专题32 基因工程(选修3)教师版

这是一份专题32 基因工程(选修3)教师版，共22页。
专题32基因工程
考点
知识内容
考试属性及要求
加试
一、基因工程
1.工具酶的发现和基因工程的诞生
2.基因工程的原理和技术
3.基因工程的应用
4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案
a
b
a
c
一、基因工程的含义与工具
1、基因工程的诞生条件
基因工程诞生的理论基础：DNA是生物遗传物质的发现；DNA双螺旋结构的确立；遗传信息传递方式的认定(中心法则的确定和遗传密码的破译)。
基因工程诞生的技术保障：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、质粒载体的发现与应用。
2、基因工程与遗传工程
基因工程是狭义的遗传工程。广义的遗传工程泛指把一种生物的 遗传物质 (细胞核、染色体、脱氧核糖核酸等)移到另一种生物的 细胞 中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中 表达 。
最大的基因工程——基因图 人类基因组有“生命登月计划”之称，它的内容是破译人类细胞核内的23对染色体约6至10万个基因，约30亿个碱基。这项工程包括绘制每个人体细胞中10万多个基因的位置，确定30亿个化学单位(核苷酸)的精确次序。这是一项规模巨大，投资最多的生物工程。
3、基因工程的核心是 构建重组DNA分子 。
4、基因工程的工具
（1）限制性核酸内切酶(限制酶)
①来源：主要是从 微生物 (如细菌)中分离纯化出来的。迄今为止已从300多种不同微生物中分离出约4000多种限制酶。
②本质： 蛋白质
③切割化学键：识别并切开每条链中两个相邻脱氧核苷酸之间的 磷酸二酯键 。
④作用及特点：催化作用，用于DNA分子的切割，可重复利用，具有专一性(特异性)，识别双链DNA分子内一小段特殊的 核苷酸序列 ，在特定位点切割。
⑤结果：形成 粘性末端 或 平末端 。粘性末端是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的；平末端是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处将DNA的两条链分别切开形成的。
拓展：①限制酶所识别的序列，大多由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成，无论哪种序列，都可找到一条中轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的回文序列。
②限制酶是一类酶而不是一种酶，如限制性核酸内切酶BamH I、EcoR I等。
③不同限制酶识别和切割的位点不同，这与酶的专一性一致。
④将目的基因从DNA分子中切割出来需要消耗4分子水，形成4个末端，一个目的基因含有2个末端。
⑤用相同限制酶切割不同DNA分子产生相同的末端；同一种DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不同。
⑥限制酶可作为切割DNA分子的手术刀，它的发现和应用使DNA重组成为可能。(N代表任意碱基)
限制性核酸内切酶
识别位点
产生的末端类型
Bbu I

3’端突出的粘性末端
Sfi I

3’端突出的粘性末端
EcoR I

5’端突出的粘性末端
Hind Ⅲ

5’端突出的粘性末端
Not I

5’端突出的粘性末端
Sau3A I

5’端突出的粘性末端
Alu I

平末端
Hpa I

平末端
（2）DNA连接酶
①功能：将具有 末端碱基互补 的2个DNA片段连接起来。
将两个来源不同的DNA用相同的限制性核酸内切酶切割，形成相同的粘性末端。DNA连接酶能催化磷酸与脱氧核糖之间的化学键的形成，将两个DNA末端的缝隙“缝合”起来。(形成 磷酸二酯键 )
②种类：根据DNA连接酶的来源，可分为两类：
常用类型
E•coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
连接粘性末端
连接粘性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
③两个不同来源的DNA片段，是通过 氢键的弱作用力 连接在一起的。
将两个具有匹配粘性末端的片段混合，它们之间通过碱基配对作用结合在一起，这过程称为退火。
DNA连接酶无识别特异性，凡两个粘性末端(或平末端)能互补配对，DNA连接酶就能催化其相互缝合，其活性发挥受温度、pH等因素的影响。
（3） 最常见的载体——质粒
载体是必需的工具，却不是酶，通常利用灭活的病毒DNA或者质粒DNA分子作为载体。
A.载体应具备的特征
①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因。
②有1个或多个限制性核酸内切酶切点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，如(抗性基因)以便进行筛选。
B.载体的种类
①最常用的载体：来源于细菌和酵母菌等微生物中 质粒 ，最常用 大肠杆菌的质粒 。
②实质：质粒是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体外的，并且能够 自主复制 的双链环状DNA分子，是一种特殊的遗传物质，在细菌中以独立于 拟核 之外的方式存在。
③其他载体： λ噬菌体 、植物病毒和动物病毒等。
一般来说天然的载体往往不能满足人们的所有要求，因此人们根据不同目的和需求，对某天然的载体进行人工改造。
C.作用 ①用作运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去；
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
D.质粒与宿主的关系：质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
[诊断与思考]
(1)一种限制性核酸内切酶一般只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列。(　√　)
(2)可以用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸。(　×　)
(3)基因工程是在细胞水平上对DNA进行设计和施工。(　×　)
(4)限制性核酸内切酶是一段有一定核苷酸序列的DNA。(　×　)
(5)限制性核酸内切酶切开的是DNA双链间的氢键。(　×　)
(6)DNA连接酶可以将具有相同末端碱基的DNA片段连接在一起。(　×　)
(7)用限制性核酸内切酶切割DNA，可以得到很多相同DNA片段。(　×　)
(8)质粒是能够自主复制得链状DNA。(　×　)



二、基因工程的操作步骤
1、 获取目的基因
（1）目的基因：人们所需要的特定基因，主要是指编码蛋白质的结构基因，即基因操作中需要的外源基因。如：人的胰岛素基因、干扰素基因、植物的抗病基因等。
（2）获取方法：
①从供体细胞中直接获得；②从基因文库中获取；③利用mRNA反转录形成；④利用PCR扩增技术获取⑤人工合成。
若序列未知：建立一个包括目的基因在内的 基因文库 ，再从基因文库中获取；
若序列已知：用 化学方法合成 或者用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。
（3）PCR技术与DNA复制的比较
比较内容
PCR技术
DNA复制
相
同
点
原理
DNA双链复制(碱基互补配对)
原料
四种游离的脱氧核苷酸
条件
模板、酶、能力等
不
同
点
解旋方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场所
体外
主要在细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶
细胞内含有的DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的DNA片段
形成整个DNA分子
（4）人工合成目的基因的途径
逆转录
碱基互补
配对原则
①逆转录法
以从细胞中提取分离出来的mRNA为模板，mRNA 单链DNA 双链DNA(目的基因)
②根据蛋白质中氨基酸序列合成目的基因
推测出
推测出
通过化学方法合成

根据蛋白质中氨基酸序列 mRNA中碱基序列 DNA碱基序列 目的基因








（5）比较几种目的基因的获取方法
方
法
基因文库的构建
PCR扩增技术
人工合成
基因组文库
部分基因文库
方法
选择
对基因的核苷酸序列完全不知
提取到基因转录产物mRNA
只有少量样本DNA时
已知蛋白质的氨基酸序列
过


程

优
点
操作简单
专一性
可在短时间内大量扩增目的基因
专一性强，可产生自然界中不存在新基因
缺
点
工作量大、盲目性大
专一性差
操作过程较麻烦
技术要求过高
需要严格控制温度
技术要求高
适用范围小

基因库：属于遗传范畴，是指一个生物种群的全部等位基因的总称。
基因文库的含义：基因文库文库属于基因工程范畴，指将含有某种生物不同基因的许多DNA片段导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因文库的分类：
①基因组文库：包含一种生物所有基因的文库。
②部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因的文库，如cDNA文库。
cDNA文库：由某种生物发育的某个时期的信使RNA反转录产生的DNA称为互补DNA(即cDNA)，将这些cDNA片段与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体群体就叫做这种生物的cDNA文库。
cDNA文库和基因组文库的区别
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
小
大
基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)
无
有
基因中内含子
(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
问题1 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方法。如果所需的目的基因序列已知，就可以通过PCR方法从含有该基因的生物的DNA中直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或想得到一种生物的全部基因组序列，往往就需要构建基因文库。
问题2 你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？
1970年，特朗和巴尔的摩证实了RNA病毒中含有一种能将RNA转录成DNA的酶，这种酶被称为依赖RNA的DNA聚合酶，由于与中心法则中的从DNA到RNA的转录是反向的所以称为反转录酶。
反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板，合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶以5’→3’方向合成DNA，如图。

cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA降解，使之变成单链DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
2、 形成重组DNA分子(基因工程的核心)

（1） 通常用 相同的 限制性核酸内切酶分别切割含有目的基因的供体DNA分子和载体(如质粒)，使其产生 相同的 粘性末端，然后用DNA连接酶将两者连接在一起，形成重组DNA分子。但有时用不同的限制性核酸内切酶处理也可以获得 相同的粘性末端 。
（2） 目的基因的插入可能会破坏转基因生物原有基因的结构，影响转基因生物的正常生长，甚至死亡。
（3） 限制性核酸内切酶只识别 双链DNA分子 中特定核苷酸序列，对RNA不起作用。
（4） 用 DNA连接酶 连接时，可形成3种不同的连接物：目的基因－载体连接物 、载体－载体连接物 、目的基因－目的基因连接物 ，导入受体细胞后，可利用抗性基因的差异进行筛选。
拓展：①构建重组DNA分子时，用一种限制性核酸内切酶(单酶切)分别切割目的基因与载体是最简单的一种方法，因为切割后能产生相同的粘性末端或平末端，末端之间能发生碱基互补配对而形成重组DNA分子，操作简单，但连接后会出现两种不需要的连接产物(目的基因—目的基因连接物、载体—载体连接物)，加大了筛选的工作量。所以可以用两种不同限制性核酸内切酶(双酶切)分别切割含有目的基因的DNA片段和载体(质粒)，这样可以防止目的基因与载体自身连接的产物，克服同种酶切的缺点。
②重组DNA分子的组成：启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。
目的基因是指编码蛋白质的结构基因，没有启动子，若只将目的基因导入受体细胞中无法转录。
目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒插入目的基因时需有启动子，插入后需有终止子。
目的基因是否导入受体细胞中需要有筛选标记——标记基因。
因此，一个重组DNA分子的组成至少应该包括：启动子、目的基因、终止子、标记基因。
3、将重组DNA分子导入受体细胞
常用的受体细胞： 大肠杆菌 、 枯草杆菌 、 酵母菌 和 动植物细胞 等。
将目的基因导入受体细胞并在受体细胞中表达称为转化。
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
氯化钙处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→导入农杆菌→侵染植物细胞→目的基因稳定维持和表达
将重组DNA分子提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
氯化钙处理细菌细胞→细菌细胞壁通透性增加→重组DNA分子进入宿主细胞
注意：①导入微生物细胞(如大肠杆菌)：用CaCl2处理大肠杆菌，目的是增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组DNA分子进入受体细胞。CaCl2只能处理微生物的细胞，不能处理植物细胞。
②目的基因导入受体细胞前，都必须将目的基因与载体结合构建重组DNA分子，不能直接导入目的基因。
③将重组DNA分子导入受体细胞是基因工程步骤中唯一不涉及碱基互补配对的操作步骤。
④利用微生物作为受体细胞的主要原因是个体微小，代谢旺盛，繁殖速度快，获得目的基因产物多。
4、筛选含有目的基因的受体细胞
（1）筛选原因：并不是所有的细胞都接纳了重组DNA分子。
（2）筛选原理：质粒上有抗生素如四环素的抗性基因，所以含有这种重组质粒的受体细胞就能在含有四环素的培养基上生长，而没有接纳重组质粒的细胞不能在这种培养基上生长，这样就能筛选出含有重组DNA分子的受体细胞。(质粒上有四环素抗性基因——标记基因)
（3）筛选方法：利用选择培养基筛选。
根据标记基因所控制的性状，筛选出含有目的基因的受体细胞方法有很多，如：①如果是抗性基因，可直接用选择培养基进行筛选，存活的就是含有目的基因的受体细胞；②根据菌落的颜色、形状也可以判断。
抗生素抗性基因与抗生素基因不同，前者用于合成相关产物，对抗抗生素，后者用于合成抗生素，一般质粒上用于筛选的标记基因都是抗生素抗性基因，如四环素抗性基因。
（4）在实际应用中还有：
①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。
②检测是否转录出了mRNA，利用核酸分子杂交技术，目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。
（5）拓展：目的基因的检测与鉴定
（1） 检测与鉴定的目的和方法
由于各种因素的影响，目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才知道。
目的基因的检测与鉴定常用的方法是分子杂交技术。
（2） 目的基因检测与鉴定的方法比较
类型
步骤
检测内容
方法
结构显示
分
子
杂
交
导入
检测
检测是否
插入目的基因
DNA分子杂交技术
(DNA和DNA之间)
目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带
表达
检测
检测是否
转录出了mRNA
DNA分子杂交技术
(DNA和mDNA之间)
目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带
检测目的基因是否翻译成蛋白质
蛋白质分子杂交
(抗原—抗体杂交技术)
抗原与抗体进行杂交，看是否有杂交带
个体
水平
鉴定
╲
包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同。
注意：①DNA分子杂交用的是碱基互补配对原则，可见基因组DNA、探针DNA都被处理成了单链；②探针就是用放射性同位素等标记的含目的基因的单链DNA片段；③目的基因的检测与鉴定都是在体外进行的。
5、目的基因的表达
目的基因在 宿主细胞 中表达，看到目的性状或产生人们需要的目的基因表达产物。
①检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。
②个体生物学水平的鉴定：如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
[诊断与思考]
(1)目的基因的获取一定要用限制性核酸内切酶处理。(　×　)
(2)构建重组质粒需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与。(　×　)
(3)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(　×　)
(4)重组DNA分子是由目的基因和载体连接在一起构成的。(　√　)
(5)将目的基因和质粒连接在一起的重组DNA导入大肠杆菌中，大肠杆菌一定接纳了重组DNA分子。(×)
(6)每个重组质粒至少含有一个限制性核酸内切酶识别的位点。(　√　)
(7)将重组DNA分子导入受体细胞中，并筛选出含有重组DNA分子的受体细胞，基因工程就完成了。(×)
三、基因工程的应用
1、 基因工程与遗传育种
（1） 传统育种技术与转基因技术的比较
项目
传统育种技术
转基因技术
相同点
获得优良基因、进行遗传改良
不
同
点
操作对象
整个基因组
特定基因
操作水平
个体水平
分子水平
变异特点
不定向的，后代表现预见性较差
定向的，后代表现预见性较好
育种时间
较长
较短
亲缘关
系影响
种内个体间基因转移，一般需有较近的亲缘关系
不受亲缘关系影响，可克服远缘杂交的不亲和性

（2）转基因植物
A.培育优点：①所需时间较短；②克服 远缘亲本难以杂交 的缺陷；③定向改造生物的性状。
B.转基因植物的产生过程:


C.利用转基因改良植物的品质
（1） 改良品质的途径
①直接导入控制所需性状的结构蛋白基因。
②导入与该性状有关的某种酶的基因或者改变关键酶的活性。
（2） 主要改良品种(如下表)
主要改良品种
基因转移方法
转基因高赖氨酸玉米
将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米细胞
转基因延熟番茄
将控制番茄果实成熟的基因导入番茄
转基因矮牵牛
将与植物花青素代谢有关的基因导入矮牵牛
转基因烟草苗
将萤火虫的发光基因导入烟草
（3）转基因植物类型（更多资料见重难点手册P20）
转基因植物类型
外源基因类型及举例
成果举例
抗虫转基因植物
抗虫基因：杀虫蛋白基因(Bt毒蛋白基因)、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因
抗害虫的转基因棉、番茄、烟草、马铃薯、水稻和杨树等
抗病毒
转基因植物
抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因
抗病毒的转基因烟草、番茄、苜蓿和马铃薯
抗除草剂
转基因植物
抗除草剂基因
抗除草剂的转基因烟草、番茄和马铃薯
抗逆转基因植物
抗逆基因：调节细胞渗透压的基因、抗冻蛋白基因
抗盐碱抗旱的烟草、抗寒的番茄
改良品种的
转基因植物
优良性状基因：耐贮存基因、与植物花青素代谢有关的基因
耐贮存的转基因番茄、新花色矮牵牛

（3）转基因动物
①定义：转基因动物指转入了 外源基因 的动物。
②培育优点：省时、省力。


③转基因动物的实例：

目的基因
作用
受体生物
说明
提高动物
生长速度
生长激素基因
促进生长
提高生长速率
鲤鱼 绵羊
不能导入生长素基因
转基因动
物生产药物
药用蛋白基因
通过分泌乳汁来生产所需的药品
牛 山羊
如抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等
转基因动
物作器官
移植的供体
抗原决定基因
①抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因②不能合成相应抗原
猪
为什么选猪作为供体：①其内脏构造、大小、血管分布与人极为相似；②体内隐藏的致病病毒要远远少于灵长类
改善畜产
品的品质
动物基因工程只要改善畜产品的品质，而不是产生体型巨大的个体。

2、 基因工程与疾病治疗
（1）常见的基因工程药物
名称
成分
用途
传统方法
基因工程方法
胰岛素
蛋白质
治疗胰岛素依赖型(IDDM)糖尿病
从猪和羊的胰腺中提取
通过大肠杆菌生产
干扰素
糖蛋白
治疗病毒性肝炎和肿瘤(具有抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节等多种生物学功能)
从人血
液中提取
通过基因工程，使人白细胞干扰素基因获得克隆和表达
乙型肝炎疫苗
肝炎病毒的
蛋白质外壳
预防乙型肝炎
——
通过基因工程利用酵母菌和哺乳动物细胞生产
（2）基因诊断和基因治疗
A.基因诊断
①方法：DNA分子杂交法(即DNA探针法)，该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
②步骤：抽取病人的组织或体液作为化验样品；将样品中的DNA分离出来；用化学法或热处理法使样品DNA解旋；将事先制作好的DNA探针引入化验样品中，这些已知的经过标记的探针能够在化验样品中找到互补链，并与之结合(杂交)在一起，找不到互补链的DNA探针，则可以被洗脱。这样通过对遗留在样品中的标记过的DNA探针进行基因分析，就能检出病人所得的病。
B.基因治疗
①基因治疗指的是向目标细胞引入 正常的基因 ，以 纠正或补偿 基因的缺陷，达到治疗的目的。
②原理：利用正常基因纠正或补偿基因的缺陷的方案，即把正常基因导入患者体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，而原有缺陷基因一般不作处理。
③方法：有体外基因治疗和体内基因治疗，体外基因治疗方法疗效较好。如重度免疫缺陷症的体外基因治疗方法：

体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因。
3、基因工程与生态环境保护
（1）利用转基因植物生产聚羟基烷酯，用于合成可降解的新型塑料。
（2）改造分解石油的细菌，提高其分解石油的能力。
（3）利用转基因微生物吸收环境中的重金属，降解有毒化合物和处理工业废水。
4、基因工程的发展前景
①光合作用：科学家希望利用基因工程技术，影响有关酶的活性，提高栽培作物的光合作用效率。
②生物固氮：科学家希望通过固氮基因工程技术，将固氮细菌的固氮基因转移到非豆科农作物中去。
③生物反应器：科学家希望利用动植物作为生物反应器生产价格低廉的蛋白质药物。
④蛋白质工程：对天然蛋白质进行改造，以获得具有理想生物学功能的蛋白质。
以基因工程为核心的现代生物技术将会成为未来的领头产业，并将对人类的生产和生活产生巨大影响。

1、基因工程技术也称DNA重组技术，其实施必须具备的4个必要条件是(   )。
A．工具酶、目的基因、载体、受体细胞
B．重组DNA、RNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶
C．模板DNA、信使RNA、质粒、受体细胞
D．目的基因、限制性内切酶、载体、受体细胞
解析 基因工程是按照人们的意愿，把一种生物的个别基因(目的基因)复制出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞(受体细胞)里，定向地改造生物的遗传性状。基因操作的工具酶是限制性内切酶和DNA连接酶，基因进入受体细胞的运输工具是载体。答案A
2、下列有关限制性核酸内切酶识别的叙述，不正确的是（　　） 
A.从反应类型来看，限制性核酸内切酶催化的是一种水解反应
B.限制性核酸内切酶的活性会受温度、pH等外界条件的影响
C.一种限制性核酸内切酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核苷酸序列
D.限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越小
解析 限制性核酸内切酶是能够识别和切割 DNA 分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。其作用的对象是磷酸二酯键并使其断裂，是水解反应，酶的活性受温度、 pH 的影响，一种酶只能识别一种特定的序列，序列越短，出现该序列的概率就越大。 答案：D
3、人类B型血友病属于伴X隐性遗传病，因为血液中缺少凝血因子Ⅸ导致凝血异常。下列关于对患者进行基因治疗的设计，正确的是（　　）
A.逆转录病毒的核酸可直接用作载体 B.需将凝血因子Ⅸ和载体连接起来
C.必须把目的基因插入到X染色体 D.需选择患者自身细胞作为受体细胞
解析 A.逆转录病毒的核酸用作载体，必需具备一定的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来；故A错误。
B.需将凝血因子Ⅸ相关的基因和载体连接起来形成基因表达的载体；故B错误。
C.目的基因只要在受体细胞中使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的；故C错误。
D.需选择患者自身细胞作为受体细胞；故D正确。
4、下列有关基因工程叙述错误的是（  ）
A.最常用的载体是大肠杆菌的质粒
B.工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶
C.该技术人为地增加了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换
D.基本原理是DNA具有双螺旋结构以及遗传信息传递和表达方式相同
解析 大肠杆菌的质粒是基因工程中最常用的载体，A项正确；限制性核酸内切酶和DNA连接酶是基因工程中常用的工具酶，B项正确；通俗地说，基因工程就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向改造生物的遗传性状，因此该技术人为地增加了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换，C项正确；基因工程的基本原理是基因重组，DNA具有双螺旋结构以及遗传信息传递和表达方式相同是基因工程赖以完成的基础，D项错误。
5、嗜热土壤芽胞杆菌产生的β-葡萄糖苷酶（BglB）是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，利用大肠杆菌表达BglB酶开展了以下试验：
（1）PCR扩增BglB基因时，选用         基因组DNA作模板。
（2）上图为质粒限制性核酸内切酶酶切图谱。BglB基因不含图中限制性核酸内切酶识别序列。为使PCR扩增的BglB基因重组进该质粒，扩增的BglB基因两端需分别引入 和 不同限制酶的识别序列。
（3）大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为：

（4）下列有关限制性核酸内切酶的叙述，正确的是( 　 )
A.用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B.限制性核酸内切酶识别的序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C.－CATG↓－ 和 －G↓GATCC－序列被限制酶切出的粘性末端碱基数不同
D.只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
（1）嗜热土壤芽孢杆菌 （2）Nde I  BamH I
（3）转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶 （4）B
解析 （1）根据题意可知，嗜热土壤芽胞杆菌产生的β-葡萄糖苷酶（BglB），因此PCR扩增BglB基因时，选用嗜热土壤芽孢杆菌基因组DNA作模板。
（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于XbaI在质粒不止一个酶切位点，因此为使PCR扩增的BglB基因重组进该质粒，扩增的BglB基因两端需分别引入NdeI和BamH I不同限制酶的识别序列。
（3）大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶。
基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。 启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。
6、在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前，利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题： 
（1）人体内合成前胰岛素原的细胞是 ，合成胰高血糖素的细胞是 。 
（2）可根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的 序列，用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体。再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成 的基因工程菌。 
（3）用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，则用该工程菌进行工业发酵时，应从 中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。
（1）胰岛素β细胞 胰岛素α细胞 （2）DNA 胰岛素原 （3）菌体
（1）人体合成前胰岛素原的细胞是胰岛素β细胞 ，合成胰高血糖素的细胞是胰岛素α细胞。（2）用蛋白质工程生产胰岛素时，需根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的脱氧核苷酸序列(目的基因)，然后再构建胰岛素原基因重组表达载体，导入细菌细胞内，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立稳定合成胰岛素原的工程菌。（3）运用抗原—抗体检测法检测胰岛素原时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，故应从菌体中分离、纯化胰岛素原。
7、科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答问题：


（1）步骤①和②中常用的工具酶是                     和                  。
（2）图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因，经过①和②步骤后，有些质粒上的            基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。
（3）步骤③是                                         的过程，为了促进该过程，应该用            处理大肠杆菌。
（4）步骤④：将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养，目的是筛选      ，能在C中生长的大肠杆菌有        种。
（5）步骤⑤：用无菌牙签挑取C上的单个菌落，分别接种到D（含氨苄青霉素和四环素）和E（含四环素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示，含目的基因的菌落位于           （D、E）上。请在图中相应的位置上圈出含目的基因的菌落。

（1）限制性核酸内切酶   DNA连接酶
（2）氨苄青霉素抗性基因
（3）将重组质粒（目的基因）导入大肠杆菌（受体细胞）  CaCl2溶液
（4）含四环素抗性基因的大肠杆菌（含抗性基因的大肠杆菌给分，但回答含目的基因的大肠杆菌不给分）    2
（5）E
8、下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：

 
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用 两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过 酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_____________态的大肠杆菌。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中 。
（3）若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为 ，对于该部位，这两种酶 （填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。
（4）若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得  种大小不同的DNA片段。
（1）BclI和HindⅢ  连接  感受 （2）四环素 引物甲和引物丙
（3）  都不能 （4）7
解析 （1）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamH I可能使质粒中启动子丢失，因此只能选Bcl I和Hind Ⅲ。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于感受态的大肠杆菌。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，根据质粒上的抗性基因，应在筛选平板培养基中添加四环素。PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链。
（3）根据BamH I和Bcl I的酶切位点，BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，与两种酶的酶切位点均不同。
（4）根据BamH I、Bcl I和Sau3A I的酶切位点，Sau3A I在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
9、将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如图所示（注：农杆菌中Ti质拉上只有T-DNA片段能转移到植物细胞中）。

（1） 过程①需用同种 酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用含有 物质的 培养基。
（2）过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，目的是让 进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还需转到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是 。
（3）若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加 激素以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是 。
（4）检验转基因棉的抗虫性状，在个体水平上常用的方法是 。种植转基因抗虫棉能减少 的使用，以减轻环境污染。
（1）限制性核酸内切酶 卡那霉素 选择 （2）T-DNA 筛选获得T-DNA片段的植物细胞
（3）细胞分裂素浓度 顶芽端合成的生长素向基部运输，促进根的分化 （4）投放棉抗虫 农药
（1）用同种限制性核酸内切酶切割质粒和含目的基因的DNA，可获得相同的粘性末端，以构建基因表达载体。重组质粒含完整的卡那霉素抗性基因，故使用含卡那霉素的选择培养基筛选含重组质粒的农杆菌。（2）实验过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，其目的是利用含重组质粒的农杆菌将T-DNA导入棉花细胞中。除去农杆菌后在含卡那霉菌的培养基上培养，其目的是筛选出含有目的基因的棉花细胞。（3）培养基中生长素用量与细胞分裂素用量比值高时，利于根的分化，抑制芽的形成，反之，有利于芽的分化，抑制根的形成。因芽顶端可合成生长素，故接种在无激素的培养基上的芽也能长根。（4）可用投放棉铃虫的方法检测抗虫棉的抗虫效果。转基因抗虫棉的种植可以减少农药使用量，从而减少环境污染。
10、干扰素是治疗癌症的重要药物，它必须从血液中提取，每升人血中只能提取0.5μg，所以价格昂贵。美国加利福尼亚的某生物制品公司用如下方法(如图所示)生产干扰素。试分析其原理和优点。


（1）从上述方式中可以看出该公司生产干扰素运用的方法是(   )
A．个体间的杂交       B．基因工程 C．蛋白质工程       D．器官移植
（2）从人的淋巴细胞中取出干扰素基因，一般是用______________的方法，此基因在基因工程中称为______________。用______________可使获得的基因迅速扩增。
（3）此基因与细菌的质粒结合构建基因表达载体要用 处理基因和质粒特定核苷酸的 ，使两者露出相同的黏性末端，用 将二者连接成基因表达载体，然后导入酵母菌体内。酵母菌在基因工程中称为 。
（4）科学家在培养转基因植物时，常用______________中的质粒作载体。质粒是基因工程最常用的载体，它具备载体的哪些条件？
① ；② ；
③ 。
（5）检测干扰素基因是否插入到酵母菌的基因组DNA中的方法是 。
（1）B （2）人工合成　目的基因　PCR技术
（3）限制性内切酶　磷酸二酯键　DNA连接酶　受体细胞
（4）农杆菌　①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存　②具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接　③具有某些标记基因，便于进行筛选 （5）DNA分子杂交
解析 （1）从图中可以看出整个过程为将人的淋巴细胞中控制干扰素合成的基因与质粒结合后导入酵母菌，并从酵母菌产物中提取干扰素，这项技术为基因工程。
（2）从人的淋巴细胞中取出干扰素基因，可选择人工合成的方法。由图可知干扰素基因在基因工程中称为目的基因，PCR技术是扩增基因的方法。
（3）构建基因表达载体时，需用限制酶处理基因和质粒的磷酸二酯键，使两者露出相同的黏性末端。DNA连接酶能够将磷酸二酯键连接，使两个DNA片段形成DNA分子。酵母菌在基因工程中可作为受体细胞。
（4）农杆菌中的质粒中的T－DNA能够进入植物细胞，整合到受体细胞的染色体DNA上，所以培育转基因植物时，常用农杆菌的质粒作为载体。载体应具备以下条件：①必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到运载体上；②运载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；③必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选；④必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去；⑤大小应合适，太大则不易操作。
（5）检测干扰素基因是否插入到酵母菌的基因组DNA中的方法是DNA分子杂交。
11、胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。 图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题:

  
（1）图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是 。
（2）图1中启动子是 酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是 。
（3）构建基因表达载体时必需的工具酶有 。
（4）β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于 。
（5）溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且β-半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为 。
（6）根据图2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是 ，理由是 。
（7）如果图1所示的载体可被A、B、C三种限制性内切酶同时切割。单独A切割得一条长链，单独B切也得一条长链，A和C同时切割得2个500bp和1个2666bp片段，B和C同时切割得2个250bp和1个3166bp片段。若以A的切割位点为计算起点，则B的切割位点与A点最短长度为 ，C的两个切割位点与A点的最短距离分别为 、 。
（8）如限制酶SmaI能识别如图3的「5‘-CCCGGG-3’」6个碱基序列，并在中央（图中箭头位置）切断DNA。则用限制酶SmaI处理如图的线状双链DNA时，请以箭头标出切割位置。

（1）终止子   
（2）RNA聚合    作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来
（3）限制酶和DNA连接酶
（4）防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解
（5）β-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸
（6）至少2个    两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸的R基中可能还含有游离的氨基
（7）750bp     500bp     1000bp  
（8）

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
解析 （1）根据题意和图示分析可知：图1基因表达载体中已有目的基因、启动子和标记基因，所以没有标注出来的基本结构是终止子。
（2）图1中启动子是RNA聚合酶酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达即转录过程；氨苄青霉素抗性基因的作用是作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来。
（3）构建基因表达载体的过程中，必须用相同的限制酶切割（含目的基因的外源DNA分子）和运载体，以产生相同的黏性末端，再加入DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。
（4）β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，这样可以防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解。
（5）溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，由于β-半乳糖苷酶中含有多个甲硫氨酸，而胰岛素的A、B链中不含甲硫氨酸，所以用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且β-半乳糖苷酸被切成多个肽段。
（6）由于一个肽链中至少有一个游离的氨基和一个游离的羧基，在肽链内部的R基中可能也有氨基和羧基，而胰岛素含有A链和B链，所以每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量至少是2个。
（7）分析题意可知，限制酶A和B在质粒上均只含有一个切割位点，限制酶C在质粒上有2个切割位点。由于B和C同时切割得2个250bp和1个3166bp片段，说明限制酶B的切点在限制酶C的两个短距离的切点之间，因此若以A的切割位点为计算起点，则B的切割位点与A点最短长度=500+250=750bp，则画图可知C的两个切割位点与A点的最短距离分别为500bp、1000bp。
（8）分析图解可知，限制酶SmaI能识别如图3的「5‘-CCCGGG-3’」6个碱基序列，并在中央切断DNA形成的平末端，因此它的切割位点为C和G之间。见上图

启动子、终止子、起始密码子与终止密码子的区别

启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
化学成分
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻碱基
mRNA上三个相邻碱基
位置
目的基因的首段
目的基因的尾端
mRNA首端
mRNA尾端
作用
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
决定转录的结束
翻译的起始信号
决定翻译过程的结束

几种易混淆酶的比较
名称
功能
应用
限制酶
特异性地切断DNA链中的磷酸二酯键
重组DNA技术和基因诊断
DNA连接酶
连接DNA片段之间的磷酸二酯键，不需要模板
基因工程
DNA聚合酶
连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的
磷酸二酯键，需要一条DNA链作为模板
DNA复制
RNA聚合酶
连接RNA片段与单个核糖核苷酸
之间的磷酸二酯键，也需要模板
RNA复制和转录
逆转录酶
作用于磷酸二酯键
以RNA为模板获得DNA
DNA解旋酶
使碱基对之间的氢键断裂
DNA复制
DNA水解酶
使DNA分子所有磷酸二酯键断裂
水解DNA

蛋白质工程与基因工程的比较
比较项目
蛋白质工程
基因工程
区

别
产品
自然界不存在的蛋白质
天然存在的蛋白质
实质
改造基因
将目的基因从供体生物转移到受体生物，并在受体生物中表达
操作
程序
基本
思路
预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列→人工合成目的基因→相应性质的蛋白质
获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→得到转基因生物→目的基因检测与鉴定
应用
及
现状
①主要集中在对现有蛋白质进行改造，如β-干扰素、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶等；②对创造新的蛋白质还有许多技术难题未突破，目前还没有真正成功的例子，原因是蛋白质高级结构非常复杂，人们对此知之甚少。
已被广泛应用，转基因植物、动物，生产药品等已商业化，但基因治疗仅处于临床试验阶段，未实践应用。
联 系
①两者均从分子水平进行操作；②蛋白质工程被称为第二代基因工程。因为蛋白质工程的本质是通过改造基因进而创造出自然界不存在的蛋白质。