2020-2021学年第2节 基因工程的基本操作程序图片课件ppt

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一、动物细胞融合技术1.概念:使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.结果:形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。3.原理:细胞膜具有流动性。4.方法:诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。5.意义(1)细胞融合技术突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能。(2)是研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。(3)杂交瘤技术为制造单克隆抗体开辟了新途径。
二、单克隆抗体及其应用1.常规抗体的制备(1)方法:向动物体内反复注射某种抗原,使动物体产生抗体,然后从动物血清中分离所需抗体。(2)该方法的缺陷:产量低,纯度低,特异性差。2.单克隆抗体制备的原理
3.单克隆抗体制备的过程
4.单克隆抗体的应用(1)优点:能准确地识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合,并且可以大量制备。(2)应用①作为诊断试剂。例如, 利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术,可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。②用单克隆抗体运载药物。如抗体—药物偶联物,通常由抗体、接头和药物三部分组成,通过将细胞毒素与能特异性识别抗原的单克隆抗体结合,实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。③用于治疗疾病。
【预习检测】 1.判断正误。(1)植物原生质体融合和动物细胞融合的基本原理是相同的。(　　)(2)动物细胞融合技术可用于培育杂种动物和制备单克隆抗体。(　　)(3)诱导动物细胞融合可以用灭活病毒诱导法。(　　)(4)与传统抗体相比,单克隆抗体特异性强,并且可大量制备。(　　)(5)细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。(　　)(6)将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行诱导融合,培养液中融合后的细胞即为杂交瘤细胞。 (　　)
2.下列关于动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较,正确的是(　　)①诱导融合的方法完全相同　②都需要先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁　③基本原理完全相同　④都能形成杂种细胞A.①②　　　　　　B.①③C.②④D.③④ 答案:D
3.下图是单克隆抗体制备过程示意图,其中1过程注射的物质和A细胞的名称分别为(　　)A.抗体、T淋巴细胞B.抗原、T淋巴细胞C.抗体、B淋巴细胞D.抗原、B淋巴细胞答案:D解析: 1过程注射的是抗原,使小鼠产生经过免疫的B淋巴细胞(A细胞)。
4.动物细胞融合的原理,以及与植物体细胞杂交相比,其特有的诱导因素分别是(　　)A.细胞膜的流动性、离心B.细胞膜的流动性、灭活的病毒C.细胞的全能性、电激D.细胞的全能性、灭活的病毒答案:B解析:植物体细胞杂交的原理是细胞膜的流动性和细胞的全能性,动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性;动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等,其中灭活的病毒是其特有的诱导因素,而聚乙二醇、电激也可用于诱导植物体细胞杂交。
5.要想获得大量的单克隆抗体,就必须用单个的B淋巴细胞进行无性繁殖,形成细胞群。其原因是(　　)A.在体外培养条件下B淋巴细胞可以无限增殖B.在动物体内,每个B淋巴细胞可产生多种抗体C.每一个B淋巴细胞都参与特异性免疫反应D.每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体答案:D
知识点一　动物细胞融合技术
1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同?提示:(1)利用灭活的病毒诱导是动物细胞融合常用的方法,植物体细胞杂交不用此方法。(2)在植物体细胞杂交过程中,首先要去除细胞壁,制备原生质体,而动物细胞无细胞壁,可直接诱导融合。(3)通过植物体细胞杂交技术可获得杂种植株,通过动物细胞融合技术只能得到杂种细胞或细胞产物。
2.细胞融合的实质是什么?动物细胞融合完成的标志是什么?提示:细胞融合的实质是细胞核融合。动物细胞融合完成的标志是两个或多个细胞核融合为一个细胞核。3.培养液中存在A、B两种细胞,经诱导融合处理后,培养液中可能存在的融合细胞类型有哪些(只考虑两个细胞融合的情况)?哪种类型才是真正有意义的杂交细胞?提示:A—A融合细胞、B—B融合细胞、A—B融合细胞。其中A—B融合细胞才是真正有意义的杂交细胞。
1.灭活病毒诱导法的原理灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力,但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用,使细胞互相凝聚,细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。具体过程如上图:
2.植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较
下图为细胞融合技术的一些过程,请据图回答问题。(1)从甲细胞和乙细胞到丙细胞的过程中,采用的方法中与诱导植物原生质体融合不同的是用　　　　　　　处理。 (2)如果甲、乙来自单倍体烟草的体细胞,那么它们已经用酶降解且脱掉了　　　　。 该过程所用的酶可能是　　　　　　　　,由此形成的细胞经培养形成的细胞团称为　　　　　　　　　　　　。 
(3)若将基因型为AaBB的番茄细胞与基因型为AAbb的番茄细胞融合,所形成细胞的基因型是　　　　　　　　　　　　。 (4)若将染色体组成为2A+XX的人细胞与染色体组成为2B+XX的鼠细胞融合,培育成的人—鼠细胞的染色体组成是　　　　　　　　　　　　。 答案:(1)灭活的病毒(2)细胞壁　纤维素酶和果胶酶　愈伤组织(3)AAAaBBbb(4)2A+2B+XX+XX
解析:(1)诱导动物细胞融合特有的方法是灭活病毒诱导法。(2)植物细胞有细胞壁,如果甲、乙来自单倍体烟草的体细胞,那么它们已经用纤维素酶和果胶酶处理脱掉了细胞壁。植物体细胞杂交获得的杂种细胞,经脱分化形成愈伤组织。(3)若将基因型为AaBB的番茄细胞与基因型为AAbb的番茄细胞融合,所形成细胞的基因型是两种细胞基因型的累加,即AAAaBBbb。(4)细胞融合后的染色体组成是两种细胞染色体组成的累加。
【变式训练】 1.(不定项选择题)下图为细胞融合的示意图,下列叙述正确的是(　　)A.若a细胞和b细胞是植物细胞,需先去除细胞壁再诱导融合B.a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现C.c细胞的形成与a、b细胞膜的流动性都有关D.c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因答案:ABC解析:植物细胞融合前需去除细胞壁,形成原生质体,再诱导融合。细胞融合需要促融处理。细胞融合依赖于细胞膜的流动性。融合细胞中不能表达所有基因。
2.下列对植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,正确的是(　　)A.动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同,诱导融合的方法也完全相同B.两者都可以跨越种属间的生殖隔离,突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能C.利用植物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术,为制造单克隆抗体开辟了新途径D.目前科学家终于实现了两个植物物种间的体细胞杂交,得到了同时具有两个物种遗传物质的超级植物,并使它们的性状全部得以体现答案:B
解析:动物细胞融合可用灭活的病毒诱导,而植物原生质体不可以。利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术,为制造单克隆抗体开辟了新途径。“超级植物”具有两个亲本的遗传物质,但它们的性状不能全部表达。
知识点二　单克隆抗体及其应用
1.为什么要给小鼠注射抗原?提示:以获得能产生相应抗体的B淋巴细胞(浆细胞)。2.能否直接用经过免疫的B淋巴细胞(浆细胞)来获得单克隆抗体?为什么?提示:不能。用于获得杂交瘤细胞的B淋巴细胞为浆细胞。浆细胞是高度分化的动物细胞,培养时很难恢复分裂能力,不能进行无限增殖,难以获得单克隆抗体。
3.制备单克隆抗体时,为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞?提示:每个B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体,但不能无限增殖;骨髓瘤细胞可大量快速增殖,却不能产生抗体。若将两种细胞融合在一起,则既能产生特异性抗体,又能快速增殖。4.B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经聚乙二醇处理后,培养液中存在哪几种细胞?提示:未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、B—B融合细胞、瘤—瘤融合细胞、B—瘤融合细胞。5.在制备单克隆抗体的过程中需进行两次筛选,其目的分别是什么?提示:第一次筛选的目的是获得杂交瘤细胞,第二次筛选的目的是获得能产生所需单一抗体的杂交瘤细胞。
1.血清抗体与单克隆抗体的比较
2.单克隆抗体制备过程的几个问题分析(1)对动物进行免疫的原因:B淋巴细胞要经过免疫过程,即接触抗原,增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞,才能产生相应的抗体,所以,与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。
(2)单克隆抗体制备过程中的两次筛选第一次筛选:B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经诱导剂作用后,会出现多种细胞,如B—B细胞、瘤—瘤细胞、B—瘤细胞、B细胞、骨髓瘤细胞等,因而要用选择培养基筛选获得杂交瘤细胞(即B—瘤细胞)。用特定的培养基筛选,未融合的和融合的具有相同核的细胞死亡,只有杂种细胞才能生长。第二次筛选:B淋巴细胞有多种,与骨髓瘤细胞融合后产生多种杂交瘤细胞,因而需要对杂交瘤细胞做进一步的筛选。通常用“有限稀释法”,将杂交瘤细胞稀释用多孔培养板培养,使每孔中的细胞不超过一个,培养增殖后,检测各孔上清液中细胞分泌的抗体,以确定是不是所需要的杂交瘤细胞。
(3)杂交瘤细胞具备双亲的遗传物质,不仅具有浆细胞产生特异性抗体的能力,还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力,从而可以克服单纯B淋巴细胞不能无限增殖的缺点,大量生产单克隆抗体。
下图是制备分泌抗X(H1N1流感病毒)抗体的过程,请据图回答问题。
(1)给小鼠注射抗原的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　。 (2)在单克隆抗体制备过程中,之所以选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,是因为它们融合后的杂交瘤细胞具有　　　　　　　　　　　　的特性。 (3)动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等,与植物细胞培养基有所不同的是还含有　　　　　　　　　　　　　。 (4)在动物细胞融合过程中,需要将所选取的组织细胞分散开,以利于细胞融合,常用　　　　　　　　　　处理离体组织细胞使之分散开。 (5)图中有两次筛选过程,其中步骤④的目的是筛选出　　　　　　　　,步骤⑤⑥的目的是筛选出　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(6)请根据以下信息,设计一种方法(不考虑机械方法),从培养液中筛选出杂交瘤细胞。已知细胞合成DNA有D和S两条途径,其中D途径能被腺嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径,但一般不分裂增殖;鼠骨髓瘤细胞中尽管只有D途径,但能不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混合,加入聚乙二醇促融,获得杂种细胞。方法:　 。 原理:     　。 
答案:(1)获得能产生相应抗体的B淋巴细胞(2)既能无限增殖,又能产生特定抗体(3)动物血清(4)胰蛋白酶(5)杂交瘤细胞　能产生特定抗体的杂交瘤细胞(6)培养液中加入腺嘌呤,收集增殖的细胞　加入腺嘌呤后,使D合成途径阻断,仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其自身融合的细胞不能增殖,但人的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后形成的杂种细胞可以利用B淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖
解析:(1)根据抗原与抗体特异性结合的原理,用特定抗原刺激,小鼠体内生成能产生特定抗体的浆细胞,即可获得相应的B淋巴细胞。(2)杂交瘤细胞具有两种细胞的遗传物质,既能产生特定的抗体,又能无限增殖。(3)动物细胞培养液与植物组织培养基相比,除物理状态不同外,成分也不相同,动物细胞培养液中还含动物血清。(4)为使动物组织分散成单个细胞,可用胰蛋白酶处理。(5)在单克隆抗体制备过程中,从小鼠体内提取的B淋巴细胞可能有多种,以及细胞融合方式有多种,从而产生多种融合细胞以及多种杂交瘤细胞,因此需多次筛选。从图中可以看出,④是用选择培养基筛选出杂交瘤细胞,⑤⑥是筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
(6)据题干信息可知,可在培养液中加入腺嘌呤,使D合成途径阻断,仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其自身融合的细胞不能增殖,而B淋巴细胞一般不增殖,但B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后形成的杂种细胞可以利用B淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。
【变式训练】 1.根据单克隆抗体制备流程示意图判断,下列叙述正确的是(　　)A.制备单克隆抗体的原理包括细胞增殖、细胞膜的流动性、细胞的全能性等B.根据培养基的物理性质分类,图中HAT培养基属于选择培养基C.在制备单克隆抗体的过程中有两次筛选,第一次是筛选杂交瘤细胞,第二次是筛选能够产生所需抗体的杂交瘤细胞D.小鼠骨髓瘤细胞染色体是40条,B淋巴细胞的染色体为46条,融合后形成的杂交瘤细胞中DNA分子为86个答案:C
解析:制备单克隆抗体不涉及细胞的全能性,A项错误。HAT培养基为选择培养基,是根据功能分类的,而不是物理性质,B项错误。动物细胞两两融合,可能出现3种不同的情况,需要通过筛选获取杂交瘤细胞,这些杂交瘤细胞产生的抗体并不单一,需要经过第二次筛选,以获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞,C项正确。融合后的杂交瘤细胞的细胞质中含有少量的DNA,因此杂交瘤细胞中的DNA分子数应大于86个,D项错误。
2.单克隆抗体在医疗、诊断等方面发挥着越来越重要的作用。科学家米尔斯坦和科勒设计了一个用已免疫的B淋巴细胞制备单克隆抗体的实验,下图为其实验流程图。下列有关叙述错误的是(　　)A.a是骨髓瘤细胞,②表示在选择培养基上进行培养B.制备单克隆抗体时,选择B淋巴细胞的原因是它能分泌多种特异性抗体C.③过程如在体外培养,则需要无菌、无毒,营养充足,温度、pH 适宜等环境条件D.诱导动、植物细胞融合常用的一种化学诱导剂是聚乙二醇答案:B解析:每一种B淋巴细胞经特定抗原刺激只能产生一种特异性抗体。