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高中浙科版 (2019)第四章 基因工程第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性说课ppt课件
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这是一份高中浙科版 (2019)第四章 基因工程第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性说课ppt课件，共40页。PPT课件主要包含了基因工程的基本工具，一获取目的基因，从基因文库获得，获取方法，①化学合成法，逆转录法，那什么是表达载体呢，克隆载体表达载体等内容，欢迎下载使用。
第2课时 基因工程的基本操作步骤1
限制性内切核酸酶、DNA连接酶、载体
基因工程的基本操作步骤
获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。
原核细胞基因与真核细胞基因的结构异同
外显子、内含子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA(图4-9)。
（2）目的基因的序列已知：
（1）目的基因的序列未知：
1、目的基因：人们所需要的基因。如：人的胰岛素基因、植物的抗病基因等
与载体连接导入受体菌群
（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）
借助载体建立基因文库①基因组文库：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。
（1）目的基因序列未知
②构建cDNA文库：从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA 。最后，借助载体，利用与构建基因组文库相同的方法构建cDNA文库.
由于基因的选择性表达，不同组织细胞的cDNA文库是不同的，同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。例如，胰岛素基因的cDNA只能在由胰岛B细胞建立的cDNA文库中找到。
该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因(含有不表达的内含子，这样获得的基因在原核生物体内不能表达)转移到原核生物中去。所以此方法不适合获得真核生物目的基因的编码序列。
基因文库的构建——直接分离法（或鸟枪法）
根据已知氨基酸序列直接合成DNA
（2）目的基因序列已知
：将核苷酸按照特定顺序一个一个地连接起来。此方法成本较高，适于合成序列较短的基因.
②利用PCR技术扩增目的基因
原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。
②聚合酶链式反应技术(PCR技术)（已知序列)原理： DNA半保留复制特点：简便、快速、灵敏。应用：医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面。模板：待扩增的DNA分子。原料：4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。酶：耐高温TaqDNA聚合酶。引物（前提）：在体外根据目的基因的核苷酸序列人工合成的两段短的单链DNA ，分别可以与两条DNA模板链复制起始端互补配对成小段双链。
过程：包括多次循环，每个循环分为3个步骤。变性：模板DNA双链在高温下(90~95℃)氢键断裂，解旋成2条DNA单链。退火：温度降低(50~60℃)后，2个引物分别与各自互补的DNA单链结合。延伸：分别以两条DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸为原料，耐高温的TaqDNA聚合酶在适宜的温度(约72℃)下，以引物与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链。
扩增特点：重复循环多次，DNA呈指数形式扩增。扩增DNA片段的起点和终点由2个引物决定产物鉴定利用电泳技术鉴定
PCR技术具有简便、快速、灵敏的特点,已广泛应用于医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面。下图表示PCR的前三个循环,目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间,请据图回答下列问题。
a.PCR技术扩增过程
1.细胞内DNA复制时是否需要引物?为什么?提示 需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链,只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3'端,所以细胞内DNA复制时需要引物。2.PCR过程中,如果两种引物之间互补序列较长,会有什么样的结果?提示 可能会导致在退火过程中,引物之间相互结合,从而使引物不能很好地与模板DNA链结合。3.PCR过程中,退火的目的是什么?提示 使2个引物分别与各自互补的DNA单链结合。
4.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗?提示 不是,PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。5.经过第几轮扩增后,扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端?比例是多少?提示 第三轮。1/4。6.如果已知某目的基因的序列和结构,利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么?提示 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
[归纳提升]PCR技术与细胞内DNA复制的比较
【微思考】 本实验能不能达到对DNA片段进行提纯的目的?如何实现?提示 能。观察到电泳结果后,可将含有目的DNA条带的凝胶用刀片切割下来,回收凝胶中的DNA,从而达到提纯的目的。
例题1.实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增,下列相关叙述正确的是( )A.温度在90~95 ℃时DNA的磷酸二酯键断开B.引物与模板结合后向5'方向延伸C.反应过程包括变性→退火→延伸D.需要解旋酶和耐高温的Taq DNA聚合酶
例题2.下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析,下列叙述错误的是( )A.①过程所需的原料是脱氧核苷酸B.②过程所需的酶不需耐高温C.③过程需要解旋酶破坏氢键D.④过程的引物对之间不能互补配对
该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。核酸是带负电荷的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。电泳时常使用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用；凝胶浸没于电泳缓冲液中。电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的PH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移。 DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的。DNA本身是无色的，可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。 含有DNA条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA，从而达到提纯的目的。核酸分子大小采用碱基对数进行描述。DNA相对分子质量标准物（DNA Marker）是一组已知长度的和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物。不同的DNA Marker所含的DNA片段的长度和含量是不同的。
b.利用电泳技术鉴定PCR扩增产物
（二）、构建重组DNA分子--核心
①用一定的限制酶切割表达载体（质粒），使其出现一个切口，露出黏性末端。②用同一种限制酶切断目的基因DNA片段，使其产生同样的黏性末端。③将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。
利用表达载体构建重组DNA分子----核心
如何构建重组DNA分子？
克隆载体：用于大量扩增外源DNA的载体。 目的：克隆基因可以获得大量的DNA分子，不仅用于基因诊断、法医鉴定、判断物种亲缘关系等研究工作，还可以用于指导合成大量稀有的蛋白质产物，如胰岛素、干扰素和抗癌药物等。
为什么要构建重组DNA分子？
许多外源DNA片段自身很难在受体细胞内成功复制，需要与含有复制起点的DNA分子相连
表达载体：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。表达载体包含适当的转录和翻译信号。
复制原点：复制的起始点启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
基因表达载体的组成：复制原点+启动子+终止子+标记基因
【微思考】 克隆载体上是否一定有转录和翻译信号?表达载体上是否具有复制信号?提示 克隆载体用于扩增外源DNA,含有复制起点,可以不含有转录和翻译信号。表达载体既能扩增目的基因,又能表达出相应的蛋白质,因此既含有复制起点,又含有转录和翻译信号。
课堂检测1.利用表达载体构建重组DNA分子是基因工程操作的第二步。判断下列有关构建重组DNA分子描述的正误。(1)一个完整的表达载体由标记基因、起始密码子、终止密码子和复制起点等组成。( )(2)标记基因不一定是抗生素抗性基因。( )(3)构建重组DNA分子时,必须使用同一种限制酶分别切割表达载体和含有目的基因的DNA片段。( )(4)重组DNA分子的复制和目的基因的表达均启动于复制起点。( )(5)目的基因必须位于重组质粒的启动子的“上游”或终止子的“下游”才能进行表达。( )
例题3.下列有关含有人胰岛素基因的重组DNA分子的叙述,正确的是( )A.人胰岛素基因可通过人肝细胞中的mRNA逆转录获得B.重组DNA分子的复制开始于启动子C.人胰岛素基因必须插入启动子与终止子之间D.启动子和终止密码子均在人胰岛素基因的转录中起作用
重组DNA分子（重组质粒）
思考：得到的一定是重组DNA分子吗？
用ＤＮＡ 连接酶连接时，可形成３ 种不同的连接物：
导入受体细胞后，可利用抗性基因的差异进行筛选
目的基因—载体连接物载体—载体连接物（自身环化）目的基因—目的基因连接物（自身环化）
思考：如何防止质粒或目的基因自身环化呢？
基因两端用不同的限制性核酸内切酶切割，并用同样的酶切割质粒
在构建重组DNA分子时,用同种限制酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体,然后用DNA连接酶将它们连接起来,形成重组DNA分子。在实际操作过程中可出现下图所示情况,据图回答问题。
“单酶切法”和“双酶切法”
1.黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接?3与4呢?为什么?此现象说明“单酶切法”具有什么缺点?提示 均能。因为同一种限制酶切割后形成的黏性末端互补(相同)。此现象说明“单酶切法”会导致质粒和目的基因的自身环化。2.黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接?此现象说明“单酶切法”具有什么缺点?提示 均能。说明“单酶切法”会导致质粒与目的基因反向连接。3.如何避免以上问题?提示 使用两种限制酶分别对目的基因和质粒进行切割(目的基因的两侧和质粒上含有这两种限制酶的酶切位点),且两种限制酶产生的黏性末端不同(不互补),这样能有效地避免质粒与目的基因的反向连接以及自身环化。
[归纳提升]选择限制酶的方法
(1)根据目的基因两端的限制酶酶切位点确定限制酶的种类①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)切割。
(2)根据质粒的特点来确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为表达载体必须具有标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。(3)在重组DNA分子中,启动子应位于目的基因的首端,终止子应位于目的基因的尾端,这样目的基因才能表达,即酶切位点应位于启动子与终止子之间。
例题3.图甲、乙分别表示质粒和外源DNA,其中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列相关叙述正确的是( )
A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中,不能使用SmaⅠ切割B.图甲所示的质粒分子在经SmaⅠ切割后含有4个游离的磷酸基团C.为获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入DNA聚合酶D.用EcRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以
例题4.在构建重组DNA分子时,需要选择合适的限制酶去切割表达载体和目的基因所在的DNA分子。下列相关叙述错误的是( )A.可以选择同一种限制酶分别切割表达载体和目的基因所在的DNA分子B.可以选择能产生相同末端的两种限制酶分别切割表达载体和目的基因所在的DNA分子C.可以选择一种限制酶切割表达载体,另一种限制酶(产生的黏性末端与前一种不同)切割目的基因所在的DNA分子D.构建重组DNA分子时,除了要用到限制性内切核酸酶之外,还要用到DNA连接酶
第2课时 基因工程的基本操作步骤1
限制性内切核酸酶、DNA连接酶、载体
基因工程的基本操作步骤
获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。
原核细胞基因与真核细胞基因的结构异同
外显子、内含子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA(图4-9)。
（2）目的基因的序列已知：
（1）目的基因的序列未知：
1、目的基因：人们所需要的基因。如：人的胰岛素基因、植物的抗病基因等
与载体连接导入受体菌群
（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）
借助载体建立基因文库①基因组文库：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。
（1）目的基因序列未知
②构建cDNA文库：从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA 。最后，借助载体，利用与构建基因组文库相同的方法构建cDNA文库.
由于基因的选择性表达，不同组织细胞的cDNA文库是不同的，同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。例如，胰岛素基因的cDNA只能在由胰岛B细胞建立的cDNA文库中找到。
该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因(含有不表达的内含子，这样获得的基因在原核生物体内不能表达)转移到原核生物中去。所以此方法不适合获得真核生物目的基因的编码序列。
基因文库的构建——直接分离法（或鸟枪法）
根据已知氨基酸序列直接合成DNA
（2）目的基因序列已知
：将核苷酸按照特定顺序一个一个地连接起来。此方法成本较高，适于合成序列较短的基因.
②利用PCR技术扩增目的基因
原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。
②聚合酶链式反应技术(PCR技术)（已知序列)原理： DNA半保留复制特点：简便、快速、灵敏。应用：医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面。模板：待扩增的DNA分子。原料：4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。酶：耐高温TaqDNA聚合酶。引物（前提）：在体外根据目的基因的核苷酸序列人工合成的两段短的单链DNA ，分别可以与两条DNA模板链复制起始端互补配对成小段双链。
过程：包括多次循环，每个循环分为3个步骤。变性：模板DNA双链在高温下(90~95℃)氢键断裂，解旋成2条DNA单链。退火：温度降低(50~60℃)后，2个引物分别与各自互补的DNA单链结合。延伸：分别以两条DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸为原料，耐高温的TaqDNA聚合酶在适宜的温度(约72℃)下，以引物与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链。
扩增特点：重复循环多次，DNA呈指数形式扩增。扩增DNA片段的起点和终点由2个引物决定产物鉴定利用电泳技术鉴定
PCR技术具有简便、快速、灵敏的特点,已广泛应用于医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面。下图表示PCR的前三个循环,目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间,请据图回答下列问题。
a.PCR技术扩增过程
1.细胞内DNA复制时是否需要引物?为什么?提示 需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链,只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3'端,所以细胞内DNA复制时需要引物。2.PCR过程中,如果两种引物之间互补序列较长,会有什么样的结果?提示 可能会导致在退火过程中,引物之间相互结合,从而使引物不能很好地与模板DNA链结合。3.PCR过程中,退火的目的是什么?提示 使2个引物分别与各自互补的DNA单链结合。
4.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗?提示 不是,PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。5.经过第几轮扩增后,扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端?比例是多少?提示 第三轮。1/4。6.如果已知某目的基因的序列和结构,利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么?提示 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
[归纳提升]PCR技术与细胞内DNA复制的比较
【微思考】 本实验能不能达到对DNA片段进行提纯的目的?如何实现?提示 能。观察到电泳结果后,可将含有目的DNA条带的凝胶用刀片切割下来,回收凝胶中的DNA,从而达到提纯的目的。
例题1.实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增,下列相关叙述正确的是( )A.温度在90~95 ℃时DNA的磷酸二酯键断开B.引物与模板结合后向5'方向延伸C.反应过程包括变性→退火→延伸D.需要解旋酶和耐高温的Taq DNA聚合酶
例题2.下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析,下列叙述错误的是( )A.①过程所需的原料是脱氧核苷酸B.②过程所需的酶不需耐高温C.③过程需要解旋酶破坏氢键D.④过程的引物对之间不能互补配对
该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。核酸是带负电荷的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。电泳时常使用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用；凝胶浸没于电泳缓冲液中。电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的PH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移。 DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的。DNA本身是无色的，可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。 含有DNA条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA，从而达到提纯的目的。核酸分子大小采用碱基对数进行描述。DNA相对分子质量标准物（DNA Marker）是一组已知长度的和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物。不同的DNA Marker所含的DNA片段的长度和含量是不同的。
b.利用电泳技术鉴定PCR扩增产物
（二）、构建重组DNA分子--核心
①用一定的限制酶切割表达载体（质粒），使其出现一个切口，露出黏性末端。②用同一种限制酶切断目的基因DNA片段，使其产生同样的黏性末端。③将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。
利用表达载体构建重组DNA分子----核心
如何构建重组DNA分子？
克隆载体：用于大量扩增外源DNA的载体。 目的：克隆基因可以获得大量的DNA分子，不仅用于基因诊断、法医鉴定、判断物种亲缘关系等研究工作，还可以用于指导合成大量稀有的蛋白质产物，如胰岛素、干扰素和抗癌药物等。
为什么要构建重组DNA分子？
许多外源DNA片段自身很难在受体细胞内成功复制，需要与含有复制起点的DNA分子相连
表达载体：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。表达载体包含适当的转录和翻译信号。
复制原点：复制的起始点启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
基因表达载体的组成：复制原点+启动子+终止子+标记基因
【微思考】 克隆载体上是否一定有转录和翻译信号?表达载体上是否具有复制信号?提示 克隆载体用于扩增外源DNA,含有复制起点,可以不含有转录和翻译信号。表达载体既能扩增目的基因,又能表达出相应的蛋白质,因此既含有复制起点,又含有转录和翻译信号。
课堂检测1.利用表达载体构建重组DNA分子是基因工程操作的第二步。判断下列有关构建重组DNA分子描述的正误。(1)一个完整的表达载体由标记基因、起始密码子、终止密码子和复制起点等组成。( )(2)标记基因不一定是抗生素抗性基因。( )(3)构建重组DNA分子时,必须使用同一种限制酶分别切割表达载体和含有目的基因的DNA片段。( )(4)重组DNA分子的复制和目的基因的表达均启动于复制起点。( )(5)目的基因必须位于重组质粒的启动子的“上游”或终止子的“下游”才能进行表达。( )
例题3.下列有关含有人胰岛素基因的重组DNA分子的叙述,正确的是( )A.人胰岛素基因可通过人肝细胞中的mRNA逆转录获得B.重组DNA分子的复制开始于启动子C.人胰岛素基因必须插入启动子与终止子之间D.启动子和终止密码子均在人胰岛素基因的转录中起作用
重组DNA分子（重组质粒）
思考：得到的一定是重组DNA分子吗？
用ＤＮＡ 连接酶连接时，可形成３ 种不同的连接物：
导入受体细胞后，可利用抗性基因的差异进行筛选
目的基因—载体连接物载体—载体连接物（自身环化）目的基因—目的基因连接物（自身环化）
思考：如何防止质粒或目的基因自身环化呢？
基因两端用不同的限制性核酸内切酶切割，并用同样的酶切割质粒
在构建重组DNA分子时,用同种限制酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体,然后用DNA连接酶将它们连接起来,形成重组DNA分子。在实际操作过程中可出现下图所示情况,据图回答问题。
“单酶切法”和“双酶切法”
1.黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接?3与4呢?为什么?此现象说明“单酶切法”具有什么缺点?提示 均能。因为同一种限制酶切割后形成的黏性末端互补(相同)。此现象说明“单酶切法”会导致质粒和目的基因的自身环化。2.黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接?此现象说明“单酶切法”具有什么缺点?提示 均能。说明“单酶切法”会导致质粒与目的基因反向连接。3.如何避免以上问题?提示 使用两种限制酶分别对目的基因和质粒进行切割(目的基因的两侧和质粒上含有这两种限制酶的酶切位点),且两种限制酶产生的黏性末端不同(不互补),这样能有效地避免质粒与目的基因的反向连接以及自身环化。
[归纳提升]选择限制酶的方法
(1)根据目的基因两端的限制酶酶切位点确定限制酶的种类①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)切割。
(2)根据质粒的特点来确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为表达载体必须具有标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。(3)在重组DNA分子中,启动子应位于目的基因的首端,终止子应位于目的基因的尾端,这样目的基因才能表达,即酶切位点应位于启动子与终止子之间。
例题3.图甲、乙分别表示质粒和外源DNA,其中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列相关叙述正确的是( )
A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中,不能使用SmaⅠ切割B.图甲所示的质粒分子在经SmaⅠ切割后含有4个游离的磷酸基团C.为获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入DNA聚合酶D.用EcRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以
例题4.在构建重组DNA分子时,需要选择合适的限制酶去切割表达载体和目的基因所在的DNA分子。下列相关叙述错误的是( )A.可以选择同一种限制酶分别切割表达载体和目的基因所在的DNA分子B.可以选择能产生相同末端的两种限制酶分别切割表达载体和目的基因所在的DNA分子C.可以选择一种限制酶切割表达载体,另一种限制酶(产生的黏性末端与前一种不同)切割目的基因所在的DNA分子D.构建重组DNA分子时,除了要用到限制性内切核酸酶之外,还要用到DNA连接酶
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