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第02章 细胞生物学研究方法课件PPT
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这是一份第02章 细胞生物学研究方法课件PPT，共60页。PPT课件主要包含了本章主要内容，细胞培养与细胞工程，第一节，第二节，第三节，第四节，第五节等内容，欢迎下载使用。
细胞形态结构的观察方法
细胞及其组分的分析方法
细胞及生物大分子的动态变化
模式生物与功能基因组的研究
病毒 20-300 nm支原体 0.1-0.3 µm细菌 0.5-5.0 µm动植物细胞 20-30 µm活细胞多是无色透明的
肉眼 0.2 mm光学显微镜 0.2 µm电子显微镜 0.2 nm扫描隧道显微镜样品制备技术
图2-1 几种显微镜可观察的样品大小（箭头之间的范围）及其分辨能力（右侧箭头所指位置）
一、光学显微镜 (light micrscpe)
从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具
目镜 2. 准焦螺旋 3. 物镜4. 载物台 5. 反光镜
※ 组成部分？成像原理？※ 样品制备？
（一）普通复式光学显微镜——组成
由3部分组成：光学放大系统（目镜与物镜） 照明系统（光源和聚光镜）镜架及样品调节系统
图2-2 普通光学显微镜成像示意图
（一）普通复式光学显微镜——分辨率
分辨率（reslutin）：显微镜最重要的性能参数分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率 0.2 µm
图2-3 决定光学显微镜的分辨率的要素物镜的镜口角（α ）、入射光的波长（λ ）以及介质的折射率（N ）
分辨率(reslutin)：显微镜的最重要性能参数
数值孔径又叫做镜口率，英文全称Numerical Aperture，简写为 NA
从（a）到（b）的转换为观察者提供了更高的放大倍数和分辨率，而从（b）到（c）的转换只提供了更高的放大倍数（空放大），而图像的质量实际上随着空放大倍数的增加而变差。
物镜与照明系统位置倒过来
（一）普通复式光学显微镜——倒置显微镜
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
图2-4 石蜡切片的制备程序（A）及其显微图片（B）B为蛔虫子宫上皮细胞的H-E 染色图片
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察A. 当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加，亮度增强B. 当两束光的相位相反时，就会相互抵消导致光波的振幅降低，亮度变暗
图2-5 两束光波之间的相互干涉
相差显微镜（phase-cntrast micrscpe）是在普通光学显微镜的基础上，添加 “环状光阑”和 “相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差（观察活细胞显微结构细节）
图2-6 两种不同类型的光学显微镜所拍摄的图像比较体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
The Nbel Prize in Physics 1953
"fr his demnstratin f the phase cntrast methd, especially fr his inventin f the phase cntrast micrscpe."
微分干涉显微镜（differential-interference micrscpe），又称Nmarski 相差显微镜，以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜将这两束光汇合，从而使使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别（更适于研究活细胞）分辨率比普通光镜提高了一个数量级录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程
Beam path in differential interference micrscpy
聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍
(A)明场显微镜（通过光在细胞中的简单透射而获得的培养成纤维细胞的图像） (B)相差显微镜 (C)微分干涉显微镜 (D) 暗视野显微镜
用不同类型的光学显微镜观察细胞的比较
荧光显微镜（flurescence micrscpe）是在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具荧光：某些物质经紫外光照射后，能发出可见的光线。可分为自发荧光和诱发荧光。分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)
（三）荧光显微镜——基本原理
图2-7 荧光显微镜的基本原理及其应用B. 不同荧光素所需激发光波长与所产生的荧光波长的比较
分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态S0 (electrnic grund state ) 的最低振动能级吸收光能以后，它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级。这一过程发生在10-15s时间内被激发的分子，首先释放能量回到S1的最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级，并以光子的形式释放能量，即发射荧光
光源和光学系统与普通光学显微镜不同核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成
图2-7 荧光显微镜的基本原理及其应用荧光显微镜的工作原理与光路示意图
免疫荧光技术荧光素直接标记技术绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达
（三）荧光显微镜——样品制备技术
GFP as a reprter. GFP gene was jined t a fly prmter that is active nly in neurn.
“照亮细胞”的绿色荧光蛋白 green flurescent prtein
The Nbel Prize in Chemistry 2008
"fr the discvery and develpment f the green flurescent prtein, GFP"
（三）荧光显微镜——应用
在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位
laser scanning cnfcal micrscpe，LSCM，简称共焦显微镜以激光为光源共焦：聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像分辨率比普通荧光显微镜提高1.4-1.7 倍
（四）激光扫描共焦显微镜
图2-8 激光扫描共焦显微镜的原理图激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点；从焦点发射的荧光（样品一般经免疫荧光标记）经透镜汇聚成像，被检测器检出；样品其他部位发射的荧光不会聚焦成像，因而检测器不能检出
可通过“光学切片” 叠加后重构出样品的三维结构
Figure 9-20 Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）
图2-9 荧光显微镜（A）和激光扫描共焦显微镜（B）所观察图像的比较图中显示小鼠肾小球的厚切片（厚度20μm）中，用不同的标记方法和不同的荧光染料，分别显示其凝集素（绿色），微丝（红色）和细胞核（蓝色）的分布。激光扫描共焦显微镜所获得的图像更为清晰
（五）超高分辨率显微术
如何突破光学显微镜的分辨率极限
Abbe’s diffractin limit：19世纪末，恩斯特·阿贝将光学显微镜的极限定义为大约是可见光波长的一半，即大约0.2微米。这意味着科学家们可以分辨单个细胞，以及细胞的一些组成部分，称为细胞器。然而他们无法用这样的显微镜分辨尺寸更小的物体，例如普通尺寸的病毒，或者单个的蛋白质
The Nbel Prize in Chemistry 2014
"fr the develpment f super-reslved flurescence micrscpy."
1. 全内反射荧光显微术（ttal internal reflectin flurescent micrscpe，TIRFM）
原理：当光线从光密介质进入光疏介质时，一部分光会发生折射，而另一部分光线会发生反射。并且，当入射角的角度增大时，折射角也随之增大。当折射角的角度达到90 度时，就会发生全反射现象。此时，光线会在介质的另一面产生隐失波。隐失波的能量范围通常在200 nm 以内，且在Z 轴上呈现指数衰减，因此可以激发很薄一层（～100 nm）样品内特定的荧光分子发光，这样就大大降低了背景噪声的干扰，提高图像分辨率
图2-10 全内反射示意图n1和n 2 分别为玻璃和液体的折射率，θ 1 和θ 2 分别为入射角和折射角
2. 基于单分子成像技术的PALM/STORM 方法
光激活定位显微技术（phtactivated lcalizatin micrscpy，PALM）随机光学重构显微技术（stchastic ptical recnstructin micrscpy，STORM）
图2-11 基于单分子定位原理的STORM 超分辨成像技术（A）在任一时刻，只有极少数荧光分子被随机激活（左图中绿圈），成像后加以精确定位（绿圈中的黑十字）. 经过多次重复，由大量荧光分子的精确位点，组合成了一幅STORM 图像（右图）。（B）在相同的放大倍数下，细胞中的 微管（绿色）和网格蛋白包被膜泡（红色）在常规荧光显微镜下的图像（左）与STORM 超分辨图像（右）的。（C）三维STORM 超分辨图像。左图显示细胞中的网格蛋白包被小泡。右图为放大图片，分别显示其在 XY 截面（上图）和XZ 截面（下图）的一个网格蛋白包被小泡
3. 4Pi 和STED 显微术
4Pi 显微镜：基于增加物镜的接受角而等效增加物镜的数值孔径（NA）受激发射损耗（stimulated emissin depletin，STED） 显微术
图2-12 常规激光扫描共聚焦显微镜与超高分辨率显微镜观察中心粒蛋白的分布A. 常规的高倍图像。B. STED 图像
4. 结构照明显微术（structured-illuminatin micrscpy，SIM）
将非线性结构照明部件引入传统的显微镜，使显微镜硬件系统增加光栅和控制元件，软件系统可对所获取的图像信息进行计算原理：通过光栅的旋转和移动将多重相互衍射的光束照射到样本上，并在此发生干涉，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨信息，生成一幅完整的图像
图2-13 动物细胞表面的纤毛的免疫荧光标记图像用抗乙酰化微蛋白的抗体标记纤毛，经荧光标记的二抗染色后用普通激光扫描共聚焦（左）或基于结构照明法（SIM）的超高分辨率显微镜（右）观察得到的图像。右边的图像显示位于纤毛基体（母中心粒）附近的子中心粒中间的由九组三联体微管围成的空隙
二、电子显微镜（electrn micrscpe，EM，简称电镜）
透射电镜 transmissin electrn micrscpe, TEM
扫描电镜 scanning electrn micrscpe, SEM
The Nbel Prize in Physics 1986
电子束作为光源电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像通过荧光屏或感光胶片记录
（一）电子显微镜的基本知识
1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别
Figure 9-42 (part 1 f 2) Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
表2-1 电子显微镜与普通光学显微镜的基本区别
2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数
电子显微镜分辨率可达0.2 nm电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率；其实际分辨率常常受到生物制样技术本身的限制
3．电子显微镜的基本构造
电子束照明系统成像系统真空系统记录系统
图2-14 电子显微镜的基本结构（A）和成像原理（B）
（二）主要电镜制样技术
1．超薄切片技术（ultra thin sectin）
图2-15 电镜超薄切片样本制备示意图
超薄切片技术显示的细胞超微结构
应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构超薄切片技术还可与放射同位素自显影、细胞化学、免疫化学和原位杂交等技术结合，在超微结构水平上完成蛋白质与核酸等组分定性、定位和半定量研究
Figure 9-45 Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
图2-16 超薄切片技术显示的动物细胞超微结构
观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染）分辨率可达1.5 nm 左右
2．负染色技术（negative staining）
图2-17流感病毒负染色电镜照片
透射电镜制样技术——负染色技术
包括冰冻断裂与蚀刻复型两步观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感样品不需固定包埋
3．冷冻蚀刻技术（freeze etching）
图2-18 冷冻蚀刻技术示意图A. 样品制备流程图。B. 牛肾原代细胞的冷冻蚀刻电镜图片，显示双层核膜（如箭头所示）、核孔复合体结构（如三角所示）以及线粒体（Mi）和细胞质中的囊泡等结构
Figure . Preparatin f a metal-shadwed replica f the surface f a specimen. Nte that the thickness f the metal reflects the surface cnturs f the riginal specimen.
电镜三维重构技术低温电镜技术（cry-electrn micrscpy）电子断层成像技术（electrn tmgraphy）扫描电镜背散射电子成像（Back scattered Electrn Imaging）技术
4．电镜三维重构与低温电镜技术
图2-19 电子扫描断层技术显示的细胞内膜及膜泡运输系统的三维图像（A）及超薄切片显示的同一区域的一张二维图像（B）
扫描电镜背散射电子成像（Back scattered Electrn Imaging）技术
图2-20 利用扫描电镜背散射电子成像，获得的细胞断面超微结构图像细胞中的细胞核、线粒体、高尔基体等细胞器清晰可见。其分辨率接近透射电镜超薄切片图像
The Nbel Prize in Chemistry 2017
"fr develping cry-electrn micrscpy fr the high-reslutin structure determinatin f bimlecules in slutin."
利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，得到样品表面的立体形貌
5．扫描电镜技术（scanning electrn micrscpe，SEM）
图2-21 扫描电镜原理示意图（A），扫描电镜下可清晰地显示原生动物四膜虫表面的纤毛和口器（B）
样品利用CO2 临界点干燥法处理样品观察前喷镀一层金膜分辨本领一般仅为3 nm
Figure 9-49 (part 1 f 2) Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较
注意样品制备技术的差异！
三、扫描隧道显微镜（scanning tunnel micrscpe，STM）
探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中的隧道效应具有原子尺度的高分辨本领 可以在真空、大气、液体等多种条件下工作非破坏性测量
用超离心技术分离细胞组分
特异蛋白抗原的定位与定性
细胞内特异核酸的定位与定性
细胞成份的分析与细胞分选技术
一、用超离心技术分离细胞组分
差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开
图2-22 用差速离心法分离细胞匀浆中的各种细胞组分图中显示，随着离心力（g ）大小和离心时间的不同，各种细胞组分沉淀在不同的离心管中
密度梯度离心：将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面，通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带可分为速度沉降和等密度沉降
图2-23 用密度梯度离心分离细胞组分示意图
二、特异蛋白抗原的定位与定性
细胞内特异蛋白的显示可通过抗原-抗体特异结合的方法得以实现免疫荧光与免疫电镜是最常见的研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术免疫印迹（Western bltting）、放射免疫沉淀（radiimmun-precipitatin）和蛋白质芯片、质谱分析等技术可对蛋白质组分进行体外分析定性
直接免疫荧光技术（A）：将荧光分子与抗体偶联后直接用于免疫标记技术间接免疫荧光技术（B）：先将抗体（称第一抗体）与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体（称第二抗体）
图2-24 直接免疫荧光标记与间接免疫荧光标记技术
在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位可分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术与免疫胶体金技术，其主要区别是与抗体结合的标志物不同免疫胶体金技术受到越来越多的青睐
图2-25 免疫胶体金电镜技术的基本原理与应用A. 免疫胶体金标记技术原理的示意图：细菌蛋白A 可与胶体金结合，也可以与抗体（如IgG）的Fc 端特异结合。B. 免疫胶体金标记显示膀胱上皮细胞膜蛋白的分布（箭头所指）
三、细胞内特异核酸的定位与定性
原位杂交（in situ hybridizatin）：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置
Flurescence in Situ Hybridizatin
光镜水平同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合
图2-26 用原位杂交技术显示Z13 基因在受精后1 d 的斑马鱼胚胎的体节、眼和松果体中的表达（箭头所指）
Telmere flurescence in situ hybridizatin (T-FISH)
四、细胞成份的分析与细胞分选技术
流式细胞术（flw cytmetry）：可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA 或某一特异标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，还可将某一特异染色的细胞从细胞群体中分离出来，以及将DNA 含量不同的中期染色体分离出来，甚至用于细胞分选
图2-27 流式细胞仪的工作原理A. 流式细胞仪分选原理示意图。B. 显示流式细胞仪分析处在不同时相的HeLa 细胞的实验结果
一、细胞培养——动物细胞培养
分为原代细胞和传代细胞细胞系：有限细胞系和连续细胞系细胞株：基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞贴壁培养和悬浮培养
图2-28 体外培养的细胞A. 长满单导的牛肾原代细胞。B. 正在生长分裂的HeLa 细胞。C. 长满单层的CHO 原代细胞
单倍体细胞培养：主要用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株
原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株
（一）细胞融合与单克隆抗体技术
细胞融合灭活的病毒化学物质（如PEG）电融合同核体（hmkaryn）异核体（heterkaryn）合核体（synkaryn）
单克隆抗体与多克隆抗体
The Nbel Prize in Physilgy r Medicine 1984
"fr theries cncerning the specificity in develpment and cntrl f the immune system and the discvery f the principle fr prductin f mnclnal antibdies."
图2-29 单克隆抗体制备过程示意图
（二）显微操作技术与动物的克隆
细胞拆合：胞质体（cytplast）和核体（karyplast）物理法：机械法或短波光化学法：细胞松弛素显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等
图2-30 应用显微注射技术进行细胞核移植
一、荧光漂白恢复技术（flurescence phtbleaching recvery，FPR）
亲脂性或亲水性荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率
图2-31 荧光漂白恢复技术原理示意图
flurescence phtbleaching recvery， FPR
Figure 10-36a Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
细胞骨架的FRAP研究
在表达GFP微管蛋白的间期（非分裂）细胞上进行的FRAP实验的显微照片。在实验过程中对细胞进行成像。两个并排的细胞被激光漂白，然后随着时间的推移，漂白区的荧光信号逐渐恢复。
荧光漂白损失技术 Flurescence lss in phtbleaching, FLIP
二、酵母双杂交技术（yeast tw-hybrid system）
在体内分析蛋白质－蛋白质相互作用利用转录激活因子的DNA 结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理
图2-32 用于检测蛋白质- 蛋白质互作的酵母双杂交技术原理示意图
三、荧光共振能量转移技术（flurescence resnance energy transfer，FRET）
检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光
图2-33 荧光共振能量转移原理图A. 携带CFP 的供体蛋白与携带YFP 的受体蛋白分子之间的距离大于10 nm 时，在一定波长的紫外激发光（430 nm）的照射下，只有供体蛋白中的CFP 被激发，放出波长为490 nm 的 蓝色荧光，而受体中的YFP 不会被激发出黄色荧光。B. 如果这两个蛋白质之间的距离在1～10 nm 的范围内，供体蛋白中CFP 发出的蓝色荧光可以被受体蛋白中的YFP 所吸收，并激发YFP 发出波长为530 nm 的黄色荧光
D、A都能发荧光D的发射光谱和A的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠D和A之间的距离必须小于10nm
利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr 或 AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示
对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记显微放射自显影电镜放射自显影
根据实验要求选择合适的同位素
研究DNA 合成时通常用氚（3H）标记的3H-TdR研究RNA 合成用3H-U在研究含硫蛋白分子代谢时，用 35S 标记的蛋氨酸和半胱氨酸
表2-3 常用放射性同位素的基本特点
图2-34 电镜放射自显影图片鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞24 h 后，用3H- 尿嘧啶核苷脉冲标记10 min 的电镜放射自显影图片，显示RNA 在细胞内合成的部位。SG： 银颗粒；N： 细胞核；Nu: 核仁
胰岛B细胞电镜放射自显影结果
3H-亮氨酸脉冲标记完成10分钟后，被标记的胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中3H-亮氨酸脉冲标记完成45分钟后，被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内
一、细胞生物学研究常用的模式生物
模式生物通常个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物
为什么我们需要模式生物？
所有的细胞都是从一个共同的祖先遗传下来的研究生物学问题的简单系统将结果外推到高等生物在模式生物中发现的有利特征易受基因控制的模式快速繁殖探究生命本质研究细胞谱系…
功能基因组学技术研究植物信号通路的信息流示意图
细胞形态结构的观察方法
细胞及其组分的分析方法
细胞及生物大分子的动态变化
模式生物与功能基因组的研究
病毒 20-300 nm支原体 0.1-0.3 µm细菌 0.5-5.0 µm动植物细胞 20-30 µm活细胞多是无色透明的
肉眼 0.2 mm光学显微镜 0.2 µm电子显微镜 0.2 nm扫描隧道显微镜样品制备技术
图2-1 几种显微镜可观察的样品大小（箭头之间的范围）及其分辨能力（右侧箭头所指位置）
一、光学显微镜 (light micrscpe)
从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具
目镜 2. 准焦螺旋 3. 物镜4. 载物台 5. 反光镜
※ 组成部分？成像原理？※ 样品制备？
（一）普通复式光学显微镜——组成
由3部分组成：光学放大系统（目镜与物镜） 照明系统（光源和聚光镜）镜架及样品调节系统
图2-2 普通光学显微镜成像示意图
（一）普通复式光学显微镜——分辨率
分辨率（reslutin）：显微镜最重要的性能参数分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率 0.2 µm
图2-3 决定光学显微镜的分辨率的要素物镜的镜口角（α ）、入射光的波长（λ ）以及介质的折射率（N ）
分辨率(reslutin)：显微镜的最重要性能参数
数值孔径又叫做镜口率，英文全称Numerical Aperture，简写为 NA
从（a）到（b）的转换为观察者提供了更高的放大倍数和分辨率，而从（b）到（c）的转换只提供了更高的放大倍数（空放大），而图像的质量实际上随着空放大倍数的增加而变差。
物镜与照明系统位置倒过来
（一）普通复式光学显微镜——倒置显微镜
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
图2-4 石蜡切片的制备程序（A）及其显微图片（B）B为蛔虫子宫上皮细胞的H-E 染色图片
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察A. 当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加，亮度增强B. 当两束光的相位相反时，就会相互抵消导致光波的振幅降低，亮度变暗
图2-5 两束光波之间的相互干涉
相差显微镜（phase-cntrast micrscpe）是在普通光学显微镜的基础上，添加 “环状光阑”和 “相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差（观察活细胞显微结构细节）
图2-6 两种不同类型的光学显微镜所拍摄的图像比较体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
The Nbel Prize in Physics 1953
"fr his demnstratin f the phase cntrast methd, especially fr his inventin f the phase cntrast micrscpe."
微分干涉显微镜（differential-interference micrscpe），又称Nmarski 相差显微镜，以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜将这两束光汇合，从而使使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别（更适于研究活细胞）分辨率比普通光镜提高了一个数量级录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程
Beam path in differential interference micrscpy
聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍
(A)明场显微镜（通过光在细胞中的简单透射而获得的培养成纤维细胞的图像） (B)相差显微镜 (C)微分干涉显微镜 (D) 暗视野显微镜
用不同类型的光学显微镜观察细胞的比较
荧光显微镜（flurescence micrscpe）是在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具荧光：某些物质经紫外光照射后，能发出可见的光线。可分为自发荧光和诱发荧光。分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)
（三）荧光显微镜——基本原理
图2-7 荧光显微镜的基本原理及其应用B. 不同荧光素所需激发光波长与所产生的荧光波长的比较
分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态S0 (electrnic grund state ) 的最低振动能级吸收光能以后，它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级。这一过程发生在10-15s时间内被激发的分子，首先释放能量回到S1的最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级，并以光子的形式释放能量，即发射荧光
光源和光学系统与普通光学显微镜不同核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成
图2-7 荧光显微镜的基本原理及其应用荧光显微镜的工作原理与光路示意图
免疫荧光技术荧光素直接标记技术绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达
（三）荧光显微镜——样品制备技术
GFP as a reprter. GFP gene was jined t a fly prmter that is active nly in neurn.
“照亮细胞”的绿色荧光蛋白 green flurescent prtein
The Nbel Prize in Chemistry 2008
"fr the discvery and develpment f the green flurescent prtein, GFP"
（三）荧光显微镜——应用
在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位
laser scanning cnfcal micrscpe，LSCM，简称共焦显微镜以激光为光源共焦：聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像分辨率比普通荧光显微镜提高1.4-1.7 倍
（四）激光扫描共焦显微镜
图2-8 激光扫描共焦显微镜的原理图激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点；从焦点发射的荧光（样品一般经免疫荧光标记）经透镜汇聚成像，被检测器检出；样品其他部位发射的荧光不会聚焦成像，因而检测器不能检出
可通过“光学切片” 叠加后重构出样品的三维结构
Figure 9-20 Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）
图2-9 荧光显微镜（A）和激光扫描共焦显微镜（B）所观察图像的比较图中显示小鼠肾小球的厚切片（厚度20μm）中，用不同的标记方法和不同的荧光染料，分别显示其凝集素（绿色），微丝（红色）和细胞核（蓝色）的分布。激光扫描共焦显微镜所获得的图像更为清晰
（五）超高分辨率显微术
如何突破光学显微镜的分辨率极限
Abbe’s diffractin limit：19世纪末，恩斯特·阿贝将光学显微镜的极限定义为大约是可见光波长的一半，即大约0.2微米。这意味着科学家们可以分辨单个细胞，以及细胞的一些组成部分，称为细胞器。然而他们无法用这样的显微镜分辨尺寸更小的物体，例如普通尺寸的病毒，或者单个的蛋白质
The Nbel Prize in Chemistry 2014
"fr the develpment f super-reslved flurescence micrscpy."
1. 全内反射荧光显微术（ttal internal reflectin flurescent micrscpe，TIRFM）
原理：当光线从光密介质进入光疏介质时，一部分光会发生折射，而另一部分光线会发生反射。并且，当入射角的角度增大时，折射角也随之增大。当折射角的角度达到90 度时，就会发生全反射现象。此时，光线会在介质的另一面产生隐失波。隐失波的能量范围通常在200 nm 以内，且在Z 轴上呈现指数衰减，因此可以激发很薄一层（～100 nm）样品内特定的荧光分子发光，这样就大大降低了背景噪声的干扰，提高图像分辨率
图2-10 全内反射示意图n1和n 2 分别为玻璃和液体的折射率，θ 1 和θ 2 分别为入射角和折射角
2. 基于单分子成像技术的PALM/STORM 方法
光激活定位显微技术（phtactivated lcalizatin micrscpy，PALM）随机光学重构显微技术（stchastic ptical recnstructin micrscpy，STORM）
图2-11 基于单分子定位原理的STORM 超分辨成像技术（A）在任一时刻，只有极少数荧光分子被随机激活（左图中绿圈），成像后加以精确定位（绿圈中的黑十字）. 经过多次重复，由大量荧光分子的精确位点，组合成了一幅STORM 图像（右图）。（B）在相同的放大倍数下，细胞中的 微管（绿色）和网格蛋白包被膜泡（红色）在常规荧光显微镜下的图像（左）与STORM 超分辨图像（右）的。（C）三维STORM 超分辨图像。左图显示细胞中的网格蛋白包被小泡。右图为放大图片，分别显示其在 XY 截面（上图）和XZ 截面（下图）的一个网格蛋白包被小泡
3. 4Pi 和STED 显微术
4Pi 显微镜：基于增加物镜的接受角而等效增加物镜的数值孔径（NA）受激发射损耗（stimulated emissin depletin，STED） 显微术
图2-12 常规激光扫描共聚焦显微镜与超高分辨率显微镜观察中心粒蛋白的分布A. 常规的高倍图像。B. STED 图像
4. 结构照明显微术（structured-illuminatin micrscpy，SIM）
将非线性结构照明部件引入传统的显微镜，使显微镜硬件系统增加光栅和控制元件，软件系统可对所获取的图像信息进行计算原理：通过光栅的旋转和移动将多重相互衍射的光束照射到样本上，并在此发生干涉，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨信息，生成一幅完整的图像
图2-13 动物细胞表面的纤毛的免疫荧光标记图像用抗乙酰化微蛋白的抗体标记纤毛，经荧光标记的二抗染色后用普通激光扫描共聚焦（左）或基于结构照明法（SIM）的超高分辨率显微镜（右）观察得到的图像。右边的图像显示位于纤毛基体（母中心粒）附近的子中心粒中间的由九组三联体微管围成的空隙
二、电子显微镜（electrn micrscpe，EM，简称电镜）
透射电镜 transmissin electrn micrscpe, TEM
扫描电镜 scanning electrn micrscpe, SEM
The Nbel Prize in Physics 1986
电子束作为光源电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像通过荧光屏或感光胶片记录
（一）电子显微镜的基本知识
1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别
Figure 9-42 (part 1 f 2) Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
表2-1 电子显微镜与普通光学显微镜的基本区别
2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数
电子显微镜分辨率可达0.2 nm电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率；其实际分辨率常常受到生物制样技术本身的限制
3．电子显微镜的基本构造
电子束照明系统成像系统真空系统记录系统
图2-14 电子显微镜的基本结构（A）和成像原理（B）
（二）主要电镜制样技术
1．超薄切片技术（ultra thin sectin）
图2-15 电镜超薄切片样本制备示意图
超薄切片技术显示的细胞超微结构
应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构超薄切片技术还可与放射同位素自显影、细胞化学、免疫化学和原位杂交等技术结合，在超微结构水平上完成蛋白质与核酸等组分定性、定位和半定量研究
Figure 9-45 Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
图2-16 超薄切片技术显示的动物细胞超微结构
观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染）分辨率可达1.5 nm 左右
2．负染色技术（negative staining）
图2-17流感病毒负染色电镜照片
透射电镜制样技术——负染色技术
包括冰冻断裂与蚀刻复型两步观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感样品不需固定包埋
3．冷冻蚀刻技术（freeze etching）
图2-18 冷冻蚀刻技术示意图A. 样品制备流程图。B. 牛肾原代细胞的冷冻蚀刻电镜图片，显示双层核膜（如箭头所示）、核孔复合体结构（如三角所示）以及线粒体（Mi）和细胞质中的囊泡等结构
Figure . Preparatin f a metal-shadwed replica f the surface f a specimen. Nte that the thickness f the metal reflects the surface cnturs f the riginal specimen.
电镜三维重构技术低温电镜技术（cry-electrn micrscpy）电子断层成像技术（electrn tmgraphy）扫描电镜背散射电子成像（Back scattered Electrn Imaging）技术
4．电镜三维重构与低温电镜技术
图2-19 电子扫描断层技术显示的细胞内膜及膜泡运输系统的三维图像（A）及超薄切片显示的同一区域的一张二维图像（B）
扫描电镜背散射电子成像（Back scattered Electrn Imaging）技术
图2-20 利用扫描电镜背散射电子成像，获得的细胞断面超微结构图像细胞中的细胞核、线粒体、高尔基体等细胞器清晰可见。其分辨率接近透射电镜超薄切片图像
The Nbel Prize in Chemistry 2017
"fr develping cry-electrn micrscpy fr the high-reslutin structure determinatin f bimlecules in slutin."
利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，得到样品表面的立体形貌
5．扫描电镜技术（scanning electrn micrscpe，SEM）
图2-21 扫描电镜原理示意图（A），扫描电镜下可清晰地显示原生动物四膜虫表面的纤毛和口器（B）
样品利用CO2 临界点干燥法处理样品观察前喷镀一层金膜分辨本领一般仅为3 nm
Figure 9-49 (part 1 f 2) Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较
注意样品制备技术的差异！
三、扫描隧道显微镜（scanning tunnel micrscpe，STM）
探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中的隧道效应具有原子尺度的高分辨本领 可以在真空、大气、液体等多种条件下工作非破坏性测量
用超离心技术分离细胞组分
特异蛋白抗原的定位与定性
细胞内特异核酸的定位与定性
细胞成份的分析与细胞分选技术
一、用超离心技术分离细胞组分
差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开
图2-22 用差速离心法分离细胞匀浆中的各种细胞组分图中显示，随着离心力（g ）大小和离心时间的不同，各种细胞组分沉淀在不同的离心管中
密度梯度离心：将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面，通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带可分为速度沉降和等密度沉降
图2-23 用密度梯度离心分离细胞组分示意图
二、特异蛋白抗原的定位与定性
细胞内特异蛋白的显示可通过抗原-抗体特异结合的方法得以实现免疫荧光与免疫电镜是最常见的研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术免疫印迹（Western bltting）、放射免疫沉淀（radiimmun-precipitatin）和蛋白质芯片、质谱分析等技术可对蛋白质组分进行体外分析定性
直接免疫荧光技术（A）：将荧光分子与抗体偶联后直接用于免疫标记技术间接免疫荧光技术（B）：先将抗体（称第一抗体）与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体（称第二抗体）
图2-24 直接免疫荧光标记与间接免疫荧光标记技术
在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位可分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术与免疫胶体金技术，其主要区别是与抗体结合的标志物不同免疫胶体金技术受到越来越多的青睐
图2-25 免疫胶体金电镜技术的基本原理与应用A. 免疫胶体金标记技术原理的示意图：细菌蛋白A 可与胶体金结合，也可以与抗体（如IgG）的Fc 端特异结合。B. 免疫胶体金标记显示膀胱上皮细胞膜蛋白的分布（箭头所指）
三、细胞内特异核酸的定位与定性
原位杂交（in situ hybridizatin）：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置
Flurescence in Situ Hybridizatin
光镜水平同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合
图2-26 用原位杂交技术显示Z13 基因在受精后1 d 的斑马鱼胚胎的体节、眼和松果体中的表达（箭头所指）
Telmere flurescence in situ hybridizatin (T-FISH)
四、细胞成份的分析与细胞分选技术
流式细胞术（flw cytmetry）：可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA 或某一特异标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，还可将某一特异染色的细胞从细胞群体中分离出来，以及将DNA 含量不同的中期染色体分离出来，甚至用于细胞分选
图2-27 流式细胞仪的工作原理A. 流式细胞仪分选原理示意图。B. 显示流式细胞仪分析处在不同时相的HeLa 细胞的实验结果
一、细胞培养——动物细胞培养
分为原代细胞和传代细胞细胞系：有限细胞系和连续细胞系细胞株：基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞贴壁培养和悬浮培养
图2-28 体外培养的细胞A. 长满单导的牛肾原代细胞。B. 正在生长分裂的HeLa 细胞。C. 长满单层的CHO 原代细胞
单倍体细胞培养：主要用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株
原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株
（一）细胞融合与单克隆抗体技术
细胞融合灭活的病毒化学物质（如PEG）电融合同核体（hmkaryn）异核体（heterkaryn）合核体（synkaryn）
单克隆抗体与多克隆抗体
The Nbel Prize in Physilgy r Medicine 1984
"fr theries cncerning the specificity in develpment and cntrl f the immune system and the discvery f the principle fr prductin f mnclnal antibdies."
图2-29 单克隆抗体制备过程示意图
（二）显微操作技术与动物的克隆
细胞拆合：胞质体（cytplast）和核体（karyplast）物理法：机械法或短波光化学法：细胞松弛素显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等
图2-30 应用显微注射技术进行细胞核移植
一、荧光漂白恢复技术（flurescence phtbleaching recvery，FPR）
亲脂性或亲水性荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率
图2-31 荧光漂白恢复技术原理示意图
flurescence phtbleaching recvery， FPR
Figure 10-36a Mlecular Bilgy f the Cell (© Garland Science 2008)
细胞骨架的FRAP研究
在表达GFP微管蛋白的间期（非分裂）细胞上进行的FRAP实验的显微照片。在实验过程中对细胞进行成像。两个并排的细胞被激光漂白，然后随着时间的推移，漂白区的荧光信号逐渐恢复。
荧光漂白损失技术 Flurescence lss in phtbleaching, FLIP
二、酵母双杂交技术（yeast tw-hybrid system）
在体内分析蛋白质－蛋白质相互作用利用转录激活因子的DNA 结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理
图2-32 用于检测蛋白质- 蛋白质互作的酵母双杂交技术原理示意图
三、荧光共振能量转移技术（flurescence resnance energy transfer，FRET）
检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光
图2-33 荧光共振能量转移原理图A. 携带CFP 的供体蛋白与携带YFP 的受体蛋白分子之间的距离大于10 nm 时，在一定波长的紫外激发光（430 nm）的照射下，只有供体蛋白中的CFP 被激发，放出波长为490 nm 的 蓝色荧光，而受体中的YFP 不会被激发出黄色荧光。B. 如果这两个蛋白质之间的距离在1～10 nm 的范围内，供体蛋白中CFP 发出的蓝色荧光可以被受体蛋白中的YFP 所吸收，并激发YFP 发出波长为530 nm 的黄色荧光
D、A都能发荧光D的发射光谱和A的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠D和A之间的距离必须小于10nm
利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr 或 AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示
对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记显微放射自显影电镜放射自显影
根据实验要求选择合适的同位素
研究DNA 合成时通常用氚（3H）标记的3H-TdR研究RNA 合成用3H-U在研究含硫蛋白分子代谢时，用 35S 标记的蛋氨酸和半胱氨酸
表2-3 常用放射性同位素的基本特点
图2-34 电镜放射自显影图片鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞24 h 后，用3H- 尿嘧啶核苷脉冲标记10 min 的电镜放射自显影图片，显示RNA 在细胞内合成的部位。SG： 银颗粒；N： 细胞核；Nu: 核仁
胰岛B细胞电镜放射自显影结果
3H-亮氨酸脉冲标记完成10分钟后，被标记的胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中3H-亮氨酸脉冲标记完成45分钟后，被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内
一、细胞生物学研究常用的模式生物
模式生物通常个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物
为什么我们需要模式生物？
所有的细胞都是从一个共同的祖先遗传下来的研究生物学问题的简单系统将结果外推到高等生物在模式生物中发现的有利特征易受基因控制的模式快速繁殖探究生命本质研究细胞谱系…
功能基因组学技术研究植物信号通路的信息流示意图
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