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所属成套资源：2023版高考人教版（2019）生物一轮总复习课件
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2023版高考生物一轮总复习第3、4章基因工程生物技术的安全性和伦理问题课件
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这是一份2023版高考生物一轮总复习第3、4章基因工程生物技术的安全性和伦理问题课件，共60页。
考点一 DNA 重组技术的基本工具1.基因工程的概念(1)手段：按照___________，通过__________等技术，
赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生
(3)水平：_______水平。(4)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的______________。
(1) 限制酶的识别序列与被作用的 DNA 序列是不同的。前者一般由 6 个核苷酸组成，少数由 4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。
(2)判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转 180 °，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。
(3)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是
(4)在切割含目的基因的 DNA 分子时，需用限制酶切割两次此 DNA 分子，产生 4 个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶。
3.基因工程的理论基础
4.限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 Sma Ⅰ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用 Pst Ⅰ和 EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组 DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用 Sma Ⅰ切割。
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
考点二 基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的
(2)目的基因的获取方法。
①利用 PCR 获取和扩增目的基因。②人工合成目的基因。
a.反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的 mRNA 为模板，借助逆转录酶合成双链 DNA，其过程如下：
b.化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
③从基因文库中获取目的基因。根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA，以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
(3)利用 PCR 获取和扩增____________。①原理：__________________。②条件：
③过程：PCR 过程包括____________________三步。
结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为
(4)PCR 技术和 DNA 复制的比较。
2.基因表达载体的构建——核心
(1)目的：使目的基因在__________中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)组成。
启动子≠起始密码子 终止子≠终止密码子
(1)启动子是位于基因上游的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因下游的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。
(2)起始密码子和终止密码子均位于mRNA 上，分别控
制翻译过程的启动和终止。
(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入。
第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体 DNA 上；第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
(2)导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体 DNA 上。存在于染色体 DNA 上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程的应用(1)食品工业方面。
生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用
转基因技术大量生产凝乳酶。
①器官移植：用转基因动物作器官移植的________，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
②乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
(1)概念：以蛋白质分子的___________及其与生物功能的关系作为基础，通过_____________基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。(2)操作手段和结果。
3.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
考点四 生物技术的安全性与伦理问题1.转基因产品的安全性
(1)生殖性克隆人面临的伦理问题。①生殖性克隆人“有违人类尊严”。
②生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位
上都不健全的人，严重违反了人类伦理道德。
③克隆技术尚不成熟，面临构建重构胚胎成功率低，胚胎移植到母体子宫后着床率低、流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题。
(2)我国禁止生殖性克隆人。
①中国政府积极支持制定《禁止生殖性克隆人国际公约》，坚决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实验。
②我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不
支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
③我国政府主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审
(4)治疗性克隆和生殖性克隆的比较。
3.试管婴儿与设计试管婴儿的异同点(1)不同点。
①所用技术手段：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断 HLA 的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。
如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了 d 过程：
②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、致命贫血症等疾病的治疗。(2)相同点：都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，
都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
致病能力强，攻击范围广
①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等。②病毒类：天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等。③__________类：肉毒杆菌毒素等。(2)特点：______________________________。(3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。
【基础测评】1.易错诊断(1)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，
使之稳定存在并表达。(
(2)外源 DNA 必在位于重组质粒的启动子和终止子之
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未
(4)应用 DNA 探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植
株中目的基因的存在及其是否完全表达。(
(5)种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植
答案：(1)√ (2)× (3)√ (4)× (5)√
2.下列关于载体的相关叙述，错误的是(
A.目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒B.天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞C.载体 DNA 分子上要有一个至多个限制酶切割位点D.载体上的标记基因有利于筛选含重组 DNA 的细胞答案：B
3.科学家为提高玉米中赖氨酸的含量，计划将天冬氨酸激酶第 352 位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中 104 位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸含量分别提高 5 倍和 2 倍。
A.直接通过分子水平改造蛋白质B.直接改造相应的 mRNAC.直接改造相应的基因D.重新合成新的基因答案：C
考向 1 基因工程所需工具
[典例 1](2021 年全国卷Ⅰ)用 DNA 重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中 4 种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
(1)常用的 DNA 连接酶有 E.cli DNA 连接酶和 T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的 DNA 片段可以用E.cli DNA 连接酶连接。上图中__________ 酶切割后的DNA 片段可以用 T4DNA 连接酶连接。
(2)DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之
间形成的化学键是____________。
(3)DNA 重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒 DNA 分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能__________；质粒 DNA 分子上有______________，便于外源 DNA 插入；质粒 DNA 分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指______________
____________________。
解析：(1)限制酶 EcR Ⅰ和 Pst Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶 Sma Ⅰ和 EcR V 切割形成的是平末端，E.cli DNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于 T4 噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中 EcR Ⅰ和 Pst Ⅰ切割后的DNA 片段(黏性末端)可以用 E.cli DNA 连接酶连接，除了这两种限制酶切割的 DNA 片段，限制酶 Sma Ⅰ和EcR V切割后的 DNA 片段(平末端)也可以用 T4DNA 连接酶连接。(2)DNA 连接酶将两个 DNA 片段连接形成磷酸二酯键。
(3)质粒是小型环状的 DNA 分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒 DNA 分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的 DNA片段，位于基因的上游，它是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
答案：(1)EcR Ⅰ、Pst Ⅰ EcR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和 EcR V(2)磷酸二酯键
一个至多个限制酶切位点
生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞(4)位于基因上游的一段特殊 DNA 序列，是 RNA 聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
1.(2020 年南昌高三一模节选)质粒 A 和质粒 B 各自有一个限制酶 EcR Ⅰ和限制酶 BamHⅠ的识别位点，两种酶切割 DNA 产生的黏性末端不同。限制酶 EcR Ⅰ剪切位置旁边的数字表示其与限制酶 BamHⅠ剪切部位之间的碱基对数(bp)。在含有质粒 A 和 B 的混合溶液中加入限制酶 EcR Ⅰ和 BamHⅠ，令其反应充分；然后，向剪切产物中加入 DNA 连接酶进行反应，再将其产物导入大肠杆
菌中。(实验中不考虑无 ri 的质粒、拥有两个或两个以上ri 的质粒、两个或两个以上质粒同时进入大肠杆菌、三个或三个以上 DNA 片段发生连接)请回答下列问题。
ri：质粒复制原点；tet：四环素抗性基因；amp：氨苄青霉素抗性基因；gfp：基因产物在紫外线照射下可发出绿色荧光；lac：基因控制合成的半乳糖苷酶可以水解乳糖(1)只拥有质粒 A 的大肠杆菌________(填“可以”或“不可以”)在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳元素来源的培养基中生存。说明理由：______________________________________________________________________。
(2)DNA 连接酶进行反应后，存在________种大小不同的质粒，有________种质粒使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存。
(3)绿色荧光蛋白基因是标记基因的一种，标记基因的
功能是________________。
解析：由题图可知，质粒A 含有氨苄青霉素抗性基因和半乳糖苷酶基因，用EcR Ⅰ和BamHⅠ酶切后，形成2000 bp(含 amp)和 1000 bp(含 lac)两段；质粒B 含氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因和绿色荧光蛋白基因，用EcR Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切后，形成 3000 bp(含 amp、gfp)和 2500 bp(含 tet)两段。由题干“两种酶切割DNA 产生的黏性末端不同”可知，酶切后质粒自身两端不能连接。DNA 连接酶进行反应后，由于实验中不考虑无ri 的质粒、拥有两个或两个以上 ri 的质粒、两个或两个以上质粒同
时进入大肠杆菌及三个或三个以上 DNA 片段发生连接，因此可存在 4 种大小不同的质粒，即：①质粒A 两个片段连接 3000 bp(2000 bp＋1000 bp)、②质粒A 含ri 的片段和质粒 B 不含 ri 的片段连接 4500 bp(2000 bp＋2500 bp)、③质粒 A 不含 ri 的片段和质粒 B 含 ri 的片段连接4000 bp(1000 bp＋3000 bp)、④质粒 B 两个片段连接5500 bp(3000 bp＋2500 bp)。有 2 种质粒使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存，即①③。
答案：(1)可以 质粒 A 含有氨苄青霉素抗性基因，使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素的培养基中生存，还含有半乳糖苷酶基因，使大肠杆菌合成半乳糖苷酶，并水解乳糖获得能量和碳源
(3)供重组 DNA 的选择和鉴定
考向 2 PCR 技术的应用
[典例 2](2021 年山东高考)人类γ基因启动子上游调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是________，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要_______种酶。
(2)将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____________________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于____________，理由是____________________________。
解析：(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子 P 的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的 R 端与荧光蛋白基因中限制酶 Mun Ⅰ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有 Mun Ⅰ 和
Xh Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶 Mun Ⅰ和 Xh Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶 EcR Ⅰ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶 Mun Ⅰ识别并切割后的黏性末端与限制酶 EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是 EcR Ⅰ，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 Sal Ⅰ；荧光蛋白基因中含有限制酶 EcR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶
Mun Ⅰ和 Xh Ⅰ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和 Xh Ⅰ切割，对扩增后的产物用限制酶 EcR Ⅰ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，然后在 DNA 连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用 Taq 酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 6 种酶，分别是 Taq 酶、限制酶 EcR Ⅰ、限制酶Sal Ⅰ、限制酶 Mun Ⅰ、限制酶 Xh Ⅰ、DNA 连接酶。(2)受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的
BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要 RNA 聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是 F7 与 R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A 蛋白，BCL11A 蛋白与 BCL11A 蛋白结合位点结
合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F4 与引物 R 之间的序列上；含 F5～F6 与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F5 的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1) Sal Ⅰ EcR Ⅰ 6(2)F7 与 R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达(3)引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段
根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有
结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
获取目的基因方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过 DNA 合成仪利用化学方法直接人工合成。(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，可以通过 PCR 技术扩增目的基因。
2.(2021 年江西南昌四校联考)2019 年 6 月 17 日，新华社报道了屠呦呦及其团队经过多年攻坚，在“抗疟机理研究”“抗药性成因”“调整治疗手段”等方面取得新突破。之后屠呦呦团队提出应对“青蒿素抗药性”难题的切实可行的治疗方案。某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，让青蒿素合成过程的某一关键酶基因 fps 在野生青蒿中过量表达，其过程如图：
(1)图中酶 1 是________，酶 2 是________。利用 PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板 DNA 解链为单链的条件是加热至 90 ℃以上，目的是破坏 DNA 分子中的________键。在构建重组 Ti 质粒的过程中，需将目的基因插入 Ti 质粒的________________。
(2)检验目的基因是否整合到青蒿基因组，可以将放射性同位素标记的________制成基因探针，与青蒿基因组DNA 杂交。理论上，与野生青蒿相比，该探针与转基因青蒿DNA形成的杂交带的量_____(填“较多”或“较少”)。
(3)据图分析，农杆菌的作用是________________________________。为准确判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的________________。
解析：(1)据图示可知，酶 1 促进逆转录的过程，故为逆转录酶，酶 2 用于切割目的基因和质粒，故为限制性内切核酸酶(限制酶)。利用 PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板 DNA 解旋为单链的条件是加热至 90 ℃以上，目的是破坏 DNA 分子中的氢键。构建重组 Ti 质粒的过程中，需将目的基因插入Ti 质粒的T-DNA。(2)检验目的基因是否整合到青蒿基因组，可用 DNA 分子杂交法，即将 fps 基因制成基因探针，与青蒿基因组DNA 杂交。与
野生青蒿相比，该探针与转基因青蒿 DNA 形成的杂交带的量较多。(3)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，由图可知，农杆菌的作用是感染植物，将目的基因转移到受体细胞中。为准确判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量，若产量增高，则说明达到了目的。
答案：(1)逆转录酶 限制酶 氢 T-DNA(2)fps 基因 较多
(3)感染植物，将目的基因转移到受体细胞中 青蒿素
考向 3 基因工程的基本操作程序
[典例 3](2021 年广东高考)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了 4 步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
(1)研究人员采用 PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有________________。(答出两种即可)
(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，方法有__________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有_______________________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将 4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是__________。在分子水平上，可以通过改变__________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了 PCR 技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋白，可根据 DNA 和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受
态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的 DNA 分子。基因工程中，酶基因( 目的基因) 成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原－抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)基因文库中获取、人工合成法(2)盐析法、酶解法或高温变性(3)感受态 抗原—抗体杂交技术
(4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
3.(2021 年中原名校联盟)某质粒上有 Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题。
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的 DNA 片段，称为________。该方法中农杆菌的作用是_____________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用 Hind Ⅲ和 Sal Ⅰ两种酶的好处是
__________________________________________________
_________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？ ________( 填“是”或“否”)。为什么？__________________________
________________________________________________。(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到 A 培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取 A 上的单个菌落，分别接种
到 B(含氨苄青霉素)和 C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于 B 或 C 上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
答案：(1)Ti 质粒
基因插入到烟草细胞的染色体 DNA 上
自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成
含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破
考向 4 基因工程的应用[典例 4](2020 年和平区二模)用限制酶 EcRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别降解一个 1000 bp(1 bp 即 1 个碱基对)的 DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如下图所示。该 DNA
分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是(
解析：A 选项中的 DNA 用 Kpn Ⅰ单独酶切会得到
600 bp 和 200 bp 两种长度的 DNA 分子，与题意不符，A错误。B 选项中的 DNA 用 Kpn Ⅰ单独酶切会得到600 bp和 400 bp 两种长度的 DNA 分子，与题意不符，B 错误。C 选项中的DNA 用Kpn Ⅰ酶切后得到的DNA 分子是1000 bp，用EcRⅠ单独酶切得到200 bp 和800 bp 两种长度的DNA 分子，用 EcRⅠ、Kpn Ⅰ同时酶切后得到200 bp 和400 bp 两种长度的DNA 分子，与题意相符，C 正确。D 选项中的 DNA 用 Kpn Ⅰ酶切后得到 400 bp 和 600 bp 两种长度的 DNA 分子，与题意不符，D 错误。
4.(2021 年广东珠海质量监测)变异链球菌在牙面的黏附、集聚是龋齿发生的先决条件。转基因防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因(PAcA 基因)转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的基因工程疫苗。请回答下列相关问题。
(1)转基因植物的制备：
单一使用 PAcA 基因，机体的免疫应答不理想，霍乱毒素中有增强机体免疫应答的氨基酸序列(CTB)，将 CTB基因与 PAcA 基因连接成嵌合(PAcA-CTB)基因，作为________与 Ti 质粒的 T-DNA 拼接，构建表达载体。用________法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株。
(2)转基因植株目的基因的 PCR 鉴定与检测：
已知 PAcA-CTB 基因部分序列如下(左侧为基因的
5′…CCGTGT……ATGCCT—3′3′…GGCACA……TACGGA—5′
根据上述序列选择引物________(填字母)对目的基因
A.引物：5′－GGCACA－3′B.引物：5′－AGGCAT－3′C.引物：5′－CCGUGU－3′D.引物：5′－CCGTGT－3′
反应结束后，通过电泳检测 PCR 产物，结果如下图(1号来自未转化植株，2 号是含 PAcA-CTB 基因的质粒，3～8 号来自转基因植物)，从结果可以看出，________号植物含有 PAcA-CTB 基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，其可能的原因是______________________________________________。
解析：(1)将 CTB 基因与 PAcA 基因连接成嵌合
(PAcA-CTB)基因，作为目的基因与 Ti 质粒的 T-DNA拼接，构建表达载体。将基因表达载体导入离体的黄瓜叶肉细胞中可以用农杆菌转化法。(2)PCR 技术中，子链合成的方向是从 5′到 3′，因此应该选择引物B、D。1 号来自未转化植株，2 号是含 PAcA-CTB 基因的质粒，3～8 号来自转基因植物，从结果可以看出，3、5、8 号植物含有PAcA-CTB 基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，可能的原因是目的基因(PAcA-CTB 基因)没有转录或转录的 mRNA 没有翻译。
答案：(1)目的基因 农杆菌转化
(2)B、D 3、5、8 目的基因(PAcA-CTB 基因)没有
转录或转录的 mRNA 没有翻译
考向 5 蛋白质工程[典例 5](2021 年河北定州期中)乙烯生物合成酶基因可以控制乙烯的合成，科学家将该基因的反义基因导入番茄细胞内，培育转基因延熟番茄，延长其储藏期。反义基
因的作用机制如下图所示，下列说法错误的是(
A.有意义 mRNA 和反义 mRNA 是通过相应基因转录
B.乙烯生物合成酶基因的模板链的序列与反义基因的
C.乙烯是乙烯生物合成酶基因的表达产物，可促进果
D.因为 mRNA 形成双链后无法进行翻译，所以无乙烯
解析：由题图可以看出，有意义mRNA 和反义mRNA是通过相应基因转录而来的，A 正确。反义 mRNA 能够与有意义 mRNA 进行杂交形成双链，并且有意义 mRNA 和反义 mRNA 是通过相应基因转录而来的，所以乙烯生物合成酶基因的模板链的序列与反义基因的模板链的序列是互补的，B 正确。乙烯生物合成酶基因的表达产物可以控制乙烯的合成，乙烯不是其表达产物，C 错误。翻译过程是以 mRNA 为模板合成蛋白质的过程，题图中两种 mRNA杂交在一起进而阻断了乙烯生物合成酶基因的有意义mRNA 的翻译过程，D 正确。
5.(2020 年山西太原一模)Ⅰ.转基因草莓中有能表达乙肝病毒表面抗原的基因，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，其培育过程如图所示(①至④代表过程，A 至 C代表结构或细胞)。请据图回答问题。
(1)图中①过程用到的酶是__________，所形成的 B 叫
________________。
(2)②过程常用_______处理农杆菌，使之成为_______
细胞，以利于完成转化过程。
(3)图中③过程需要用到的激素有_________________
_________________________。
Ⅱ.黄瓜花叶病毒(CMV)是能侵染多种植物的 RNA 病毒，可危害番茄的正常生长并造成减产，研究人员通过农杆菌介导将该病毒外壳蛋白的 cDNA 导入番茄植株，成功获得抗 CMV 的番茄植株。
(1)获得 CMV 的 RNA 后，需在________的催化下才能
合成 CMV 外壳蛋白的 cDNA。
(2)获得 cDNA 后，需先通过一定方法将其插入农杆菌的________________片段中，然后将番茄子叶切段与该农杆菌共同培养，以实现番茄细胞的转化。
(3)将共同培养后的番茄外植体接种在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上培养一段时间，只有部分外植体生出愈伤组织。研究人员据此确定这些生出愈伤组织的外植体都已成功导入了 cDNA，你认为他们作出以上判断的理由是________________________________________。(4)要想确定转基因番茄已经成功表达出 CMV 外壳蛋
白，需要进行________________实验。
(5)若要验证转基因番茄具有较好的抗 CMV 能力，请写出实验设计思路：_______________________________________________________________________________。转基因番茄自交，子代中抗性植株与敏感植株数量之比接近 3∶1，由此可以得出的结论是______________________
物细胞，常用CaCl2溶液或Ca2＋处理微生物细胞(农杆菌)，
解析：Ⅰ.(1)①表示基因表达载体的构建过程，需用DNA 连接酶将目的基因和运载体(质粒)连接形成重组质粒。B 是基因表达载体，由启动子、终止子、目的基因和标记基因等部分构成。(2)②过程表示将目的基因导入微生
使之成为易于吸收周围环境中 DNA 分子的感受态细胞，以利于重组质粒进入微生物细胞(农杆菌)，完成转化过程。(3)图中③过程为脱分化，需要用到的激素有生长素和细胞分裂素。
Ⅱ.(1)以 RNA 为模板合成 DNA 的过程称为逆转录，该过程需要逆转录酶的催化。(2)农杆菌转化法的原理：农杆菌中的 Ti 质粒上的 T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的 DNA 上，因此获得 cDNA 后，需先通过一定方法将其插入农杆菌 Ti 质粒的 T-DNA 片段中，然后将番茄子叶切段与该农杆菌共同培养，以实现番茄细胞的转化。(3)重组表达载体同时含有卡那霉素抗性基因和青霉素抗性基因，只有成功导入了重组质粒的外植体才能在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上生出愈伤
组织，据此可知生出愈伤组织的外植体都已成功导入了cDNA。(4)检测目的基因是否表达产生相应的蛋白质，需要进行抗原—抗体杂交实验。(5)若要验证转基因番茄具有较好的抗CMV 能力，可用CMV 分别感染转基因番茄与未转基因的番茄，一段时间后观察结果，分析两组番茄的抗性。转基因番茄自交，子代中抗性植株与敏感植株数量之比接近 3∶1，符合基因分离定律，由此可以得出的结论是目的基因已经整合到受体细胞的染色体上，获得的转基因亲本为杂合子。
(2)CaCl2溶液(或Ca2＋) 感受态
答案：Ⅰ.(1)DNA 连接酶 基因表达载体(或重组质粒)
(3)生长素和细胞分裂素Ⅱ.(1)逆转录酶
(2)Ti 质粒的 T-DNA
(3)重组表达载体同时含有卡那霉素抗性基因和青霉素抗性基因，只有成功导入了重组质粒的外植体才能在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上生出愈伤组织
(4)抗原—抗体杂交(5)用 CMV 分别感染转基因番茄与未转基因的番茄，
一段时间后观察结果，分析两组番茄的抗性
经整合到受体细胞的染色体上、获得的转基因亲本为杂合子
考向 6 生物技术的安全性和伦理问题
[典例 6](2018 年河南信阳模拟)生物技术是一把双刃剑，既可以造福人类，也可能因使用不当给人类带来灾难。请回答下列有关生物技术的安全性和伦理性问题。(1)由于科学发展水平的限制，在转基因生物中，有时候会出现一些人们意想不到的后果，引发了人们在食物安全、生物安全和__________安全三个方面的激烈的争论。
(2)在转基因生物或产品研究过程中，绝大多数科学家都能自觉遵守科学研究道德。如对外源 DNA 进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的__________。(3)为解决不孕不育夫妇的生育问题而出现了试管婴儿技术，而 2002 年，英国一对夫妇通过设计试管婴儿，利用新生儿脐带血中造血干细胞，挽救患地中海贫血症的男孩。这两项技术的区别是____________________不需要经过基因检测。
解析：(1)转基因生物的安全性在以下三个问题方面存在争议：食物安全(滞后效应、过敏源、营养成分改变)、生物安全(对生物多样性的影响)、环境安全(对生态系统稳定性的影响)。(2)在转基因生物或产品研究过程中，需对外源 DNA 进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的蛋白质。(3)设计试管婴儿技术是通过体外受精获得许多胚胎，然后从中选择符合要求的胚胎，再经移植后产生后代的技术。
答案：(1)环境 (2)蛋白质 (3)试管婴儿技术
【考向集训】6.(2021 年河北正定中学高二月考) 转基因食品存在“是否安全”的争议，有人认为转基因食品是有害的。比如抗“草甘膦(除草剂)”转基因农作物的种植，使喷洒除草剂的人患癌症。请用已学知识判断以下说法正确的是
A.自古就有“吃啥补啥”的说法，所以吃了转基因食
品，则其中的基因会整合到人的基因组中
B. 严格管理好目的基因和控制好目的基因的表达部
位，则转基因食品的安全性可以得到保障
C.若食用转基因大米，就一定会对人的健康造成危害D.抗除草剂植物生产的食品会导致人患癌症答案：B
7.新冠肺炎在全世界的大流行，使我们对病毒的威力有深刻感受，所以生物武器更是人类要严格禁止的。下列
关于生物武器的说法，不正确的是(
A.生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等B.利用炭疽杆菌制成的生物武器，具有传染性强、死亡率高的特点C.中美两国发布联合声明，重申在一般情况下不发展、不生产、不储存生物武器D.彻底销毁生物武器是世界上大多数国家的共识
解析：生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌等，应当予以禁止，A 正确。利用炭疽杆菌制成的生物武器，具有传染性强、死亡率高、污染面广、难以防治的特点，B 正确。1998 年 6 月 27 日，中美两国元首在关于《禁止生物武器公约》议定书的联合声明中，重申在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散，C 错误。生物武器杀伤力强，彻底销毁生物武器是世界上大多数国家的共识，D 正确。
DNA 的粗提取与鉴定、DNA 片段的
1.DNA 的粗提取与鉴定(1)原理。
2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定(1)原理。
①PCR 原理：DNA 热变性原理。
(2)方法步骤。①PCR 扩增。
②鉴定 PCR 产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
(1)为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5) 观察 DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效
[典例](2021 年山东高考)粗提取DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对含量较高的白色丝状物的处理方式是
A.加入适量的木瓜蛋白酶B.37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精D.加入 NaCl 调节浓度至 2 ml/L→过滤→调节滤液中NaCl 浓度至 0.14 ml/L
解析：木瓜蛋白酶可以水解 DNA 中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对含量较高的白色丝状物，A 正确。37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B 错误。向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中
加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时 DNA 析出，不会进入滤液中，C 错误。加入 NaCl调节浓度至 2 ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至0.14 ml/L，DNA 在 0.14 ml/L 的NaCl 溶液中溶解度小，DNA 析出，不会进入滤液中，D 错误。
【举一反三】在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1 和 R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，不正确
A.该载体最可能为环状 DNA 分子
B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C.限制酶 R1 与 R2 的切点最短相距约 200 bpD.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
解析：当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的 DNA 片段，因此该载体最有可能为环状 DNA 分子，A 正确。当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的 DNA 片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生
考点一 DNA 重组技术的基本工具1.基因工程的概念(1)手段：按照___________，通过__________等技术，
赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生
(3)水平：_______水平。(4)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的______________。
(1) 限制酶的识别序列与被作用的 DNA 序列是不同的。前者一般由 6 个核苷酸组成，少数由 4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。
(2)判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转 180 °，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。
(3)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是
(4)在切割含目的基因的 DNA 分子时，需用限制酶切割两次此 DNA 分子，产生 4 个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶。
3.基因工程的理论基础
4.限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 Sma Ⅰ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用 Pst Ⅰ和 EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组 DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用 Sma Ⅰ切割。
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
考点二 基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的
(2)目的基因的获取方法。
①利用 PCR 获取和扩增目的基因。②人工合成目的基因。
a.反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的 mRNA 为模板，借助逆转录酶合成双链 DNA，其过程如下：
b.化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
③从基因文库中获取目的基因。根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA，以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
(3)利用 PCR 获取和扩增____________。①原理：__________________。②条件：
③过程：PCR 过程包括____________________三步。
结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为
(4)PCR 技术和 DNA 复制的比较。
2.基因表达载体的构建——核心
(1)目的：使目的基因在__________中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)组成。
启动子≠起始密码子 终止子≠终止密码子
(1)启动子是位于基因上游的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因下游的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。
(2)起始密码子和终止密码子均位于mRNA 上，分别控
制翻译过程的启动和终止。
(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入。
第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体 DNA 上；第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
(2)导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体 DNA 上。存在于染色体 DNA 上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程的应用(1)食品工业方面。
生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用
转基因技术大量生产凝乳酶。
①器官移植：用转基因动物作器官移植的________，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
②乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
(1)概念：以蛋白质分子的___________及其与生物功能的关系作为基础，通过_____________基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。(2)操作手段和结果。
3.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
考点四 生物技术的安全性与伦理问题1.转基因产品的安全性
(1)生殖性克隆人面临的伦理问题。①生殖性克隆人“有违人类尊严”。
②生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位
上都不健全的人，严重违反了人类伦理道德。
③克隆技术尚不成熟，面临构建重构胚胎成功率低，胚胎移植到母体子宫后着床率低、流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题。
(2)我国禁止生殖性克隆人。
①中国政府积极支持制定《禁止生殖性克隆人国际公约》，坚决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实验。
②我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不
支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
③我国政府主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审
(4)治疗性克隆和生殖性克隆的比较。
3.试管婴儿与设计试管婴儿的异同点(1)不同点。
①所用技术手段：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断 HLA 的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。
如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了 d 过程：
②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、致命贫血症等疾病的治疗。(2)相同点：都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，
都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
致病能力强，攻击范围广
①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等。②病毒类：天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等。③__________类：肉毒杆菌毒素等。(2)特点：______________________________。(3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。
【基础测评】1.易错诊断(1)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，
使之稳定存在并表达。(
(2)外源 DNA 必在位于重组质粒的启动子和终止子之
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未
(4)应用 DNA 探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植
株中目的基因的存在及其是否完全表达。(
(5)种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植
答案：(1)√ (2)× (3)√ (4)× (5)√
2.下列关于载体的相关叙述，错误的是(
A.目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒B.天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞C.载体 DNA 分子上要有一个至多个限制酶切割位点D.载体上的标记基因有利于筛选含重组 DNA 的细胞答案：B
3.科学家为提高玉米中赖氨酸的含量，计划将天冬氨酸激酶第 352 位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中 104 位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸含量分别提高 5 倍和 2 倍。
A.直接通过分子水平改造蛋白质B.直接改造相应的 mRNAC.直接改造相应的基因D.重新合成新的基因答案：C
考向 1 基因工程所需工具
[典例 1](2021 年全国卷Ⅰ)用 DNA 重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中 4 种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
(1)常用的 DNA 连接酶有 E.cli DNA 连接酶和 T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的 DNA 片段可以用E.cli DNA 连接酶连接。上图中__________ 酶切割后的DNA 片段可以用 T4DNA 连接酶连接。
(2)DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之
间形成的化学键是____________。
(3)DNA 重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒 DNA 分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能__________；质粒 DNA 分子上有______________，便于外源 DNA 插入；质粒 DNA 分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指______________
____________________。
解析：(1)限制酶 EcR Ⅰ和 Pst Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶 Sma Ⅰ和 EcR V 切割形成的是平末端，E.cli DNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于 T4 噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中 EcR Ⅰ和 Pst Ⅰ切割后的DNA 片段(黏性末端)可以用 E.cli DNA 连接酶连接，除了这两种限制酶切割的 DNA 片段，限制酶 Sma Ⅰ和EcR V切割后的 DNA 片段(平末端)也可以用 T4DNA 连接酶连接。(2)DNA 连接酶将两个 DNA 片段连接形成磷酸二酯键。
(3)质粒是小型环状的 DNA 分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒 DNA 分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的 DNA片段，位于基因的上游，它是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
答案：(1)EcR Ⅰ、Pst Ⅰ EcR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和 EcR V(2)磷酸二酯键
一个至多个限制酶切位点
生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞(4)位于基因上游的一段特殊 DNA 序列，是 RNA 聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
1.(2020 年南昌高三一模节选)质粒 A 和质粒 B 各自有一个限制酶 EcR Ⅰ和限制酶 BamHⅠ的识别位点，两种酶切割 DNA 产生的黏性末端不同。限制酶 EcR Ⅰ剪切位置旁边的数字表示其与限制酶 BamHⅠ剪切部位之间的碱基对数(bp)。在含有质粒 A 和 B 的混合溶液中加入限制酶 EcR Ⅰ和 BamHⅠ，令其反应充分；然后，向剪切产物中加入 DNA 连接酶进行反应，再将其产物导入大肠杆
菌中。(实验中不考虑无 ri 的质粒、拥有两个或两个以上ri 的质粒、两个或两个以上质粒同时进入大肠杆菌、三个或三个以上 DNA 片段发生连接)请回答下列问题。
ri：质粒复制原点；tet：四环素抗性基因；amp：氨苄青霉素抗性基因；gfp：基因产物在紫外线照射下可发出绿色荧光；lac：基因控制合成的半乳糖苷酶可以水解乳糖(1)只拥有质粒 A 的大肠杆菌________(填“可以”或“不可以”)在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳元素来源的培养基中生存。说明理由：______________________________________________________________________。
(2)DNA 连接酶进行反应后，存在________种大小不同的质粒，有________种质粒使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存。
(3)绿色荧光蛋白基因是标记基因的一种，标记基因的
功能是________________。
解析：由题图可知，质粒A 含有氨苄青霉素抗性基因和半乳糖苷酶基因，用EcR Ⅰ和BamHⅠ酶切后，形成2000 bp(含 amp)和 1000 bp(含 lac)两段；质粒B 含氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因和绿色荧光蛋白基因，用EcR Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切后，形成 3000 bp(含 amp、gfp)和 2500 bp(含 tet)两段。由题干“两种酶切割DNA 产生的黏性末端不同”可知，酶切后质粒自身两端不能连接。DNA 连接酶进行反应后，由于实验中不考虑无ri 的质粒、拥有两个或两个以上 ri 的质粒、两个或两个以上质粒同
时进入大肠杆菌及三个或三个以上 DNA 片段发生连接，因此可存在 4 种大小不同的质粒，即：①质粒A 两个片段连接 3000 bp(2000 bp＋1000 bp)、②质粒A 含ri 的片段和质粒 B 不含 ri 的片段连接 4500 bp(2000 bp＋2500 bp)、③质粒 A 不含 ri 的片段和质粒 B 含 ri 的片段连接4000 bp(1000 bp＋3000 bp)、④质粒 B 两个片段连接5500 bp(3000 bp＋2500 bp)。有 2 种质粒使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存，即①③。
答案：(1)可以 质粒 A 含有氨苄青霉素抗性基因，使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素的培养基中生存，还含有半乳糖苷酶基因，使大肠杆菌合成半乳糖苷酶，并水解乳糖获得能量和碳源
(3)供重组 DNA 的选择和鉴定
考向 2 PCR 技术的应用
[典例 2](2021 年山东高考)人类γ基因启动子上游调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是________，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要_______种酶。
(2)将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____________________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于____________，理由是____________________________。
解析：(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子 P 的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的 R 端与荧光蛋白基因中限制酶 Mun Ⅰ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有 Mun Ⅰ 和
Xh Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶 Mun Ⅰ和 Xh Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶 EcR Ⅰ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶 Mun Ⅰ识别并切割后的黏性末端与限制酶 EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是 EcR Ⅰ，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 Sal Ⅰ；荧光蛋白基因中含有限制酶 EcR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶
Mun Ⅰ和 Xh Ⅰ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和 Xh Ⅰ切割，对扩增后的产物用限制酶 EcR Ⅰ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，然后在 DNA 连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用 Taq 酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 6 种酶，分别是 Taq 酶、限制酶 EcR Ⅰ、限制酶Sal Ⅰ、限制酶 Mun Ⅰ、限制酶 Xh Ⅰ、DNA 连接酶。(2)受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的
BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要 RNA 聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是 F7 与 R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A 蛋白，BCL11A 蛋白与 BCL11A 蛋白结合位点结
合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F4 与引物 R 之间的序列上；含 F5～F6 与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F5 的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1) Sal Ⅰ EcR Ⅰ 6(2)F7 与 R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达(3)引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段
根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有
结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
获取目的基因方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过 DNA 合成仪利用化学方法直接人工合成。(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，可以通过 PCR 技术扩增目的基因。
2.(2021 年江西南昌四校联考)2019 年 6 月 17 日，新华社报道了屠呦呦及其团队经过多年攻坚，在“抗疟机理研究”“抗药性成因”“调整治疗手段”等方面取得新突破。之后屠呦呦团队提出应对“青蒿素抗药性”难题的切实可行的治疗方案。某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，让青蒿素合成过程的某一关键酶基因 fps 在野生青蒿中过量表达，其过程如图：
(1)图中酶 1 是________，酶 2 是________。利用 PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板 DNA 解链为单链的条件是加热至 90 ℃以上，目的是破坏 DNA 分子中的________键。在构建重组 Ti 质粒的过程中，需将目的基因插入 Ti 质粒的________________。
(2)检验目的基因是否整合到青蒿基因组，可以将放射性同位素标记的________制成基因探针，与青蒿基因组DNA 杂交。理论上，与野生青蒿相比，该探针与转基因青蒿DNA形成的杂交带的量_____(填“较多”或“较少”)。
(3)据图分析，农杆菌的作用是________________________________。为准确判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的________________。
解析：(1)据图示可知，酶 1 促进逆转录的过程，故为逆转录酶，酶 2 用于切割目的基因和质粒，故为限制性内切核酸酶(限制酶)。利用 PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板 DNA 解旋为单链的条件是加热至 90 ℃以上，目的是破坏 DNA 分子中的氢键。构建重组 Ti 质粒的过程中，需将目的基因插入Ti 质粒的T-DNA。(2)检验目的基因是否整合到青蒿基因组，可用 DNA 分子杂交法，即将 fps 基因制成基因探针，与青蒿基因组DNA 杂交。与
野生青蒿相比，该探针与转基因青蒿 DNA 形成的杂交带的量较多。(3)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，由图可知，农杆菌的作用是感染植物，将目的基因转移到受体细胞中。为准确判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量，若产量增高，则说明达到了目的。
答案：(1)逆转录酶 限制酶 氢 T-DNA(2)fps 基因 较多
(3)感染植物，将目的基因转移到受体细胞中 青蒿素
考向 3 基因工程的基本操作程序
[典例 3](2021 年广东高考)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了 4 步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
(1)研究人员采用 PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有________________。(答出两种即可)
(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，方法有__________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有_______________________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将 4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是__________。在分子水平上，可以通过改变__________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了 PCR 技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋白，可根据 DNA 和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受
态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的 DNA 分子。基因工程中，酶基因( 目的基因) 成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原－抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案：(1)基因文库中获取、人工合成法(2)盐析法、酶解法或高温变性(3)感受态 抗原—抗体杂交技术
(4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
3.(2021 年中原名校联盟)某质粒上有 Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题。
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的 DNA 片段，称为________。该方法中农杆菌的作用是_____________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用 Hind Ⅲ和 Sal Ⅰ两种酶的好处是
__________________________________________________
_________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？ ________( 填“是”或“否”)。为什么？__________________________
________________________________________________。(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到 A 培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取 A 上的单个菌落，分别接种
到 B(含氨苄青霉素)和 C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于 B 或 C 上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
答案：(1)Ti 质粒
基因插入到烟草细胞的染色体 DNA 上
自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成
含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破
考向 4 基因工程的应用[典例 4](2020 年和平区二模)用限制酶 EcRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别降解一个 1000 bp(1 bp 即 1 个碱基对)的 DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如下图所示。该 DNA
分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是(
解析：A 选项中的 DNA 用 Kpn Ⅰ单独酶切会得到
600 bp 和 200 bp 两种长度的 DNA 分子，与题意不符，A错误。B 选项中的 DNA 用 Kpn Ⅰ单独酶切会得到600 bp和 400 bp 两种长度的 DNA 分子，与题意不符，B 错误。C 选项中的DNA 用Kpn Ⅰ酶切后得到的DNA 分子是1000 bp，用EcRⅠ单独酶切得到200 bp 和800 bp 两种长度的DNA 分子，用 EcRⅠ、Kpn Ⅰ同时酶切后得到200 bp 和400 bp 两种长度的DNA 分子，与题意相符，C 正确。D 选项中的 DNA 用 Kpn Ⅰ酶切后得到 400 bp 和 600 bp 两种长度的 DNA 分子，与题意不符，D 错误。
4.(2021 年广东珠海质量监测)变异链球菌在牙面的黏附、集聚是龋齿发生的先决条件。转基因防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因(PAcA 基因)转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的基因工程疫苗。请回答下列相关问题。
(1)转基因植物的制备：
单一使用 PAcA 基因，机体的免疫应答不理想，霍乱毒素中有增强机体免疫应答的氨基酸序列(CTB)，将 CTB基因与 PAcA 基因连接成嵌合(PAcA-CTB)基因，作为________与 Ti 质粒的 T-DNA 拼接，构建表达载体。用________法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株。
(2)转基因植株目的基因的 PCR 鉴定与检测：
已知 PAcA-CTB 基因部分序列如下(左侧为基因的
5′…CCGTGT……ATGCCT—3′3′…GGCACA……TACGGA—5′
根据上述序列选择引物________(填字母)对目的基因
A.引物：5′－GGCACA－3′B.引物：5′－AGGCAT－3′C.引物：5′－CCGUGU－3′D.引物：5′－CCGTGT－3′
反应结束后，通过电泳检测 PCR 产物，结果如下图(1号来自未转化植株，2 号是含 PAcA-CTB 基因的质粒，3～8 号来自转基因植物)，从结果可以看出，________号植物含有 PAcA-CTB 基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，其可能的原因是______________________________________________。
解析：(1)将 CTB 基因与 PAcA 基因连接成嵌合
(PAcA-CTB)基因，作为目的基因与 Ti 质粒的 T-DNA拼接，构建表达载体。将基因表达载体导入离体的黄瓜叶肉细胞中可以用农杆菌转化法。(2)PCR 技术中，子链合成的方向是从 5′到 3′，因此应该选择引物B、D。1 号来自未转化植株，2 号是含 PAcA-CTB 基因的质粒，3～8 号来自转基因植物，从结果可以看出，3、5、8 号植物含有PAcA-CTB 基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，可能的原因是目的基因(PAcA-CTB 基因)没有转录或转录的 mRNA 没有翻译。
答案：(1)目的基因 农杆菌转化
(2)B、D 3、5、8 目的基因(PAcA-CTB 基因)没有
转录或转录的 mRNA 没有翻译
考向 5 蛋白质工程[典例 5](2021 年河北定州期中)乙烯生物合成酶基因可以控制乙烯的合成，科学家将该基因的反义基因导入番茄细胞内，培育转基因延熟番茄，延长其储藏期。反义基
因的作用机制如下图所示，下列说法错误的是(
A.有意义 mRNA 和反义 mRNA 是通过相应基因转录
B.乙烯生物合成酶基因的模板链的序列与反义基因的
C.乙烯是乙烯生物合成酶基因的表达产物，可促进果
D.因为 mRNA 形成双链后无法进行翻译，所以无乙烯
解析：由题图可以看出，有意义mRNA 和反义mRNA是通过相应基因转录而来的，A 正确。反义 mRNA 能够与有意义 mRNA 进行杂交形成双链，并且有意义 mRNA 和反义 mRNA 是通过相应基因转录而来的，所以乙烯生物合成酶基因的模板链的序列与反义基因的模板链的序列是互补的，B 正确。乙烯生物合成酶基因的表达产物可以控制乙烯的合成，乙烯不是其表达产物，C 错误。翻译过程是以 mRNA 为模板合成蛋白质的过程，题图中两种 mRNA杂交在一起进而阻断了乙烯生物合成酶基因的有意义mRNA 的翻译过程，D 正确。
5.(2020 年山西太原一模)Ⅰ.转基因草莓中有能表达乙肝病毒表面抗原的基因，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，其培育过程如图所示(①至④代表过程，A 至 C代表结构或细胞)。请据图回答问题。
(1)图中①过程用到的酶是__________，所形成的 B 叫
________________。
(2)②过程常用_______处理农杆菌，使之成为_______
细胞，以利于完成转化过程。
(3)图中③过程需要用到的激素有_________________
_________________________。
Ⅱ.黄瓜花叶病毒(CMV)是能侵染多种植物的 RNA 病毒，可危害番茄的正常生长并造成减产，研究人员通过农杆菌介导将该病毒外壳蛋白的 cDNA 导入番茄植株，成功获得抗 CMV 的番茄植株。
(1)获得 CMV 的 RNA 后，需在________的催化下才能
合成 CMV 外壳蛋白的 cDNA。
(2)获得 cDNA 后，需先通过一定方法将其插入农杆菌的________________片段中，然后将番茄子叶切段与该农杆菌共同培养，以实现番茄细胞的转化。
(3)将共同培养后的番茄外植体接种在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上培养一段时间，只有部分外植体生出愈伤组织。研究人员据此确定这些生出愈伤组织的外植体都已成功导入了 cDNA，你认为他们作出以上判断的理由是________________________________________。(4)要想确定转基因番茄已经成功表达出 CMV 外壳蛋
白，需要进行________________实验。
(5)若要验证转基因番茄具有较好的抗 CMV 能力，请写出实验设计思路：_______________________________________________________________________________。转基因番茄自交，子代中抗性植株与敏感植株数量之比接近 3∶1，由此可以得出的结论是______________________
物细胞，常用CaCl2溶液或Ca2＋处理微生物细胞(农杆菌)，
解析：Ⅰ.(1)①表示基因表达载体的构建过程，需用DNA 连接酶将目的基因和运载体(质粒)连接形成重组质粒。B 是基因表达载体，由启动子、终止子、目的基因和标记基因等部分构成。(2)②过程表示将目的基因导入微生
使之成为易于吸收周围环境中 DNA 分子的感受态细胞，以利于重组质粒进入微生物细胞(农杆菌)，完成转化过程。(3)图中③过程为脱分化，需要用到的激素有生长素和细胞分裂素。
Ⅱ.(1)以 RNA 为模板合成 DNA 的过程称为逆转录，该过程需要逆转录酶的催化。(2)农杆菌转化法的原理：农杆菌中的 Ti 质粒上的 T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的 DNA 上，因此获得 cDNA 后，需先通过一定方法将其插入农杆菌 Ti 质粒的 T-DNA 片段中，然后将番茄子叶切段与该农杆菌共同培养，以实现番茄细胞的转化。(3)重组表达载体同时含有卡那霉素抗性基因和青霉素抗性基因，只有成功导入了重组质粒的外植体才能在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上生出愈伤
组织，据此可知生出愈伤组织的外植体都已成功导入了cDNA。(4)检测目的基因是否表达产生相应的蛋白质，需要进行抗原—抗体杂交实验。(5)若要验证转基因番茄具有较好的抗CMV 能力，可用CMV 分别感染转基因番茄与未转基因的番茄，一段时间后观察结果，分析两组番茄的抗性。转基因番茄自交，子代中抗性植株与敏感植株数量之比接近 3∶1，符合基因分离定律，由此可以得出的结论是目的基因已经整合到受体细胞的染色体上，获得的转基因亲本为杂合子。
(2)CaCl2溶液(或Ca2＋) 感受态
答案：Ⅰ.(1)DNA 连接酶 基因表达载体(或重组质粒)
(3)生长素和细胞分裂素Ⅱ.(1)逆转录酶
(2)Ti 质粒的 T-DNA
(3)重组表达载体同时含有卡那霉素抗性基因和青霉素抗性基因，只有成功导入了重组质粒的外植体才能在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上生出愈伤组织
(4)抗原—抗体杂交(5)用 CMV 分别感染转基因番茄与未转基因的番茄，
一段时间后观察结果，分析两组番茄的抗性
经整合到受体细胞的染色体上、获得的转基因亲本为杂合子
考向 6 生物技术的安全性和伦理问题
[典例 6](2018 年河南信阳模拟)生物技术是一把双刃剑，既可以造福人类，也可能因使用不当给人类带来灾难。请回答下列有关生物技术的安全性和伦理性问题。(1)由于科学发展水平的限制，在转基因生物中，有时候会出现一些人们意想不到的后果，引发了人们在食物安全、生物安全和__________安全三个方面的激烈的争论。
(2)在转基因生物或产品研究过程中，绝大多数科学家都能自觉遵守科学研究道德。如对外源 DNA 进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的__________。(3)为解决不孕不育夫妇的生育问题而出现了试管婴儿技术，而 2002 年，英国一对夫妇通过设计试管婴儿，利用新生儿脐带血中造血干细胞，挽救患地中海贫血症的男孩。这两项技术的区别是____________________不需要经过基因检测。
解析：(1)转基因生物的安全性在以下三个问题方面存在争议：食物安全(滞后效应、过敏源、营养成分改变)、生物安全(对生物多样性的影响)、环境安全(对生态系统稳定性的影响)。(2)在转基因生物或产品研究过程中，需对外源 DNA 进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的蛋白质。(3)设计试管婴儿技术是通过体外受精获得许多胚胎，然后从中选择符合要求的胚胎，再经移植后产生后代的技术。
答案：(1)环境 (2)蛋白质 (3)试管婴儿技术
【考向集训】6.(2021 年河北正定中学高二月考) 转基因食品存在“是否安全”的争议，有人认为转基因食品是有害的。比如抗“草甘膦(除草剂)”转基因农作物的种植，使喷洒除草剂的人患癌症。请用已学知识判断以下说法正确的是
A.自古就有“吃啥补啥”的说法，所以吃了转基因食
品，则其中的基因会整合到人的基因组中
B. 严格管理好目的基因和控制好目的基因的表达部
位，则转基因食品的安全性可以得到保障
C.若食用转基因大米，就一定会对人的健康造成危害D.抗除草剂植物生产的食品会导致人患癌症答案：B
7.新冠肺炎在全世界的大流行，使我们对病毒的威力有深刻感受，所以生物武器更是人类要严格禁止的。下列
关于生物武器的说法，不正确的是(
A.生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂以及经过基因重组的致病菌等B.利用炭疽杆菌制成的生物武器，具有传染性强、死亡率高的特点C.中美两国发布联合声明，重申在一般情况下不发展、不生产、不储存生物武器D.彻底销毁生物武器是世界上大多数国家的共识
解析：生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌等，应当予以禁止，A 正确。利用炭疽杆菌制成的生物武器，具有传染性强、死亡率高、污染面广、难以防治的特点，B 正确。1998 年 6 月 27 日，中美两国元首在关于《禁止生物武器公约》议定书的联合声明中，重申在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散，C 错误。生物武器杀伤力强，彻底销毁生物武器是世界上大多数国家的共识，D 正确。
DNA 的粗提取与鉴定、DNA 片段的
1.DNA 的粗提取与鉴定(1)原理。
2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定(1)原理。
①PCR 原理：DNA 热变性原理。
(2)方法步骤。①PCR 扩增。
②鉴定 PCR 产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
(1)为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
(5) 观察 DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效
[典例](2021 年山东高考)粗提取DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对含量较高的白色丝状物的处理方式是
A.加入适量的木瓜蛋白酶B.37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精D.加入 NaCl 调节浓度至 2 ml/L→过滤→调节滤液中NaCl 浓度至 0.14 ml/L
解析：木瓜蛋白酶可以水解 DNA 中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对含量较高的白色丝状物，A 正确。37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B 错误。向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中
加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时 DNA 析出，不会进入滤液中，C 错误。加入 NaCl调节浓度至 2 ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至0.14 ml/L，DNA 在 0.14 ml/L 的NaCl 溶液中溶解度小，DNA 析出，不会进入滤液中，D 错误。
【举一反三】在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1 和 R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，不正确
A.该载体最可能为环状 DNA 分子
B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C.限制酶 R1 与 R2 的切点最短相距约 200 bpD.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
解析：当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的 DNA 片段，因此该载体最有可能为环状 DNA 分子，A 正确。当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的 DNA 片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生
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