36 2022年高考生物一轮复习（新高考版2(鲁辽)适用） 第十单元 第36讲 微生物的培养技术及应用

这是一份36 2022年高考生物一轮复习（新高考版2(鲁辽)适用） 第十单元 第36讲 微生物的培养技术及应用，共23页。
第36讲　微生物的培养技术及应用
[目标要求]　1.掌握培养基的作用、分类及营养成分。2.区分消毒和灭菌，掌握不同物品的消毒和灭菌方法。3.掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。4.理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。5.概述测定微生物数量的方法。
考点一　微生物的基本培养技术

1．培养基的配制
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
教材中的隐性知识　来源于选择性必修3 P10“旁栏思考”：培养基中加入氮源的原因是培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
(3)种类
①按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
②按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
2．无菌技术
(1)目的：获得纯净的微生物培养物。
(2)关键：防止杂菌污染。
(3)常用方法：灭菌和消毒。
(4)无菌技术的主要方法及适用对象(连线)

教材中的隐性知识　源于选择性必修3 P10“相关信息”：生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。
3．微生物的纯培养
(1)概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
(2)方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
(3)菌落的概念：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
(4)酵母菌的纯培养
制备培养基
(配制培养基、灭菌、倒平板)
↓
接种和分离酵母菌
↓
培养酵母菌
(将接种后的平板和一个未接种的平板倒置、培养)
教材中的隐性知识　源于选择性必修3 P13“结果分析”：如果在未接种的培养基表面有菌落，说明培养基被杂菌污染。

(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(　√　)
(2)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(　√　)
(3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌(　×　)
(4)配制培养基时应先灭菌再调pH(　×　)
(5)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧(　√　)
(6)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　×　)

源于选择性必修3 P12～13“探究·实践”
(1)平板冷凝后，要将平板倒置，原因是可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；避免培养基水分过快挥发。
(2)平板划线法在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，原因是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(3)在接种酵母菌的培养基上，观察到了不同形态的菌落，说明接种的菌种不纯或无菌操作不规范。

1．选择培养基与鉴别培养基的比较
项目
选择培养基
鉴别培养基
制备
方法
培养基中加入某些化学物质
培养基中加入某种指示剂或化学药品
原理
依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好或抗性而设计
产生特定的颜色或其他变化
用途
从众多微生物中分离出所需的微生物
鉴别不同种类的微生物

2．消毒和灭菌的辨析
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理、化学或生物等方法
仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药物消毒法
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理
化方法
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
湿热灭菌(如：高压蒸汽灭菌法)
培养基及容器的灭菌

3.归纳概括平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
项目
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者


考向一　培养基与无菌技术
1．(2020·山西吕梁高三月考)有关培养基配制原则的表述正确的是(　　)
A．任何培养基都必须含有碳源、氮源、矿质元素、水以及无机盐
B．碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素
C．有的培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求
D．营养物质的浓度越高越好
答案　C
解析　培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐和水等营养物质，而分离自生固氮菌的培养基中，不需要加入氮源，A错误；碳源和氮源必须具有一定比例，但碳元素的含量不一定最多，自养型微生物的培养基不需要加入碳源，B错误；营养物质的浓度过高可能会造成微生物渗透失水死亡，D错误。
2．(2018·全国Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______________________。在照射前，适量喷洒____________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________________________。
答案　(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽
考向二　微生物的纯培养
3．如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5，下列说法正确的是(不定项)(　　)

A．操作前要将接种环用酒精消毒
B．划线操作须在酒精灯火焰附近进行
C．只有在5区才可以得到所需菌落
D．在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌
答案　BD
解析　在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在酒精灯火焰上灼烧，不能用酒精消毒；接种时划线操作是在酒精灯火焰附近进行；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落；每次划线前都要灼烧接种环，目的是杀死接种环上原有的微生物(第一次划线前)和上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，划线结束后灼烧接种环以防止污染环境和感染操作者。
4．鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：
(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在_________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为________培养基。
(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是___________________________________________。
(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为___________________。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。

(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

答案　(1)含碳有机物(或脂肪)　碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物　选择　(2)防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染；防止培养基中水分过快挥发　(3)稀释涂布平板法　D　(4)丙　每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落
解析　(1)厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物(或脂肪)。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物，即硫细菌为自养生物，所以要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物。这种人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基为选择培养基。(3)使用涂布器涂布接种微生物的方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法接种的微生物会在培养基上形成均匀分布的菌落，而平板划线法接种的微生物在划线的起始部分菌落连在一起生长，由图可知，A、B、C均形成了均匀分布的单个菌落，属于稀释涂布平板法接种的，而D中菌落是连在一起生长的，是通过平板划线法接种的。
考点二　微生物的选择培养和计数

1．选择培养基
(1)概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
(2)举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一氮源的。
2．稀释涂布平板法步骤
(1)系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：

(2)涂布平板操作步骤


3．微生物的数量测定
(1)利用稀释涂布平板法计数
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对3个平板进行计数，并求平均值。
②统计结果往往比实际值少。
(2)利用显微镜直接计数
①需用细菌计数板或血细胞计数板
②统计结果是活菌数和死菌数的总和。
教材中的隐性知识　源于选择性必修3 P18“相关信息”：血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板常用于相对较小的细菌等的计数。
4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
(2)操作步骤
①土壤取样：土壤中的细菌绝大部分分布在距地表3～8_cm的土壤层(酸碱度接近中性)。
②样品的稀释：为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将细菌稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
③微生物的培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37_℃的温度下培养1～2 d。在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(　×　)
(2)尿素在脲酶的催化作用下分解成无机物(　√　)
(3)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(　×　)
(4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(　√　)
(5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(　×　)
(6)配制培养不同微生物的培养基时都要将培养基调至中性或弱碱性(　×　)
(7)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计(　×　)

(1)(源于选择性必修3 P18“正文”)统计某一稀释度下平板上的菌落数的要求是统计3个菌落数在30～300之间的平板，计算菌落数的平均值。
(2)(源于选择性必修3 P20“拓展应用2”)在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。

1．两种纯化方法的比较
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
分离
结果
　
　　
关键
操作
接种环在固体培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释②涂布平板操作
接种
用具
接种环
涂布器
优点
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
可以计数，可以观察菌落特征
缺点
不能计数
操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点
都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征

2．两种微生物计数方法的比较
项目
间接计数法
(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微镜计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝×M[C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数]
每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大

注：细菌的数目还可以通过滤膜法来测定。
3．微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落
挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择
培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定
培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物

(2)微生物的鉴别方法
菌落特征
鉴别法
根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂
鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色
鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物

4.微生物的分离与计数实验中对照组和重复组的设置及作用
(1)两种对照组的设置及作用
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置至少3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。

考向一　微生物的选择培养
5．以氮源设计选择培养基，下列叙述错误的是(　　)
A．培养基中以尿素为唯一氮源，分离的微生物一定是分解尿素的微生物
B．培养基中以NH3为唯一氮源可分离硝化细菌
C．培养基中无氮源，可分离固氮微生物
D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养细菌后，指示剂变红色，可判断该细菌能分解尿素
答案　A
解析　在以尿素为唯一氮源的培养基中能够生长繁殖的微生物不一定全是分解尿素的微生物，因为自生固氮菌也可以在这种培养基上生存，A错误；培养基中以NH3为唯一氮源可以分离硝化细菌，硝化细菌可利用NH3生成硝酸的过程中释放的能量将CO2和H2O合成糖类，B正确；用缺乏氮源的培养基能够分离固氮微生物，C正确；以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养细菌后，如果pH升高，指示剂变红，可判断该细菌能分解尿素，D正确。
6．土壤有“微生物的天然培养基”之称，如图表示对土壤中某种微生物进行分离和计数而进行的对样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图。请据图回答有关问题：

(1)图示统计样品活菌数目的方法叫作_________法，主要包括________操作和________操作。
(2)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的________，一般选择菌落数在________的平板进行计数。
(3)图中选择了104、105、106、107倍的稀释液进行平板培养，最可能是测定土壤中________的数量，这个平板需要将pH调至________、在________的恒温培养箱中培养1～2 d。
答案　(1)稀释涂布平板　梯度稀释　涂布平板　(2)一个活菌　30～300　(3)细菌　中性或弱碱性　30～37 ℃
解析　(1)据图分析，图示为稀释涂布平板法进行活菌计数，这一方法主要包括梯度稀释操作和涂布平板操作。(2)当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。(3)测定土壤中细菌的数量一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养，还需要将pH调至中性或弱碱性、在30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
考向二　微生物的数量测定
7．下列有关统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是(　　)
A．利用血细胞计数板，在显微镜下可以准确计算出一定体积的样品中活菌的数量
B．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌
C．活菌计数法是通过统计平板上的菌落数，推测出样品中大约含有多少个活菌
D．为保证活菌计数法的结果准确，通常选用一定稀释范围的样品进行培养
答案　A
解析　利用血细胞计数板，在显微镜下可以快速直观地测定微生物的数量，但显微镜直接计数法无法区分死菌和活菌，A错误；当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落，B正确；活菌计数法是通过统计平板上的菌落数，推测出样品中大约含有多少个活菌，C正确；为保证活菌计数法的结果准确，在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品进行培养，D正确。
8．分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试对分解尿素的微生物进行分离与计数。请回答下列问题：
(1)分解尿素的微生物能产生________酶；配制培养基时应以________作为唯一氮源。
(2)该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是__________________________；然后将1 mL样液稀释10 000倍，在3个平板上用涂布法分别涂布0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为39、42和45。据此可得出每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数为________个。
(3)微生物的培养与观察
①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养____________和培养________。
②观察：每隔24 h统计一次________数目，最后选取菌落数目________时的记录作为结果。
答案　(1)脲　尿素　(2)检测平板灭菌是否合格　4.2×106　(3)①温度　时间　②菌落　稳定
解析　(1)分解尿素的微生物能产生脲酶；配制培养基时应以尿素作为唯一氮源。(2)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，其目的是检测平板灭菌是否合格。每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数＝某一稀释度下培养基上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数＝(39＋42＋45)÷3÷0.1×10 000＝4.2×106(个)。(3)不同种类的微生物，在培养时往往需要不同的培养温度和培养时间，在培养过程中，可以每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。










1．核心概念
(1)(选择性必修3 P9)培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)(选择性必修3 P10)消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
(3)(选择性必修3 P10)灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(4)(选择性必修3 P12)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
(5)(选择性必修3 P16)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．教材结论性语句
(1)(选择性必修3 P18)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(2)(选择性必修3 P18)同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。

1．(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)

A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
答案　B
解析　温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A项错误；由题图可见，随着划线次数增多，细菌密度减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B项正确；菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C项错误；刚果红与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D项错误。
2．(2020·山东，20)野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上补充相应氨基酸才能生长。将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，均不会产生菌落。某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落出现。该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是(　　)
A．操作过程中出现杂菌污染
B．M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸
C．混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质
D．混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变
答案　B
解析　据题意可知，甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独培养时均不会在基本培养基上出现菌落，两者混合培养一段时间后，再接种在基本培养基中却出现菌落，除了操作过程中出现杂菌污染，杂菌在基本培养基上生长形成菌落的原因以外，还可能的原因是菌株获得了对方的遗传物质，或菌株中已突变的基因再次发生突变，使突变菌株能产生所需的氨基酸，而变成了非依赖型菌株，从而能在基本培养基上生长形成菌落，A、C、D项正确；M、N菌株混合培养一段时间，稀释涂布到基本培养基上后，培养出现的菌落是由单个细菌形成的，菌落中不可能有M、N菌株同时存在而互为对方提供所缺失的氨基酸，故B项错误。
3．(2020·浙江7月选考，19)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是(　　)
A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH
C．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
D．适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化
答案　A
解析　以尿素为唯一氮源的固体培养基是选择培养基，让能利用尿素的微生物生长，其他微生物不能生长，但不能迅速杀死其他微生物，A项错误；不同微生物生长的适宜pH不同，如培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将培养基的pH调至中性或微碱性，B项正确；酵母菌酿酒时直接利用的物质是葡萄糖，因此酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒，C项正确；醋酸发酵时，适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化，较高浓度的酒精会抑制醋酸菌的活化，D项正确。
4．(2020·江苏，31)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。
编号
①
②
③
④
物品
培养基
接种环
培养皿
涂布器
灭菌方法
高压蒸汽
火焰灼烧
干热
臭氧

(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经________________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌____________个。
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，理由是_____________。

答案　(1)④
(2)梯度稀释　4.6×105(或460 000)
(3)诱变　脂肪　较大
(4)B　该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
解析　(2)利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行梯度稀释，以获得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数在30～300个的平板最适于计数。0.1 mL菌悬液中含有46个酵母菌落，则1 mL菌悬液中含有460个酵母菌落；1.0 g土壤样品首先稀释100倍，然后稀释10倍，共稀释了1 000倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌460×1 000＝4.6×105(个)。(3)采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪(碳源)多，直径小的说明产酶能力弱，利用的脂肪(碳源)少。(4)通过分析题图可知，相同时间内，菌株B细胞密度大，说明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B利用的脂肪多，脂肪剩余量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。
5．(2020·全国Ⅰ，37)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。

回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用__________________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是__________________________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：______________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即________________________________________________________________。
答案　(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐
解析　(1)微生物培养过程中，培养基的灭菌通常采用高压蒸汽灭菌的方法。乙培养基为固体培养基，因此培养基中加入的是可使液体培养基凝固的琼脂。甲、乙两种培养基都是为了分离出可降解S的细菌，因此是选择培养基。(2)设稀释倍数为A,1 mL＝1 000 μL，可得(2×107/A)×0.1≤200，则A≥104。(3)在筛选降解S物质的细菌的过程中，如果培养基中的S浓度过高，会导致细菌培养基的渗透压增大，细菌失水而代谢活性降低，对S的降解量反而下降(或者S改变了培养基的pH，导致细菌代谢活性降低)。(4)测定淤泥中能降解S的细菌细胞数的主要步骤是①淤泥取样，即取少量的淤泥加入无菌水中；②用稀释涂布平板法涂布到乙培养基上；③微生物培养与观察计数。(5)培养基中含有细菌生长所需要的4类基本营养物质，即水、碳源、氮源、无机盐。
6．(2019·全国Ⅱ，37)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题：
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择______菌落进一步纯化，选择的依据是____________
________________________________________________________________________。

(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加__________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________________________________。
答案　(1)W　(2)乙　乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W　(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源　(4)①缓冲液　②缓冲液不能降解W　酶E与天然酶降解W的能力相近
解析　(1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。(2)题图信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
课时精练
一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。
1．(2020·山东威海文登高三期末)如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1、2、3、4、5，下列操作方法错误的是(　　)

A．每次划线操作后要将接种环放在火焰上灼烧灭菌
B．划线操作应在超净工作台上进行
C．第3次划线操作可从第2次开始划出，也可从第1次开始
D．在第4次划线区域中也可以得到菌落
答案　C
解析　结合题干信息，划线的顺序为1、2、3、4、5，平板划线过程要保证每次划线的菌种来自上一次划线的末端，C错误。
2．(2020·辽宁丹东高二期末)关于消毒和灭菌的方法，描述不正确的是(　　)
A．接种用的超净工作台要进行灭菌处理
B．经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，所以不能在常温下长期保存
C．煮沸半小时后的凉开水中仍含有部分芽孢和孢子
D．对接种环灼烧灭菌后，要等其温度下降再进行接种
答案　A
解析　接种用的超净工作台用紫外线消毒处理，A错误；巴氏消毒法不能杀灭所有的微生物，因此经巴氏消毒法处理的食品不能在常温下长期保存，B正确；煮沸仅杀死物体表面或内部一部分微生物，不能杀死全部芽孢和孢子，C正确；对接种环灼烧灭菌后，要等其温度下降再进行接种，以防温度过高杀死微生物，D正确。
3．在对自然样品(如土壤)中微生物细胞数进行评估时，显微镜直接计数法得到的菌体数远远大于平板计数法得出的菌体数。出现上述异常的原因不包含(　　)
A．一种培养基和培养条件不能符合全部微生物的生长需求
B．培养时间较短时，平板上的菌落数目没有达到最大值
C．平板上两个或多个细胞连在一起形成一个菌落
D．显微镜直接计数能逐一对细胞进行统计，比平板计数精确
答案　D
解析　由于一种培养基和培养条件不能符合全部微生物的生长需求，所以显微镜直接计数得到的菌体数大于平板计数得到的菌体数，A不符合题意；利用平板计数法，由于培养时间较短，平板上的菌落数目没有达到最大值，可能造成显微镜直接计数得到的菌体数大于平板计数得到的菌体数，B不符合题意；平板上两个或多个细胞连在一起形成一个菌落，造成显微镜直接计数得到的菌体数大于平板计数得到的菌体数，C不符合题意；显微镜直接计数不能区分死菌和活菌，所以其精确度不比平板计数高，D符合题意。
4．某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素等配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)，实验的主要步骤如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)

A．培养基中加入化合物A作为唯一碳源，目的是筛选目的菌
B．实验培养过程中进行振荡培养，可使目的菌和培养液充分接触
C．实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是防止杂菌污染
D．将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是获得大量菌种
答案　D
解析　本实验的目的是“筛选到能高效降解化合物A的细菌”，因此培养基中加入化合物A作为唯一碳源，目的是筛选目的菌，A正确；实验培养过程中进行振荡培养，可使目的菌和培养液充分接触，B正确；实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是防止杂菌污染，C正确；将固体培养基得到的目的菌重复多次题述实验的目的是对菌种“纯化”，D错误。
5．(2020·江苏苏锡常镇调研)如图表示采用富集方法从土壤中分离能降解对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列有关叙述不正确的是(　　)

A．该实验所用的器具、培养基均需灭菌处理
B．①→②→③重复培养能提高目的菌的比例
C．④→⑤的培养过程可以纯化并计数目的菌
D．⑥⑦的培养基中都应含有对羟基苯甲酸
答案　D
解析　⑥与⑦形成对照，其中一组加入对羟基苯甲酸，另一组不加，故D错。
二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。
6．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，对该实验有关的叙述错误的是(　　)
A．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
B．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
C．设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D．统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数估计值
答案　BD
解析　用稀释涂布平板法测定同一样品中的细菌数时，为了保证结果准确，在同一稀释度下，应至少涂布3个平板，确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的平板进行计数，然后求其平均值，再通过计算得出土壤中的细菌总数，A正确，B、D错误；设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度，C正确。
7．消毒和灭菌是微生物培养中常用的操作方法。下列说法不正确的是(　　)
A．微生物接种技术的方法不同，但核心都是要防止杂菌污染，保证培养物的纯度
B．在100 ℃条件下煮沸5～6分钟属于灭菌方法，可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢
C．无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
D．高压蒸汽灭菌锅只有当压力表的压力降到一个标准大气压时，才能打开盖子
答案　BCD
解析　微生物接种技术的方法不同，但核心都是要防止杂菌污染，保证培养物的纯度，A正确；在100 ℃条件下煮沸5～6分钟属于煮沸消毒法，B错误；无菌技术中，若处理对象为液体，可以用湿热灭菌法进行灭菌，C错误；高压蒸汽灭菌锅只有当压力表的压力降到0时，才能打开盖子，D错误。
三、非选择题
8．蓝纹奶酪是成熟过程中内部生长蓝绿霉菌的一类奶酪的总称，又称为青纹奶酪。回答下列问题：
(1)蓝纹奶酪的原材料为牛奶，使用的消毒法为________________。
(2)蓝纹奶酪制作所用的初级发酵剂为乳酸菌，初级发酵过程中不需要严格灭菌，原因是_______________________。
(3)实验室分离培养类地青霉通常使用马铃薯琼脂培养基，该培养基一般用______________法灭菌。
(4)在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有____________、____________和高压蒸汽灭菌。
(5)灭菌结束后，待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰旁将培养基倒入灭菌后的培养皿中，这个操作称为________。此过程还需要将锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是________________________________________________________________________。
答案　(1)巴氏消毒法　(2)缺氧和较低pH的环境可以抑制其他细菌的生长繁殖　(3)高压蒸汽灭菌　(4)灼烧灭菌　干热灭菌　(5)倒平板　防止瓶口微生物污染培养基
解析　(1)牛奶使用巴氏消毒法消毒。(2)乳酸菌进行无氧呼吸产生乳酸，发酵液处于缺氧和较低pH的环境中，这样可以抑制其他杂菌的生长繁殖，故蓝纹奶酪制作所用的初级发酵剂为乳酸菌，初级发酵过程中不需要严格灭菌。(3)类地青霉属于真菌，实验室分离培养类地青霉通常使用马铃薯琼脂培养基，培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌。
9．(2020·贵州遵义模拟)油烟由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到某品牌食用油产生的油烟污染的土壤中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示，回答下列问题：

(1)图中①→③的过程称为________，其目的是_________________________________
________________________________________________________________________。
(2)该同学将③中的微生物培养液接种到培养基④之前，进行了梯度稀释，制成稀释倍数分别为101、102、103的不同稀释度的样品液，分别吸取0.1 mL样品液涂布于培养基上。每个稀释倍数的样品液涂布三个培养基，最终形成的菌落的数目如表所示：
培养基编号
稀释倍数
甲
乙
丙
101
168
172
170
102
12
14
19
103
2
3
6

应选择稀释倍数为________的培养基进行计数，稀释前每毫升菌液中含有油烟降解菌的数目为________个，这种计数方法统计的结果往往会比显微镜直接计数的结果小，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)在⑤的固体培养基中应加入该品牌食用油，其作用是__________________________。培养基常用的灭菌方法是____________________________________________________。
答案　(1)选择培养　初步筛选出能降解油烟的微生物，并增大其浓度　(2)101　1.7×104　该方法只是统计活菌数量，并且当两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落　(3)为微生物提供碳源和能源　高压蒸汽灭菌法
解析　(1)分析图解可知，图中①→③的培养过程中加入某品牌食用油作为唯一碳源，能够初步筛选出能降解油烟的微生物，因此称为选择培养。(2)利用稀释涂布平板法对微生物进行计数时选择菌落数在30～300的培养基进行计数，结合表格数据可知，应选择稀释倍数为101的培养基进行计数，稀释前每毫升菌液中含有油烟降解菌的数目＝(168＋172＋170)÷3÷0.1×101＝1.7×104(个)。该方法只是统计活菌数目，并且当两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落，因此这种计数方法统计的结果往往会比显微镜直接计数的结果偏小。(3)在⑤的固体培养基中应加入该品牌食用油，其作用是为微生物提供碳源和能源。培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。
10．(2020·天津高三三模)分析有关微生物的资料，回答问题。
牙周炎是一种细菌感染性疾病，有效地抑制牙周致病菌就能很好地阻止牙周炎的发生和发展。目前公认的牙周致病菌主要有牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线放线杆菌(Aa)和粘性放线菌(Av)，其中，Pg和Aa是专性厌氧菌，Av是兼性厌氧菌。
(1)下图中4支试管分别代表4种微生物在半固体培养基(琼脂含量3.5 g/L)中的生长状态，其中代表Pg和Av生长状态的试管分别是________和________。

(2)将3种致病菌进行培养后，划线接种到培养基上，置于厌氧袋内37 ℃恒温培养6～8 d。图中正确显示培养结果的平板是________。

(3)现对羧甲基壳聚糖(CMCS)能否抑制牙周致病菌的生长进行研究。配制1%CMCS培养基、2%CMCS培养基(成分有：CMCS、马铃薯、葡萄糖、琼脂和自来水)和空白对照组培养基(不含CMCS，其他成分相同)。分别挑取经纯化培养的3种细菌的单个菌落，用无菌水稀释，制成菌悬液，再分别接种于3种培养基上，置于厌氧袋内37 ℃恒温培养。测量3种致病菌在不同培养基中的菌落直径，数据见下表。

项目
菌落直径
Pg
Aa
Av
空白对照组
2.54
3.25
1.67
1%CMCS培养基
2.16
2.51
1.30
2%CMCS培养基
－
1.12
－

哪些数据和现象可以证明CMCS能抑制牙周致病菌的生长？
①________________________________________________________________________；
②________________________________________________________________________。
答案　(1)丙　乙　(2)D　(3)三种致病菌的菌落直径均比空白对照的小　CMCS的抑菌能力随浓度增大而增强
解析　(1)根据题意可知，Pg是专性厌氧菌，只会集中在试管底部，即代表Pg生长状态的试管为丙；Av是兼性厌氧菌，会在试管中均匀分布，因此代表Av生长状态的试管是乙。(2)分析图中培养皿A、B、C中菌落均匀分布，均为利用稀释涂布平板法接种，D为利用平板划线法接种，故选D。(3)综合实验现象和表中信息可知，三种致病菌的菌落直径均比空白对照的小，且CMCS的抑菌能力随浓度增大而增强，这些数据和现象都可以证明CMCS能抑制牙周致病菌的生长。
11．回答以下关于微生物的培养和发酵的问题：
(1)某中学生物兴趣小组在进行A细菌的培养过程中，发现了另一种B细菌，在B细菌周围A细菌的生长繁殖受到抑制，这有可能是B细菌产生了不利于(抑制)A细菌生存的物质。现在请你在以下实验的基础上，继续完成验证A细菌生长繁殖受到抑制的原因的实验过程：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
______________________ (用序号、文字和箭头作答)。

(2)上图示培养基中加入了凝固剂(或琼脂)，致使该培养基属于____________。培养微生物前，所用培养基一般需采用________________法进行灭菌，接种微生物常用的方法有________________和____________________，其中后者也可用于微生物的计数。
答案　(1)④去除步骤③中培养皿里的B细菌并保留培养基→⑤再接种A细菌→⑥培养一段时间→⑦观察A细菌的生长情况(答案合理即可)　(2)固体培养基　高压蒸汽灭菌　平板划线法　稀释涂布平板法(后两空答案顺序不可颠倒)
解析　(1)在去除B细菌的培养基上再接种A细菌，可根据A细菌的生长情况来验证是否是B细菌产生了不利于A细菌生存的物质。(2)固体培养基中一般需加入琼脂。一般培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法，接种微生物的常用方法为平板划线法和稀释涂布平板法，其中只有稀释涂布平板法可用于微生物的计数。