核基因相同，B错误；
C、运用细胞培养技术可以从哺乳动物的早期胚胎中获得胚胎干细胞，首先必须用胰蛋白酶处理内细胞团，分解细胞间的胶原蛋白等，使之分散成单个细胞，C错误；
D、动物细胞培养时需要在5% CO2的培养箱中进行培养，以维持培养液的pH，D正确。
故选ABC。
13．（2020年天津高考生物试卷·1）在克隆哺乳动物过程中，通常作为核移植受体细胞的是去核的（ ）
A．卵原细胞
B．初级卵母细胞
C．次级卵母细胞
D．卵细胞
【答案】C
【解析】
【分析】
体细胞核移植过程：
【详解】
在克隆哺乳动物过程中，通常选择减数第二次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞，即次级卵母细胞。
故选C。
14．阅读下列材料，回答下列小题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进展。
资料一：人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规模爆发。
资料二：小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。
资料三：疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5种不同抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1中。在按蚊肠道内，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫。因AS1可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一般可被阻断。
11．（2020年天津高考生物试卷）目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是（ ）
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
12．在利用种间关系进行生物防治的措施中，下列分析错误的是（ ）
A．施用绿僵菌工程菌减少虫害，不改变绿僵菌与害虫之间存在寄生关系
B．引入Fhb7增强小麦的抗菌性，目的是调节真菌对植物的寄生能力
C．AS1工程菌分泌的多种表达产物不改变AS1与按蚊之间存在共生关系
D．使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是调节按蚊对人的寄生能力
【答案】
11．B
12．D
【解析】
【分析】
1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、生物的种间关系包括竞争、捕食、互利共生和寄生。互利共生是指两种生物共居一起，彼此创造有利的生活条件，较之单独生活时更为有利；相互依赖，相互依存，一旦分离，双方都不能正常地生活。寄生是指一种生物生活在另一种生物的体内或体表，并从后者摄取营养以维持生活的种间关系。前者称寄生物，后者称寄主。大都为一方受益，一方受害，甚至引起寄主患病或死亡。
11．
A、目的基因可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增或是人工合成，A错误；
B、资料一中神经毒素基因AalT导入绿僵菌中可以增强绿僵菌致死害虫的效应，资料二中Fhb7基因导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，资料三，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，因此上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活，B正确；
C、基因AalT导入绿僵菌中可用感受态细胞法，Fhb7基因导入小麦可用农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中可用感受态细胞法，C错误；
D、要想达到生物防治的目的不一定要将目的基因导入防治对象，如资料一，可将目的基因导入能寄生在多种害虫体内的绿僵菌中，如资料三，可将目的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，这种方法同样可以达到生物防治的目的，D错误。
故选B。
12．
A、导入AalT基因的绿僵菌只是增强了致死害虫的效应，没有改变绿僵菌与害虫之间存在的寄生关系，A正确；
B、Fhb7基因导入小麦后，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，调节了真菌对植物的寄生能力，B正确；
C、AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，并不会改变AS1与按蚊之间存在的共生关系，C正确；
D、使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是阻断疟疾的传播，不会改变按蚊对人的寄生能力，D错误。
故选D。
15．（2020年浙江省高考生物试卷（7月选考)·15）下列关于病毒的叙述，错误的是（ ）
A．有的病毒经灭活处理后，可用于细胞工程中介导动物细胞的融合
B．适当增加机体内参与免疫的细胞数量与活性，可提高对新型冠状病毒的抵御能力
C．在某人的分泌物中检测到新型冠状病毒，推测该病毒的增殖不依赖于宿主细胞
D．用高温高压处理病毒使其失去感染能力，原因之一是病毒的蛋白质发生了热变性
【答案】C
【解析】
【分析】
诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心、 震动、 电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
【详解】
A、有的病毒经灭活处理后，可用于细胞工程中介导动物细胞的融合，如灭活的病毒， A正确；
B、适当增加机体内参与免疫的细胞数量与活性，可以参与免疫调节中的体液和细胞免疫，尽可能杀死更多的病毒，可提高对新型冠状病毒的抵御能力，B正确；
C、在某人的分泌物中检测到新型冠状病毒，是因为病毒浸入细胞后大量繁殖，病毒从细胞中释放出来，不能说明该病毒的增殖不依赖于宿主细胞，C错误；
D、用高温高压处理病毒使其失去感染能力，原因之一是病毒的蛋白质在高温高压下，空间结构发生变化，肽链松散，发生了变性，D正确。
故选C。
16．（2020年浙江省高考生物试卷（7月选考)·24）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
【答案】D
【解析】
【分析】
基因工程中通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按一定的程序进行操作，包括目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。
【详解】
A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；
B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；
C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；
D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。
故选D。
17．（2019北京卷·4）甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株。再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种，以下对相关操作及结果的叙述，错误的是
A．将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C．调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株
D．经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
【答案】D
【解析】
【分析】由题意可知，同时抗甲、乙的植物新品种的培养过程为：把含抗甲的目的基因的重组质粒导入植物细胞，获得抗甲植株，同时把含抗乙的目的基因的重组质粒导入植物细胞，获得抗乙植株，通过杂交获得F1（二倍体植株），取F1的花粉经花药离体培养获得单倍体植株，用秋水仙素处理单倍体植株获得纯合的同时抗甲、乙的植物新品种（二倍体）。
【详解】要获得转基因的抗甲或抗乙植株，需要构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点），再把基因表达载体导入受体细胞中，A正确；对转基因植株进行检测时，可以通过抗病接种实验进行个体水平的检测，B正确；对F1的花粉进行组织培养时，需要经过脱分化和再分化过程，其中生长素/细胞分裂素比例高时利于根的分化，比例低时利于芽的分化，C正确；经花粉离体培养获得的植株是单倍体，D错误。因此，本题答案选D。
18．（2019江苏卷·16）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
【答案】D
【解析】
【分析】转基因技术的原理是基因重组。基因重组和基因突变、染色体变异均属于可遗传的变异。
基因治疗：指把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
【详解】将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入大肠杆菌获得的转基因菌，可以通过二分裂将胰岛素基因传给后代，A不符合题意；将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得的植株所有细胞均含有花青素代谢基因，花青素代谢基因会随该植物传给后代，B不符合题意；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛所有细胞均含有肠乳糖酶基因，可以遗传给后代，C不符合题意；该患者进行基因治疗时，只有淋巴细胞含有该腺苷酸脱氨酶基因，性原细胞不含该基因，故不能遗传给后代，D符合题意。
19．（2019江苏卷·23）下图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT-），在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述正确的是
A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合
B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长
C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产
D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础
【答案】ACD
【解析】
【分析】（1）动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性、细胞的增殖，诱导手段有电激、聚乙二醇、灭活的病毒等，结果产生杂交细胞，主要用于制备单克隆抗体。
（2）单克隆抗体制备的原理包括：①免疫理：B淋巴细胞能产生特异性抗体；②细胞融合原理：利用病毒对宿主细胞的穿透性使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合；③动物细胞培养技术：对杂交瘤细胞进行体内、体外培养。
（3）制备单克隆抗体过程中的几种细胞：①免疫B细胞（浆细胞）：能产生单一抗体，但不能无限增殖；②骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能产生抗体；③杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能在体外培养条件下无限增殖。
【详解】诱导动物细胞融合的方法有电激、聚乙二醇、灭活的病毒（如灭活的仙台病毒）等，A正确；
两两融合的细胞包括免疫B细胞与免疫B细胞融合的具有同种核的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的具有同种核的细胞、免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，骨髓瘤细胞虽然能无限增殖，但缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，免疫B细胞虽然有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，但不具有无限增殖的本领，所以在HAT筛选培养液中，两两融合的具有同种核的细胞都无法生长，只有杂交瘤细胞才能生长，B错误；因每个免疫B细胞只分泌一种特异性抗体，因此在HAT筛选培养液中筛选出来的众多的杂交瘤细胞所分泌的抗体，不一定都是人类所需要的，还需要进一步把能分泌人类所需要抗体的杂交瘤细胞筛选出来，C正确；动物细胞融合是以细胞膜的流动性为基础的，D正确。
20．（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅰ)·38）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。
回答下列问题：
（1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是_________________。
（2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_________________。
（3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于_________________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是_________________。
（4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有________________（答出2点即可）。
【答案】（1）诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞
（2）取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液
（3）选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的反应具有特异性
（4）将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养
【解析】
【分析】
由图可知，筛选1指用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，筛选2指进行克隆化培养和专一抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
【详解】
（1）实验前给小鼠甲注射病毒A，是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。
（2）取小鼠的脾脏，剪碎组织，用胰蛋白酶处理获得单个细胞，加入培养液可以制成单细胞悬液。
（3）图中筛选1需要用到选择培养基，只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，该过程要用到抗原抗体杂交，故筛选所依据的原理是抗原-抗体反应具有特异性。
（4）获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，可以在体外培养液中进行培养，或在小鼠的腹腔中进行培养，使杂交瘤细胞大量增殖。
【点睛】
制备单克隆抗体的过程中，需要用到动物细胞融合和动物细胞培养，需要用到两次筛选，第一次筛选的目的是获得杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
21．（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅱ)·38）植树造林、“无废弃物农业”、污水净化是建设美丽中国的重要措施。回答下列有关生态工程的问题：
（1）在植树造林时，一般认为，全部种植一种植物的做法是不可取的。因为与混合种植方式所构建的生态系统相比，按照种植一种植物方式所构建的生态系统，其抵抗力稳定性___________。抵抗力稳定性的含义是___________。
（2）“无废弃物农业”是我国利用生态工程的原理进行农业生产的一种模式，其做法是收集有机物质。包括人畜粪便、枯枝落叶等，采用堆肥和沤肥等多种方式，把它们转变为有机肥料，再施用到农田中。施用有机肥料的优点是________________（答出3点即可）。在有机肥料的形成过程中，微生物起到了重要作用，这些微生物属于生态系统组分中的________。
（3）在污水净化过程中，除发挥污水处理厂的作用外，若要利用生物来回收污水中的铜、镉等金属元素，请提供一个方案：_______________。
【答案】（1）低 生态系统抵抗外界干扰并使自身的结构与功能保持原状或不受损害的能力
（2）改善了土壤结构；培育了土壤微生物；实现了土壤养分的循环利用 分解者
（3）种植能吸收这些金属元素的水生植物，再从植物中回收金属
【解析】
【分析】
1、生态系统的稳定性：包括抵抗力稳定性和恢复力稳定性。
2、生态工程的基本原理：
①物质循环再生原理：物质能在生态系统中循环往复，分层分级利用；
②物种多样性原理：物种繁多复杂的生态系统具有较高的抵抗力稳定性；
③协调与平衡原理：生态系统的生物数量不能超过环境承载力（环境容纳量）的限度；
④整体性原理：生态系统建设要考虑自然、经济、社会的整体影响；
⑤系统学和工程学原理：系统的结构决定功能原理：要通过改善和优化系统结构改善功能；
系统整体性原理：系统各组分间要有适当的比例关系，使得能量、物质、信息等的转换和流通顺利完成，并实现总体功能大于各部分之和的效果，即“1+1＞2”。
【详解】
（1）生态系统的抵抗力稳定性取决于生态系统中物种组成的复杂程度，种植一种植物，生态系统的生物种类过少，抵抗力稳定性较低；所谓抵抗力稳定性是指生态系统抵抗外界干扰并使自身的结构与功能保持原状或不受损害的能力。
（2）由于有机肥料中有机物较多，故施用有机肥料可以改善土壤结构、培育土壤微生物、实现了土壤养分的循环利用。分解人畜粪便、枯枝败叶中的有机物质的微生物属于分解者。
（3）利用生物来回收污水中的金属元素，可以通过种植能吸收这些金属元素的水生植物，再从植物中回收金属。
【点睛】
本题考查生态系统和生态工程的相关知识，要求考生识记生态系统的结构、稳定性以及生态工程的基本原理及生态恢复工程的实例，掌握生态农业的意义，能结合所需的知识准确答题。
22．（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅲ)·38）W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。
（1）步骤①中需要使用的工具酶有________________。步骤②和③所代表的操作分别是________________和________________。步骤④称为________________。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的______________（答出2点即可）的限制。
（3）一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________________（填相同或不同），原因是_________。
（4）从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有_____________（答出2点即可）。
【答案】（1）限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射 体外培养 胚胎移植
（2）性别、年龄
（3）相同 两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵
（4）体外受精、胚胎移植
【解析】
【分析】
1、膀胱反应器有着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易,不会对动物造成伤害。此外,该系统可从动物一出生就收集产物,不论动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显著的优势在于从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。
2、基因工程技术的基本步骤包括：目的基因的获取；基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
3、分析题图可知，步骤①为将W基因与运载体结合，构建基因表达载体；步骤②为将重组表达载体导入受精卵，常用显微注射法；步骤③为体外培养；步骤④为胚胎移植。
【详解】
（1）由分析可知，步骤①为构建基因表达载体，需使用同种限制酶切割目的基因和运载体，再由DNA连接酶连接粘性末端，形成重组表达载体；步骤②为显微注射；步骤③为体外培养；步骤④为胚胎移植。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W，可从动物一出生就收集产物,不受动物的性别和年龄的限制。
（3）在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是由同一个受精卵有丝分裂产生的体细胞，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息相同。
（4）由分析可知，步骤③为体外培养，步骤④为胚胎移植，均属于胚胎工程。
【点睛】
本题考查基因工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记基因工程的基本工具和操作步骤，掌握胚胎工程各项技术的相关细节，能结合所学的知识准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查。
23．（2020年山东省高考生物试卷（新高考)·25）水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
（1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_____________。
（2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了______，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列___ (填：发生或不发生)改变，原因是_____________。
（3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_____过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_____________。
（4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_____，原因是_____________。
【答案】（1）限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化
（2）RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 （3）逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合）
（4）品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
【解析】
【分析】
基因工程的操作步骤：
1、获取目的基因（从基因组文库中获取、利用PCR技术扩增目的基因、化学合成法）；
2、基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；一个完整的基因表达载体包括：
（1）启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动目的基因的转录；（2）目的基因：编码蛋白质的基因；（3）终止子：位于基因的尾端，其作用使转录在需要的地方停止；（4）标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。
3、将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
4、目的基因的检测与鉴定 （DNA分子杂交技术,分子杂交技术、抗原抗体杂交）。
【详解】
（1）将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。
（2）根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平，在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。
（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术转移性扩增出Wx基因的cDNA。
（4）识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
【点睛】
本题考查基因工程的知识点，要求学生掌握基因工程的操作工具和操作步骤是解决问题的关键。识记并理解基因工程中工具酶的种类和作用，把握基因表达载体构建的过程，理解启动子的功能和编码蛋白质的基因的结构，这是该题考查的难点；把握PCR扩增技术的操作过程和引物的作用，这是突破第（3）问的关键。
24．（2020年天津高考生物试卷）某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时，参照品种B的最佳激素配比（见下表）进行预实验。
品种B组织培养阶段
细胞分裂素浓度（μmol/L）
生长素浓度（μmol/L）
Ⅰ诱导形成愈伤组织
m1
n1
Ⅱ诱导形成幼芽
m2
n2
Ⅲ诱导生根
m3
n3
据表回答：
（1）Ⅰ阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是________________。
（2）在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段中发生基因选择性表达的是________________阶段。
（3）为确定品种A的Ⅰ阶段的最适细胞分裂素浓度，参照品种B的激素配比（m1>2．0），以0．5 μmol/L为梯度，设计5个浓度水平的实验，细胞分裂素最高浓度应设为________μmol/L。
（4）Ⅲ阶段时，科研人员分别选用浓度低于或高于n3 μmol/L的生长素处理品种A幼芽都能达到最佳生根效果，原因是处理幼芽时，选用低浓度生长素时的处理方法为________，选用高浓度生长素时的处理方法为________。
（5）在________阶段用秋水仙素对材料进行处理，最易获得由单个细胞形成的多倍体。
【答案】（1）细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织
（2）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
（3）m1+1.0
（4）浸泡法（长时间处理） 沾蘸法（短时间处理）
（5）Ⅰ
【解析】
【分析】
愈伤组织是由一团未分化的细胞组成的，在组织培养中，条件适宜就会分化成各种组织。如果培养基中细胞分裂素和生长素的比例合适，会促进愈伤组织的生长，分化出根和茎叶；细胞分裂素太多时，有利于芽的分化、抑制根的形成；生长素用量太多时，有利于根的分化、抑制芽的形成；而当生长素少，细胞分裂素也不多时，则愈伤组织继续生长，不发生分化。基因的选择性表达是指基因在特定的时间和空间条件下有选择表达的现象，据此分析。
【详解】
（1）在诱导愈伤组织形成时，通常采用茎尖、幼叶做外植体，因为这些部位的细胞分裂能力强、分化程度低，全能性容易表达，容易诱导产生愈伤组织。
（2）Ⅰ过程愈伤组织形成是离体的植物细胞脱分化的结果，脱分化过程中细胞的结构和功能发生的明显改变，成为未分化状态；Ⅱ、Ⅲ过程形成幼芽、根的过程存在细胞的分化，分化和脱分化都存在基因的选择性表达，故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段都存在基因的选择性表达。
（3）根据题意，表中数据为品种B的最佳激素配比，若要确定品种A的Ⅰ阶段最佳细胞分裂素浓度，以0.5μmol/L为梯度，可参考m1为中间值，故实验中细胞分裂素最高浓度可设为m1+1.0μmol/L。
（4）实验中用生长素处理插条的方法可选用浸泡法或沾蘸法，浸泡法时间长、所需浓度低，而沾蘸法处理时间短、所需浓度高；因此Ⅲ过程中分别选用浓度低于或高于n3μmol/L的生长素处理品种A的幼苗芽，选用低浓度生长素时的处理方法为浸泡法，时间长，而选用高浓度生长素时处理方法为沾蘸法，时间短，都能达到比较适宜的浓度，达到最佳生根效果。
（5）秋水仙素可抑制纺锤体形成，导致染色体加倍形成多倍体，愈伤组织分裂旺盛，故在Ⅰ阶段用秋水仙素处理，最易获得由单个细胞形成的多倍体。
【点睛】
本题以植物组织培养为背景，主要考查组织培养过程激素的使用，意在考查考生能理解所学知识的要点,把握知识间 的内在联系和分析数据、处理数据的能力。
25．（2020年浙江省高考生物试卷（7月选考)）回答下列（二）小题：
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，
应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。
（2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。
（4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。
（二）（1）抗性基因
（2）全能性表达充分 显微注射
（3）短 脱分化
（4）生长素 根的分生组织 B
【解析】
（二）（1）设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。
（2）转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故选B。
26．（2020年江苏省高考生物试卷）新型冠状病毒可通过表面的刺突蛋白（S蛋白）与人呼吸道粘膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图1为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题：
（1）图1中人体内抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被__________细胞表面的受体识别后激活该细胞。
（2）B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的__________，形成__________细胞。
（3）为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的__________；采集血液样本主要用于血清学检查，检测__________。
（4）据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射__________免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得__________细胞。因为同一种抗原可能激活__________细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。
【答案】（1）T
（2）增殖、分化 浆细胞和记忆
（3）核酸 抗新型冠状病毒抗体
（4）刺突蛋白（或S蛋白） 杂交瘤 多种B
【解析】
【分析】
本题以新冠病毒为载体考查体液免疫、核酸检测和单克隆抗体的有关知识。体液免疫包括三个阶段：（1）感应阶段：除少数抗原可以直接刺激B细胞外，大多数抗原被吞噬细胞摄取和处理，并暴露出其抗原决定簇；吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞；（2）反应阶段：B细胞接受抗原刺激后，开始进行一系列的增殖、分化，形成记忆细胞和浆细胞；（3）效应阶段：浆细胞分泌抗体与相应的抗原特异性结合，发挥免疫效应。制备单克隆抗体的具体过程：1、用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞；2 、将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；3、在HAT选择性培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖；4、在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增；5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。
【详解】
（1）据题图1可知，人体内抗原递呈细胞吞噬新冠病毒，并将新冠病毒的抗原暴露，呈递给T细胞，被T细胞表面的受体识别后激活T细胞；
（2）激活的T细胞释放淋巴因子，并将抗原呈递给B细胞，B细胞识别入侵的病毒后，迅速增殖分化成浆细胞和记忆细胞；
（3）临床上为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测疑似患者的呼吸道是否有新冠病毒的核酸，采集血液样本主要用于血清学检查，检测血清中是否产生抗新型冠状病毒的抗体；
（4）据题中图2所示，结合单克隆抗体制备方法，要研制抗刺突蛋白单克隆抗体，需先注射新冠病毒的刺突蛋白（或S蛋白），以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得融合的、未融合的细胞，用HAT筛选培养基培养，未融合的B细胞不能长期生存而死亡，未融合的骨髓瘤细胞不能合成DNA而死亡，只有杂交瘤细胞能成活；由于同一种抗原可能激活多种B细胞，筛选出的融合的骨髓瘤细胞就可能分泌多种抗体，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞。
27．（2020年江苏省高考生物试卷）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）：
请据图回答问题：
（1）步骤I用的EcoR I是一种__________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。
（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。
（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（从引物①②③④中选择，填编号）。
DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
PCR引物
①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′
②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′
④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′
（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。
A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′
B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′
C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′
D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′
【答案】（1）限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列
（2）磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸
（3）②④
（4）B
【解析】
【分析】
采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸、终止，PCR技术扩增目的基因的原理：DNA双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。
【详解】
（1）EcoR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。
（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。
（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。
【点睛】
本题主要考查PCR的过程和应用，意在强化考生对PCR技术的理解，要求考生能分析题图提取有效信息，从引物碱基序列、延伸方向等方面进行分析和解答，对考生的理解和分析能力提出了较高要求。
28．（2019全国卷Ⅰ·38）
基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。
【答案】（1）基因组文库 cDNA文库
（2）解旋酶 加热至90~95 ℃ 氢键
（3）Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
【解析】
【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取（基因文库获取、PCR、人工合成）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平—DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原抗体杂交法和个体水平—抗虫、抗病接种实验等）。
【详解】（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库（CDNA文库），前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。
（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。
（3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。
【点睛】PCR的原理是DNA双链的复制，故类似于细胞内的DNA复制过程，需要模板、原料等条件。由于该过程中特殊的高温条件，需要用耐高温的DNA聚合酶。
29．（2019全国卷II·38）植物组织培养技术在科学研究和生产实践中得到了广泛的应用。回答下列问题。
（1）植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有______________________（答出2点即可）。
（2）通过组织培养技术，可把植物组织细胞培养成胚状体，再通过人工种皮（人工薄膜）包装得到人工种子（如图所示），这种人工种子在适宜条件下可萌发生长。人工种皮具备透气性的作用是_______________________________。人工胚乳能够为胚状体生长提供所需的物质，因此应含有植物激素、___________和___________等几类物质
（3）用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植物的___________进行组织培养。
（4）植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是_________________________________________________（用流程图表示）。
【答案】（1）能保持植物原有的遗传特性，繁殖速度快
（2）有利于胚状体进行呼吸作用 矿质元素 糖
（3）茎尖
（4）含目的基因的细胞愈伤组织小植株
【解析】
【分析】植物组织培养的流程是：离体的植物器官、组织或细胞经脱分化形成愈伤组织，经再分化形成芽、根或胚状体，进而形成完整植株。植物组织培养技术在微型繁殖、制造人工种子、作物脱毒等方面具有广泛的应用。微型繁殖属于无性生殖的范畴，能够保持亲本的优良特性，实现种苗的快速大量繁殖。人工种子是以通过植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子，其中的如果胚乳可为“种子”的萌发提所需的供营养物质。以无病毒或病毒极少的茎尖为材料进行组织培养可获得高产优质的无病毒植株。
【详解】（1）植物微型繁殖是指用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有：保持优良品种的遗传特性；高效快速地实现种苗的大量繁殖。
（2）人工种子的胚状体在进行细胞呼吸时，需要从外界环境吸收O2，并将产生的CO2释放到外界环境中，因此人工种皮具备透气性的作用是：有利于胚状体进行呼吸作用，以保持胚状体的活力。人工胚乳的作用是为胚状体的发育提供营养，因此应含有植物激素、矿质元素、糖等物质。
（3）植物分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒，因此为了获得脱毒苗，可以选取植物的茎尖进行组织培养。
（4）将含有目的基因的植物细胞培养为一个完整的转基因植物，需借助植物组织培养技术才能实现，其基本程序是：。
【点睛】解题的关键是识记并理解植物组织培养的过程和植物组织培养技术在微型繁殖、制造人工种子、作物脱毒等方面的实际应用。在此基础上，从题意中提取有效信息，进而对各问题情境进行分析解答。
30．（2019全国卷III·38）培养胡萝卜根组织可获得试管苗，获得试管苗的过程如图所示。
回答下列问题。
（1）利用胡萝卜根段进行组织培养可以形成试管苗。用分化的植物细胞可以培养成完整的植株，这是因为植物细胞具有__________。
（2）步骤③切取的组织块中要带有形成层，原因是____________。
（3）从步骤⑤到步骤⑥需要更换新的培养基，其原因是____________。在新的培养基上愈伤组织通过细胞的____________过程，最终可形成试管苗。
（4）步骤⑥要进行照光培养，其作用是____________。
（5）经组织培养得到的植株，一般可保持原品种的__________，这种繁殖方式属于____________繁殖。
【答案】（1）全能性（或答：形成完整植株所需的全部基因）
（2）形成层容易诱导形成愈伤组织
（3）诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化形成试管苗所需的生长素和细胞分裂素的比例不同 分化（或答：再分化）
（4）诱导叶绿素的形成，使试管苗能够进行光合作用
（5）遗传特性 无性
【解析】
【分析】根据题干信息分析，培养胡萝卜组织获得试管苗的过程利用了植物组织培养技术，该技术的原理是植物细胞的全能性；该过程中离体的组织块脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成胚状体，最终培育成试管苗。
【详解】（1）根据题意分析，用胡萝卜的组织细胞可以培育成完整的植株，其原理是植物细胞的全能性。
（2）形成层细胞具有分裂能力，分化程度低，易形成愈伤组织，因此步骤③中切取胡萝卜块时强调要切取含有形成层的部分。
（3）步骤⑤为脱分化过程，步骤⑥为再分化过程，由于营养物质的消耗以及两个过程需要激素的比例要求等有所不同，因此由步骤⑤到步骤⑥的过程需要更换新的培养基；愈伤组织形成试管苗的过程为再分化。
（4）步骤⑥为再分化过程，需要进行光照，以利于叶绿素的合成。
（5）植物组织培养技术属于无性繁殖，获得的后代可以保持亲本的优良性状。
【点睛】解答本题的关键是掌握植物组织培养的详细过程及其原理，明确离体的组织需要经过脱分化和再分化过程才能发育为完整的植株，并能够对不同过程进行合理的分析。
31．（2019北京卷·31）光合作用是地球上最重要的化学反应，发生在高等植物、激类和光合细菌中。
（1）地球上生命活动所需的能量主要来源于光反应吸收的____________，在碳（暗）反应中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2与RuBP（C5）结合，生成2分子C3，影响该反应的外部因素，除光照条件外还包括_________________________（写出两个）；内部因素包括_____________（写出两个）。
（2）R酶由8个大亚基蛋白（L）和8个小亚基蛋白（S）组成。高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因编码并在___________中由核糖体合成后进入叶绿体，在叶绿体的___________中与L组装成有功能的酶。
（3）研究发现，原核生物蓝藻（蓝细菌）R酶的活性高于高等植物，有人设想通过基因工程技术将蓝藻R酶的S、L基因转入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人员将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。转基因植株能够存活并生长。检测结果表明，转基因植株中的R酶活性高于未转基因的正常植株。
①由上述实验能否得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测？请说明理由。
②基于上述实验，下列叙述中能够体现生物统一性的选项包括____________。
a．蓝藻与甲都以DNA作为遗传物质
b．蓝藻与甲都以R酶催化CO2的固定
c．蓝藻R酶大亚基蛋白可在甲的叶绿体中合成
d．在蓝藻与甲的叶肉细胞中R酶组装的位置不同
【答案】（1）光能 温度、CO2浓度 R酶活性、R酶含量、C5含量、pH（其中两个）
（2）细胞质 基质
（3）①不能，转入蓝藻S、L基因的同时没有去除甲的S基因，无法排除转基因植株R酶中的S是甲的S基因的表达产物的可能性。
②a、b、c
【解析】
【分析】本题主要考查光合作用、基因工程及基因对性状的控制的有关知识。影响光合作用的外界因素主要有光照、温度、水、无机盐和CO2浓度等，内部因素主要有色素的含量和种类、酶的含量及活性；要将新的基因转入，首先得将“原配”基因从受体植株的细胞核和它的叶绿体基因组中给敲除掉。然后导入目的基因，等待它们将老片段“替换”掉了之后，用专门的培养基筛选出只含有这种叶绿体的细胞，再通过组织培养最终获得R酶活性很高的转基因植株。
【详解】（1）地球上生物生命活动所需的能量来自有机物，有机物主要来自植物的光合作用，光合作用合成有机物需要光反应吸收光能，转化为ATP的化学能，然后ATP为暗反应中C3的还原提供能量，合成糖类。在暗反应中，RuBP 羧化酶（R酶）催化CO2与RuBP（C5）结合，生成2分子C3，这是光合作用的暗反应的二氧化碳的固定。暗反应的进行需要相关酶的催化，二氧化碳做原料，需要光反应提供[H]和ATP，光反应需要色素、酶、水、光照等，故影响该反应的外部因素有光照、温度、CO2浓度、水、无机盐等；内部因素包括色素含量及种类、酶的含量及活性等。
（2）高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因通过转录成mRNA ，mRNA 进入细胞质基质，与核糖体结合，合成为S蛋白；因R酶是催化CO2与C5结合的，在叶绿体基质中进行，故S蛋白要进入叶绿体，在叶绿体的基质中与L组装成有功能的酶。
（3）①据题设条件可知，将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，只去除甲的L基因，没有去除甲的S基因。因此，转基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除转基因植株中R酶是由蓝藻的L蛋白和甲的S蛋白共同组成。故由上述实验不能得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测。
②根据上述实验，可以看出蓝藻的基因能导入到甲的DNA中，说明蓝藻和甲植株都以DNA为遗传物质；蓝藻中 R酶的活性高于高等植物，说明两者都以R酶催化CO2的固定；由于蓝藻S、L基因均转入甲的叶绿体DNA中，且去除了甲的L基因，结果转基因植株合成了R酶，说明蓝藻R酶大亚基蛋白L在甲的叶绿体中合成，以上体现了生物界的统一性。在蓝藻中R酶组装是在细胞质基质，甲的叶肉细胞组装R酶是在叶绿体基质，则说明了不同生物之间具有差异性。因此，选abc。
【点睛】解答本题关键抓住“将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。”这一条件，得知甲的S基因还在，可以合成S蛋白，推知转基因植株中有活性的R酶并不完全是由蓝藻的S、L组装而成。
32．（2019天津卷·9）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中 （单选）。
A．含B基因的染色体缺失
B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变
D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或 中提取总RNA，构建 文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3） 在过程①、②转化筛选时，过程 中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程 在培养基中应加入卡那霉素。
（4） 获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是 （多选）。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明 。
【答案】（1）D
（2）精子 cDNA
（3）② ①
（4）BCD
（5）B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
【解析】
【分析】基因工程的基本操作程序：
1、目的基因的获取：（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建:（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。（3）基因表达载体的构建过程：
3、将目的基因导入受体细胞:（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
【详解】（1）通过题干信息可知，B基因可以在体细胞和精子中，说明含B基因的染色体未缺失，也没有发生基因突变，AC错误；基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶，不是DNA聚合酶，B错误；B基因在卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D正确；故选D。
（2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA，从而构建CDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。
（3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程②表示将筛选出含有重组质粒的农杆菌，将其T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上。
（4）获得转基因植株，鉴定筛选方式有：①DNA分子杂交技术，即以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交，故A错误；B正确；②用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，即以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交，C正确；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，通过（2）可知B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因，即可通过Luc基因表达，检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，D正确；故选BCD。
（5）当从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含有一个染色体组，推断该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
【点睛】本题考查了基因工程的相关知识，要求考生能够识记基因工程的操作步骤；明确农杆菌转化法在植物基因工程中的应用；并能够掌握植物组织培养技术的过程等知识。
33．（2019江苏卷·29）利用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。下图为基因编辑猪培育流程，请回答下列问题：
（1）对1号猪使用_________处理，使其超数排卵，收集并选取处在__________时期的卵母细胞用于核移植。
（2）采集2号猪的组织块，用__________处理获得分散的成纤维细胞，放置于37 ℃的CO2培养箱中培养，其中CO2的作用是________。
（3）为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行__________。产出的基因编辑猪的性染色体来自于_________号猪。
（4）为检测病毒外壳蛋白基因是否被导入4号猪并正常表达，可采用的方法有__________（填序号）。
①DNA测序 ②染色体倍性分析
③体细胞结构分析 ④抗原—抗体杂交
【答案】（1）促性腺激素 减数第二次分裂中期
（2）胰蛋白酶（胶原蛋白酶） 维持培养液的pH
（3）分割 2
（4）①④
【解析】
【分析】据图分析，图示基因编辑猪培育过程涉及的技术手段有转基因技术、核移植技术、早期胚胎培养技术和胚胎移植技术等，利用转基因技术将病毒外壳蛋白基因（目的基因）导入2号猪的体细胞核中，然后将2号猪的体细胞核移植到1号猪的去核卵母细胞中，再将重组细胞培养到囊胚并移植到3号猪的子宫中去，最后分娩产生了4号转基因克隆猪。
【详解】（1）据图分析可知，1号猪提供的是卵母细胞，对其注射促性腺激素可使其超数排卵，获得的卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期才能进行核移植。
（2）将2号猪的组织块分散成单个的成纤维细胞需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，该细胞的培养应在37℃含5%的CO2的恒温培养箱中进行，其中CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（3）利用胚胎分割技术对图示早期胚胎进行分割，可以获得更多的基因编辑猪；据图分析可知，核移植的细胞核来自于2号猪，因此产出的基因编辑猪的性染色体来自于2号猪。
（4）检测病毒外壳蛋白基因（目的基因）是否导入4号猪，可以采用DNA分子杂交法检测目的基因的序列；目的基因表达的最终产物是蛋白质（病毒外壳蛋白），可以利用抗原-抗体杂交法进行检测，故选①④。
【点睛】解答本题的关键是掌握转基因技术、动物细胞培养、胚胎移植等过程，能够弄清楚题图中不同的猪提供的结构和作用，明确核移植时的卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期，并能够选择正确的方法检测目的基因是否表达。
34．（2019江苏卷·31）（8分）图1为T细胞通过表面受体（TCR）识别抗原递呈细胞呈递的肿瘤抗原后被激活，进而攻击肿瘤细胞的示意图。图2为肿瘤细胞的一种免疫逃逸机制示意图。肿瘤细胞大量表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞活化，逃避T细胞的攻击。请回答下列问题：
（1）图1中抗原递呈细胞通过_________方式摄取肿瘤抗原。
（2）图1中T细胞识别肿瘤抗原后被激活，增殖并__________形成效应T细胞群和__________细胞群。
（3）图1中效应T细胞通过TCR只能识别带有同样抗原的肿瘤细胞，故发挥的免疫作用具有_________性，效应T细胞分泌毒素，使肿瘤细胞__________死亡。
（4）为阻断图2中肿瘤细胞的免疫逃逸通路，利用单克隆抗体制备技术，制备了抗PD-L1抗体。该抗体注入体内后通过__________传送与__________结合，可解除T细胞的活化抑制。
（5）为应用于肿瘤的临床免疫治疗，需对该抗体进行人源化改造，除抗原结合区域外，其他部分都替换为人抗体区段，目的是__________。
【答案】（1）胞吞
（2）分化 记忆
（3）特异 裂解
（4）体液 肿瘤细胞表面的PD-L1
（5）降低免疫排斥
【解析】
【分析】由图1可知，TCR是T细胞表面的特异性受体，可以识别肿瘤抗原。TCR识别吞噬细胞处理呈递的肿瘤抗原后，可以增殖分化出记忆T细胞和效应T细胞，效应T细胞可以识别并攻击肿瘤细胞，引起肿瘤细胞的裂解死亡。
由图2可知，肿瘤细胞表面的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1蛋白特异性结合，抑制T细胞增殖分化，从而逃避免疫系统的攻击。
【详解】（1）抗原属于大分子物质，抗原呈递细胞通过胞吞摄取肿瘤抗原，处理后呈递给T细胞，引起T细胞的增殖分化。
（2）图1中，T细胞表面的TCR识别肿瘤抗原后，可以增殖分化出记忆T细胞和效应T细胞。其中的效应T细胞会攻击肿瘤细胞，引起其裂解死亡。
（3）效应T细胞通过TCR特异性识别携带同种肿瘤抗原的肿瘤细胞，该过程具有特异性。由图可知，效应T细胞可以分泌毒素，引起肿瘤细胞的裂解死亡。
（4）由图2可知，肿瘤细胞表面的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1蛋白特异性结合，抑制T细胞增殖分化，从而逃避免疫系统的攻击，故可以通过注射抗PD-L1抗体阻断肿瘤细胞的逃逸通路。抗PD-L1抗体进入人体后，通过体液运输与肿瘤细胞表面的PD-1蛋白结合，从而接触T细胞的活化抑制。
（5）由于单克隆抗体是利用鼠的骨髓瘤细胞与浆细胞融合的杂交瘤细胞分泌产生，对人来说是异物，为了降低免疫排斥，需要对单克隆抗体进行改造，出抗原结合区域外，其他部分都替换成人抗体区段。
【点睛】由图分析可知，肿瘤细胞的一种免疫逃逸机制即通过肿瘤细胞表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1蛋白特异性结合，抑制T细胞增殖分化，从而逃避T细胞的攻击，故可以用抗PD-L1蛋白或抗PD-1蛋白的抗体进行治疗。
35．（2019江苏卷·33）（8分）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________未端。
（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。
菌落类型平板类型
A
B
C
无抗生素
﹢
﹢
﹢
氨苄青霉素
﹢
﹢
﹣
四环素
﹢
﹣
﹣
氨苄青霉素+四环素
﹢
﹣
﹣
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_______________。
【答案】（1）平
（2）胸腺嘧啶（T） DNA连接
（3）B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒
（4）乙丙 目的基因反向连接
【解析】
【分析】基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后悔破坏了四环素抗性基因（tetr）。
【详解】（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）据图分析，目的基因两侧为粘性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要个加一个碱基T形成具有粘性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
【点睛】解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤，尤其是对核心步骤—构建基因表达载体步骤的理解，明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用，进而结合题干要求分析答题。
36．（2019浙江4月选考·32）回答下列（二）小题：
（二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
（1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______技术获得特异性探针，并将______中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。
（2）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测______（A．质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物）。
（3）植物细胞在培养过程中往往会发生______，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
（4）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是______。
【答案】（二）（1）单克隆抗体 基因文库
（2）B
（3）变异 高浓度致病真菌 花粉离体
（4）胚的离体培养
【解析】
【分析】（二）目的基因表达产物在分子水平的检测包括DNA分子杂交、DNA-RNA分子杂交和抗原抗体杂交；生物变异在生产上应用时，可通过杂交育种、单倍体育种的方式获得稳定遗传的植株，单倍体育种的速度更快，相对的操作更加复杂。
【详解】（二）（1）抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因；
（2）质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A选项错误；转录产物为RNA，可以通过DNA-RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B选项正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C选项错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D选项错误；故正确的选项选择B；
（3）抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选；
（4）要利用胚的发育获得植株，可利用胚细胞的全能性，采用胚的离体培养获得植株。
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