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人教版 (2019)选择性必修3二 微生物的选择培养和计数学案
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这是一份人教版 (2019)选择性必修3二 微生物的选择培养和计数学案，共17页。学案主要包含了师问导学，智涂笔记，师说核心，检测反馈，网络建构，主干落实等内容，欢迎下载使用。
课程标准
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
2．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
素养达成
1.各类微生物都能适应其生活环境。(生命观念)
2．根据微生物的代谢类型配制选择培养基。(科学思维)
3．讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法。(科学探究)
瞧，细菌和小麦多客气！为什么细菌要感谢小麦而小麦也感谢细菌呢？我们知道，尿素是农业生产中重要的氮肥，农民会经常给农作物使用尿素，但尿素不能直接被农作物吸收，只有被土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被农作物吸收利用。单个细菌是看不见的，我们如何将土壤中分解尿素的细菌请出来，以观尊容呢？
探究点一 选择培养基
【师问导学】
1．如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物？
2．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
3．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？
4．要把某种微生物从众多微生物中筛选出来，就要利用其代谢特点选择合适的培养基。下面是分离土壤中分解尿素的细菌使用的选择培养基配方，请分析回答问题。
(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是____________，提供氮源的是________。
(2)绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能利用________。
(3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？
(4)判断选择培养基是否具有筛选作用，还需同时接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行培养，观察同一稀释度的菌液接种的______________________，进行对比得出结论。
【智涂笔记】
[特别提醒]
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。原则上选择培养基只允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。
【师说核心】
1．选择培养基的选择作用
(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
(2)目的：从众多的微生物中分离所需要的微生物。
(3)三种方法的比较
2.尿素分解菌的鉴定
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了NH3和CO2。NH3会使培养基的碱性增强，pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，则可初步说明该种细菌能够分解尿素。
【检测反馈】
1．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是( )
A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用
B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基
C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上
D．在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种
2．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
3．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
注：“＋”表示加入，“－”表示不加
探究点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【师问导学】
1．下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答问题。
样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图
(1)请完善下列实验流程。
________取样：从肥沃、湿润的土壤中，用________铁铲铲去表层土，迅速取土壤并装入________纸袋密封
↓
配制________：制备以________为唯一氮源的选择培养基
↓
________的稀释：在________旁称取土壤10 g，放入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，振摇使土样与水充分混合，将菌分散。制成101倍土壤稀释液，从中吸取1 mL 土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍土壤稀释液，以此类推，制成103,104,105,106倍土壤稀释液
取样________：取9个上述选择培养基分成____组，并做好________，然后分别从______，______，______倍的三种土壤稀释液中吸取0.1 mL对号放入已做好标记的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀
↓
培养观察：将培养基平板倒置于________℃的恒温培养箱中培养1～2 d，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目________时的记录作为结果
(2)请设计记录和计数的表格，以便进行结果统计。
(3)该实验是用________________________法进行计数的。
①该方法在同一稀释度下，至少涂布3个平板作为重复组。分析结果时，需考虑重复组的结果________________，如果结果差异太大，则意味着操作有误，需要重新实验。
②为了保证结果准确，一般选择菌落数为________的平板进行计数。
(4)除上述方法外，细菌的计数还可用____________________法等。
2．在用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计菌落数目的理论依据是什么？
3．在稀释涂布平板法中，为何需要涂布3个平板？
4．为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
5．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
6．稀释涂布平板法和显微镜直接计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
【智涂笔记】
[特别提醒]
实验设计原则
(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。
(2)设立两种对照组：
①判断选择培养基中是否有杂菌污染，需同时将未接种的选择培养基进行培养；
②判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。
[易错提醒]
稀释涂布平板法的注意事项
(1)稀释涂布平板法所选择的稀释度很重要，以保证菌落数为30 ～300适于计数的平板。
(2)在分析结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。
[方法技巧]
用稀释涂布平板法计数微生物的方法
(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。
(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30～300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。
(4)每克样品中的菌株数＝某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数。
【师说核心】
1．统计菌落数目的方法
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法。
2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数结论的分析与评价
3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
(1)单菌落的获得
利用平板划线法接种时，单菌落从后划线的区域挑取；利用稀释涂布平板法接种时，只有合适的稀释度才能得到单菌落。
(2)两种接种方法的应用
两种方法都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单菌落，达到分离纯化微生物的目的；稀释涂布平板法还能对微生物进行计数，而平板划线法不能用于微生物的计数。
【检测反馈】
1．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234
2．(多选)如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是( )
A．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管中的10倍
B．5号试管中稀释液进行平板培养的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7×106个
C．当样品稀释度足够高时，一般平板上一个单菌落来源于一个活菌
D．某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目高
3．在做分离分解尿素的细菌实验时，从对应106培养基上A同学筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因可能有( )
①土样不同 ②培养基被污染 ③操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
【网络建构】
【主干落实】
1．选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
4．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
5．统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
2．某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234个，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)( )
A．2.34×108个 B．2.34×109个
C．234个 D．23.4个
3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．相同条件下接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．相同条件下接种了的选择培养基
4．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题：
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的____________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为________个。上述过程采用的接种方法是________________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是：
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
第2小节
(一)思考·讨论
1．提示：设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
2．提示：这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
(二)探究·实践
1．提示：如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
2．提示：如果得到了2个或2个以上菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3．提示：如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
(三)到社会中去
提示：上述几个实验都可采用稀释涂布平板法进行活菌计数，实验流程相似，大致都可分为以下几个步骤：
在相应环境中取样→制备培养基→梯度稀释与涂布平板→培养与观察→菌落计数。在对照实验设置方面，都需要设置一个未接种的普通培养基作为对照，以检测培养基是否被杂菌污染。第4个实验由于是土壤中真菌(或放线菌)的分离与计数，可能要用到选择培养基，所以还需设置一个接种的普通培养基作对照，以检测选择培养基是否有选择作用。
(四)练习与应用
概念检测
1．(1)√ (2)√ (3)√
2．D
拓展应用
1．提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
2．(1)提示：可以参考本节“探究·实践”中的设计思路进行设计。
(2)提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖质土等。
(3)提示：这一做法可行，通过人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌聚集。滤纸富含纤维素，将滤纸埋在土壤中，纤维素分解菌就会在滤纸上聚集分解纤维素，可以从腐烂滤纸上筛选纤维素分解菌。
第2课时 微生物的选择培养和计数
互动·探究·智涂
探究点一
【师问导学】
1．提示：从大豆田土壤取土样，利用缺乏氮源的培养基可分离出固氮微生物。
2．提示：应从富含纤维素的培养基中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
3．提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。
4．(1)葡萄糖 尿素
(2)尿素
(3)提示：具有选择作用。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离到能产生脲酶的微生物(即能分解尿素的微生物)。
(4)两种培养基上菌落的数目(其他条件相同且适宜)
【检测反馈】
1．解析：为了筛选、获取能利用多环芳烃为碳源的菌种，首先是取材，应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用，A正确；其次配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基，B正确；然后进行接种，在无菌环境下，将土壤稀释液接种到选择培养基上，在适宜的条件下进行培养，若将土壤稀释液进行灭菌，就不能筛选出能高效降解原油的菌株，C错误；在选择培养基上形成的菌落，若该菌落周围有分解圈，即为所需菌种，D正确。
答案：C
2．解析：不含有机物的培养基可以选择自养微生物，缺少氮元素的培养基可以选择固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。
答案：D
3．解析：分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且以尿素作为唯一的氮源，故不能添加硝酸盐。分离微生物要用固体培养基，所以要加琼脂。
答案：C
探究点二
【师问导学】
1．(1)土壤 无菌 无菌 培养基 尿素 样品
火焰 涂布 3 标记 104 105 106 30～37 稳定
(2)
(3)稀释涂布平板 是否一致 30～300
(4)显微镜直接计数
2．提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
3．提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
4．提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
5．提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。
6．提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
【检测反馈】
1．解析：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。
答案：D
2．解析：4号试管中稀释液的稀释倍数比5号试管的低10倍，如果稀释倍数适当，平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍，A正确；5号试管进行稀释涂布平板计数的结果表明，每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3×106÷0.1＝1.7×109(个)，B错误；当样品稀释度足够高时，一般平板上一个单菌落来源于一个活菌，C正确；稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞连在一起长成一个菌落的情况，所以该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。
答案：BD
3．解析：土样不同、培养基被污染和操作失误都会影响实验结果，对照的设置对实验结果没有影响。
答案：A
随堂·巩固·达标
1．解析：尿素和硝酸盐都能作为氮源，而培养尿素分解菌的培养基应是以尿素为唯一氮源的固体培养基。因此培养基中应不加硝酸盐，加入尿素和琼脂。葡萄糖作为碳源，也需要加入。
答案：C
2．解析：平板上菌落数的平均值×稀释倍数÷涂布液体积＝每毫升样品中的菌落数，即234×106÷0.1＝2.34×109(个)。
答案：B
3．解析：将菌液稀释相同的倍数并接种，相同培养条件下牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目，因此，应选择接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循单一变量原则，所以牛肉膏蛋白胨培养基要与选择培养基在相同条件下接种、培养。
答案：C
4．解析：(1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3×106÷0.1＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的含培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
答案：(1)脲酶 (2)无机盐 只有以尿素为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长 (3)形状、大小 4.2×108 稀释涂布平板法 (4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含培养基)进行培养
KH2PO4
1.4 g
Na2HPO4
2.1 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
葡萄糖
10.0 g
尿素
1.0 g
琼脂
15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
方法
特点
举例
一
利用营养缺陷进行的选择培养
通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷的微生物不能正常生长
缺乏氮源时可以分离固氮微生物
二
利用某种化学物质进行的选择培养
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物
加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
三
利用培养条件进行的选择培养
改变微生物的培养条件
将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
选项
尿素
琼脂
葡萄糖
硝酸盐
A
＋
＋
＋
＋
B
－
－
－
－
C
＋
＋
＋
－
D
＋
－
－
＋
项目
显微镜直接计数法
稀释涂布平板法
原理
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察计数，计算一定体积的样品中微生物的数量
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
主要
用具
显微镜、细菌计数板或血细胞计数板
培养基
计数
数据
菌体本身
培养基上菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
缺点
死菌、活菌都计算在内
操作复杂，有一定误差
内容
现象
结论
有无污染
的判断
对照的培养基中无菌落生长
未被杂菌污染
培养物中菌落数偏高
培养物中混入其他氮源
菌落形态多样，菌落数偏高
被杂菌污染
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具筛选作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目为30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
稀释度
104
105
106
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
每个平板上的菌落个数
每克土壤中的菌落个数
课程标准
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
2．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
素养达成
1.各类微生物都能适应其生活环境。(生命观念)
2．根据微生物的代谢类型配制选择培养基。(科学思维)
3．讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法。(科学探究)
瞧，细菌和小麦多客气！为什么细菌要感谢小麦而小麦也感谢细菌呢？我们知道，尿素是农业生产中重要的氮肥，农民会经常给农作物使用尿素，但尿素不能直接被农作物吸收，只有被土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被农作物吸收利用。单个细菌是看不见的，我们如何将土壤中分解尿素的细菌请出来，以观尊容呢？
探究点一 选择培养基
【师问导学】
1．如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物？
2．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
3．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？
4．要把某种微生物从众多微生物中筛选出来，就要利用其代谢特点选择合适的培养基。下面是分离土壤中分解尿素的细菌使用的选择培养基配方，请分析回答问题。
(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是____________，提供氮源的是________。
(2)绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能利用________。
(3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？
(4)判断选择培养基是否具有筛选作用，还需同时接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行培养，观察同一稀释度的菌液接种的______________________，进行对比得出结论。
【智涂笔记】
[特别提醒]
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。原则上选择培养基只允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。
【师说核心】
1．选择培养基的选择作用
(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
(2)目的：从众多的微生物中分离所需要的微生物。
(3)三种方法的比较
2.尿素分解菌的鉴定
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了NH3和CO2。NH3会使培养基的碱性增强，pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，则可初步说明该种细菌能够分解尿素。
【检测反馈】
1．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是( )
A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用
B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基
C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上
D．在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种
2．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
3．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
注：“＋”表示加入，“－”表示不加
探究点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【师问导学】
1．下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答问题。
样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图
(1)请完善下列实验流程。
________取样：从肥沃、湿润的土壤中，用________铁铲铲去表层土，迅速取土壤并装入________纸袋密封
↓
配制________：制备以________为唯一氮源的选择培养基
↓
________的稀释：在________旁称取土壤10 g，放入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，振摇使土样与水充分混合，将菌分散。制成101倍土壤稀释液，从中吸取1 mL 土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍土壤稀释液，以此类推，制成103,104,105,106倍土壤稀释液
取样________：取9个上述选择培养基分成____组，并做好________，然后分别从______，______，______倍的三种土壤稀释液中吸取0.1 mL对号放入已做好标记的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀
↓
培养观察：将培养基平板倒置于________℃的恒温培养箱中培养1～2 d，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目________时的记录作为结果
(2)请设计记录和计数的表格，以便进行结果统计。
(3)该实验是用________________________法进行计数的。
①该方法在同一稀释度下，至少涂布3个平板作为重复组。分析结果时，需考虑重复组的结果________________，如果结果差异太大，则意味着操作有误，需要重新实验。
②为了保证结果准确，一般选择菌落数为________的平板进行计数。
(4)除上述方法外，细菌的计数还可用____________________法等。
2．在用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计菌落数目的理论依据是什么？
3．在稀释涂布平板法中，为何需要涂布3个平板？
4．为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
5．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
6．稀释涂布平板法和显微镜直接计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
【智涂笔记】
[特别提醒]
实验设计原则
(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。
(2)设立两种对照组：
①判断选择培养基中是否有杂菌污染，需同时将未接种的选择培养基进行培养；
②判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。
[易错提醒]
稀释涂布平板法的注意事项
(1)稀释涂布平板法所选择的稀释度很重要，以保证菌落数为30 ～300适于计数的平板。
(2)在分析结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。
[方法技巧]
用稀释涂布平板法计数微生物的方法
(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。
(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30～300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。
(4)每克样品中的菌株数＝某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数。
【师说核心】
1．统计菌落数目的方法
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法。
2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数结论的分析与评价
3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
(1)单菌落的获得
利用平板划线法接种时，单菌落从后划线的区域挑取；利用稀释涂布平板法接种时，只有合适的稀释度才能得到单菌落。
(2)两种接种方法的应用
两种方法都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单菌落，达到分离纯化微生物的目的；稀释涂布平板法还能对微生物进行计数，而平板划线法不能用于微生物的计数。
【检测反馈】
1．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234
2．(多选)如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是( )
A．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管中的10倍
B．5号试管中稀释液进行平板培养的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7×106个
C．当样品稀释度足够高时，一般平板上一个单菌落来源于一个活菌
D．某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目高
3．在做分离分解尿素的细菌实验时，从对应106培养基上A同学筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因可能有( )
①土样不同 ②培养基被污染 ③操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
【网络建构】
【主干落实】
1．选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
4．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
5．统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
2．某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234个，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)( )
A．2.34×108个 B．2.34×109个
C．234个 D．23.4个
3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．相同条件下接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．相同条件下接种了的选择培养基
4．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题：
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的____________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为________个。上述过程采用的接种方法是________________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是：
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
第2小节
(一)思考·讨论
1．提示：设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
2．提示：这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
(二)探究·实践
1．提示：如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
2．提示：如果得到了2个或2个以上菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3．提示：如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
(三)到社会中去
提示：上述几个实验都可采用稀释涂布平板法进行活菌计数，实验流程相似，大致都可分为以下几个步骤：
在相应环境中取样→制备培养基→梯度稀释与涂布平板→培养与观察→菌落计数。在对照实验设置方面，都需要设置一个未接种的普通培养基作为对照，以检测培养基是否被杂菌污染。第4个实验由于是土壤中真菌(或放线菌)的分离与计数，可能要用到选择培养基，所以还需设置一个接种的普通培养基作对照，以检测选择培养基是否有选择作用。
(四)练习与应用
概念检测
1．(1)√ (2)√ (3)√
2．D
拓展应用
1．提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
2．(1)提示：可以参考本节“探究·实践”中的设计思路进行设计。
(2)提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖质土等。
(3)提示：这一做法可行，通过人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌聚集。滤纸富含纤维素，将滤纸埋在土壤中，纤维素分解菌就会在滤纸上聚集分解纤维素，可以从腐烂滤纸上筛选纤维素分解菌。
第2课时 微生物的选择培养和计数
互动·探究·智涂
探究点一
【师问导学】
1．提示：从大豆田土壤取土样，利用缺乏氮源的培养基可分离出固氮微生物。
2．提示：应从富含纤维素的培养基中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
3．提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。
4．(1)葡萄糖 尿素
(2)尿素
(3)提示：具有选择作用。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离到能产生脲酶的微生物(即能分解尿素的微生物)。
(4)两种培养基上菌落的数目(其他条件相同且适宜)
【检测反馈】
1．解析：为了筛选、获取能利用多环芳烃为碳源的菌种，首先是取材，应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用，A正确；其次配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基，B正确；然后进行接种，在无菌环境下，将土壤稀释液接种到选择培养基上，在适宜的条件下进行培养，若将土壤稀释液进行灭菌，就不能筛选出能高效降解原油的菌株，C错误；在选择培养基上形成的菌落，若该菌落周围有分解圈，即为所需菌种，D正确。
答案：C
2．解析：不含有机物的培养基可以选择自养微生物，缺少氮元素的培养基可以选择固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。
答案：D
3．解析：分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且以尿素作为唯一的氮源，故不能添加硝酸盐。分离微生物要用固体培养基，所以要加琼脂。
答案：C
探究点二
【师问导学】
1．(1)土壤 无菌 无菌 培养基 尿素 样品
火焰 涂布 3 标记 104 105 106 30～37 稳定
(2)
(3)稀释涂布平板 是否一致 30～300
(4)显微镜直接计数
2．提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
3．提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
4．提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
5．提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。
6．提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
【检测反馈】
1．解析：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。
答案：D
2．解析：4号试管中稀释液的稀释倍数比5号试管的低10倍，如果稀释倍数适当，平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍，A正确；5号试管进行稀释涂布平板计数的结果表明，每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3×106÷0.1＝1.7×109(个)，B错误；当样品稀释度足够高时，一般平板上一个单菌落来源于一个活菌，C正确；稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞连在一起长成一个菌落的情况，所以该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。
答案：BD
3．解析：土样不同、培养基被污染和操作失误都会影响实验结果，对照的设置对实验结果没有影响。
答案：A
随堂·巩固·达标
1．解析：尿素和硝酸盐都能作为氮源，而培养尿素分解菌的培养基应是以尿素为唯一氮源的固体培养基。因此培养基中应不加硝酸盐，加入尿素和琼脂。葡萄糖作为碳源，也需要加入。
答案：C
2．解析：平板上菌落数的平均值×稀释倍数÷涂布液体积＝每毫升样品中的菌落数，即234×106÷0.1＝2.34×109(个)。
答案：B
3．解析：将菌液稀释相同的倍数并接种，相同培养条件下牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目，因此，应选择接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循单一变量原则，所以牛肉膏蛋白胨培养基要与选择培养基在相同条件下接种、培养。
答案：C
4．解析：(1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3×106÷0.1＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的含培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
答案：(1)脲酶 (2)无机盐 只有以尿素为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长 (3)形状、大小 4.2×108 稀释涂布平板法 (4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含培养基)进行培养
KH2PO4
1.4 g
Na2HPO4
2.1 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
葡萄糖
10.0 g
尿素
1.0 g
琼脂
15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
方法
特点
举例
一
利用营养缺陷进行的选择培养
通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷的微生物不能正常生长
缺乏氮源时可以分离固氮微生物
二
利用某种化学物质进行的选择培养
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物
加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
三
利用培养条件进行的选择培养
改变微生物的培养条件
将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
选项
尿素
琼脂
葡萄糖
硝酸盐
A
＋
＋
＋
＋
B
－
－
－
－
C
＋
＋
＋
－
D
＋
－
－
＋
项目
显微镜直接计数法
稀释涂布平板法
原理
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察计数，计算一定体积的样品中微生物的数量
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
主要
用具
显微镜、细菌计数板或血细胞计数板
培养基
计数
数据
菌体本身
培养基上菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
缺点
死菌、活菌都计算在内
操作复杂，有一定误差
内容
现象
结论
有无污染
的判断
对照的培养基中无菌落生长
未被杂菌污染
培养物中菌落数偏高
培养物中混入其他氮源
菌落形态多样，菌落数偏高
被杂菌污染
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具筛选作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目为30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
稀释度
104
105
106
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
每个平板上的菌落个数
每克土壤中的菌落个数
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