专题33 克隆技术(选修3)教师版

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专题33克隆技术
考点
知识内容
考试属性及要求
加试
二、克隆技术
5.植物的克隆
6.动物的克隆
b
a
一、克隆技术
(一)克隆的概念
克隆是指 无性繁殖 ，即不通过两个分子、两个细胞或两个个体的结合，只由一个 模板分子 、 母细胞 或母体直接形成新一代分子、细胞或个体的过程。
(二)不同水平上的克隆(克隆的类型)
(1)分子水平(分子克隆)
①举例：基因克隆是指某种 目的基因 的复制、分离过程。
②过程：将生物材料的遗传物质(DNA)用限制性核酸内切酶切成片段，插入到载体分子中，并将所得的重组载体转入宿主(细菌或其他细胞)中，通过宿主细胞的无性繁殖使其扩增，然后再用其他某种探针选择、钓取目的基因。
(2)细胞水平(细胞克隆)
细胞克隆技术在利用杂交瘤制备单克隆抗体的操作中得到充分运用。
(3)个体水平(个体克隆)
包括植物的 无性生殖 及 核移植 技术。
①植物的克隆：自然界的许多植物都具有先天的无性繁殖能力，由母体的特定部位或结构产生新个体，如番薯、马铃薯、玫瑰等的插枝繁殖的植物。
②动物的克隆：海洋生物中许多个体也是无性繁殖的，如海星、海葵。但动物胚胎发育的条件和基因调控机理很复杂，动物克隆的实现并非是一件简单的事情，经历了由胚胎细胞克隆到体细胞克隆的数十年艰难发展过程。
(三)克隆的理论条件和基本条件
(1)理论条件：细胞(主要是包含遗传物质的细胞核)具有的全能性。
(2)基本条件
①具有包含物种完整基因组的 细胞核 的活细胞。(如乳腺上皮细胞)
②能有效调控细胞核发育的 细胞质 物质。(如去核的细胞质)
③完成胚胎发育的必要的 环境条件 。(如诱导核—质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境)
(四)克隆技术的发展方向
1.微生物克隆
例如由一个细菌分裂(复制)出多个和它完全一样的细菌而形成菌落。
2.遗传工程克隆
(1)举例：DNA克隆或基因克隆。
(2)过程：用特定的限制性核酸内切酶切割某个DNA分子(目的基因)，把它重组到被限制性核酸内切酶切割出匹配末端的载体分子上，再把这样的杂合分子导入特定的宿主细胞(如细菌)——这一导入过程叫转化。
(3)结果：在被转化的宿主细胞中可以随着重组载体复制得到大量的目的基因。
3.个体水平上的克隆
(1)含义：不通过两性细胞的结合，从一个单一的细胞繁殖出生物个体。
(2)发展：①20世纪50年代：美国科学家首创了两栖动物和鱼类细胞核移植技术，用于研究细胞发育和分化的潜能问题，细胞的核－质互作问题。
②1986年：英国科学家首次采用细胞核移植法，利用胚胎细胞克隆出一只羊。
③20世纪80年代末：我国诞生了一只胚胎细胞克隆兔。
④1991年：我国诞生了一只胚胎细胞克隆羊。
⑤1993年：我国通过胚胎细胞克隆出一批山羊。
⑥1995～1996年：我国利用胚胎细胞克隆牛成功。
(五)区分无性繁殖和有性繁殖
(1)无性繁殖是不经过异性生殖细胞的结合，直接由母体产生下一代个体的繁殖方式，如分裂生殖、营养繁殖等。有性繁殖是经过异性生殖细胞的结合，产生合子，再由合子发育成下一代个体的繁殖方式，如卵式生殖等。
(2)绝大多数低等生物都能进行无性繁殖，高等生物也有不少能进行无性繁殖。
(3)许多生物不只有一种生殖方式，它们往往既能进行无性繁殖，也能进行有性繁殖。如酵母菌、水螅、水绵等生物，在条件较好时一般以无性繁殖方式快速繁殖，而在环境条件较差时则往往进行有性繁殖，这样更有利于度过不良环境。绝大多数高等植物既可以用种子繁殖(有性繁殖)，也能进行营养繁殖(无性繁殖)。
(4)无性繁殖的方式也能产生生殖细胞，如孢子生殖中的孢子，但它没有性别之分，不需要经过两两结合就能直发育成后代。
(5)动、植物的克隆方法差异很大。在农业上，人们常采用插枝、压条等方法来繁殖适合于人类需要的植物。而动物克隆经历了从胚胎细胞克隆到体细胞克隆的数十年的发展过程。与动物个体克隆相比，植物个体水平克隆取得的成就更多。
二、植物的克隆
一、植物细胞全能性
1.植物细胞的全能性
(1)概念：植物体的 每个生活细胞 都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成 完整植株 的潜能。
(2)全能性的体现
①已经高度成熟和分化的细胞，都保持了恢复到 分生状态 的能力，都具有遗传上的 全能性 。
②不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间 遗传性 的差异， 细胞全能性 的表达程度大不相同。(影响全能性表达程度的因素)
③动、植物细胞全能性的区别： 高度分化 的植物细胞仍具有全能性；实验表明已分化的动物体细胞的 细胞核 具有全能性。植物细胞的全能性更容易体现，植物的组织培养比动物更方便。
④培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的原因：①染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生等，而且其结果是不可逆的。②细胞或组织中激素平衡被打破，或细胞对外源生长物质的敏感性发生改变。③随时间推移，由于其他各种原因产生了缺乏成胚性的细胞系。
⑤植物克隆成功的条件：①深入探讨特定植物细胞全能性的表达条件。②在植物克隆实验研究中，尽量选择性状优良、细胞全能性表达充分的基因型。
(3)全能性表达的条件：①离体、无毒无菌。②一定的营养物质，如水、无机盐、蔗糖、维生素等。③植物生长调节剂（一定比例的生长素、细胞分裂素等激素）。④适宜的物理条件，如温度、光照、pH等。
特别提醒　细胞全能性的大小与细胞分化的关系——全能性高则分化程度低
全能性最高的是受精卵，还没分化，个体发育其实就是受精卵不断分裂分化的过程，越往后细胞的分化程度越高。体细胞就是高度分化的细胞，也是全能性最低的细胞。
(1)体细胞全能性与细胞分化程度：分化程度低的>分化程度高的 如幼嫩的>衰老的。
(2)体细胞全能性与细胞分裂能力：细胞分裂能力强的>细胞分裂能力弱的。
(3)不同类型细胞的全能性：受精卵>生殖细胞(配子、精子、卵细胞)>体细胞。
(4)不同生物细胞的全能性：植物细胞>动物细胞(细胞核具有全能性)。
在生物体内细胞并没有表现出全能性的原因：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达，细胞分化为不同的组织、器官。
2.植物组织培养程序
(1)植物组织培养原理： 植物细胞具有全能性 ，即具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整个体的潜能。
(2)一般程序：配制 半固体 培养基→获取 消毒 的植物组织块→组织培养，获得 愈伤组织 (创伤组织)→以 适当配比 的营养物质和 生长调节剂 诱导愈伤组织，直到再生出新植株。

(3)植物组织培养过程


①愈伤组织：在创伤表面形成一种由相对没有分化的活的 薄壁细胞团 组成的 新生组织 。
②胚性细胞的特征：将含有愈伤组织培养物的试管放在 摇床 上，通过 液体悬浮 培养可以分散成 单细胞 。这种单细胞 细胞质丰富 、 液泡 小而 细胞核 大。
③脱分化：由外植体形成愈伤组织的过程，此过程需 避光 ，形成未分化的活的薄壁细胞团。
④再分化：由愈伤组织形成胚状体的过程，此过程需 光照 ，形成体有生根发芽的能力。
(4)用 纤维素酶 和 果胶酶 水解细胞壁，可以获得分离的植物细胞原生质体，用适当方法培养原生质体，也可以获得新植株。
注意：植物组织培养操作的关键点
(1)取材：选择离体的植物器官或组织、细胞时，选择易脱分化且具有分生能力的离体的植物器官或组织、细胞进行培养。尽管植物体其他已分化的部分也可以用于组织培养，但诱导愈伤组织的形成比较困难。含形成层(分生组织)的部分易于诱导形成愈伤组织，且含毒少。
(2)消毒：消毒、灭菌，防止细菌等的污染。因为培养基上有细菌等微生物存在时，它们比植物细胞生长、繁殖得快，不仅会与培养物争夺营养，而且它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此，在培养过程中要求一系列的无菌操作。
(3)光照：对于植物组织培养来说，光照条件非常重要，包括光照强度、时间和波长。但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养，而在分化再生的过程中一定要有光照。愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织，如果在光照条件下，容易分化产生维管等组织，则不利于产生大量的愈伤组织。愈伤组织再分化形成胚状体后，需光照处理。
(4)激素：植物激素是影响脱分化、再分化的重要因素，对诱导根或芽的产生起关键作用。
①生长素与细胞分裂素用量比例与结果
生长素/细胞分裂素，比值高时→促进根分化，抑制芽形成 ；(诱导植物组织脱分化和根原基形成)
生长素/细胞分裂素，比值低时→促进芽分化，抑制根形成 ；(诱导愈伤组织再分化和芽原基形成)
生长素/细胞分裂素，比值适中→促进愈伤组织形成 。(强力促进愈伤组织的形成)
②赤雾素类→促进分化的丛芽和小植株快速生长，但使用中要注意内、外源激素的含量。
③植物激素的使用顺序及结果
先生长素，后细胞分裂素→有利于细胞分裂但细胞不分化；
先细胞分裂素，后生长素→细胞既分裂也分化；
生长素、细胞分裂素同时使用→分化频率提高。
3.细胞培养和器官培养
(1)细胞培养
①愈伤组织细胞→具芽和根的分生组织→完整植株
②愈伤组织细胞→单个植物细胞→细胞团→ 球形胚 →心形胚→ 胚状体 →完整的植株。
③愈伤组织→花器官(如风信子)
(2)方法或措施
主要通过平衡的 植物激素配比 进行调控。
①适量的 生长素 和 细胞分裂素 配比，可诱导芽的分化。
②适量的 吲哚乙酸 及适当减除其他某些激素，可诱导生根。
(3)器官培养
在植物器官培养方面，雌性器官的培养成果显著，例如子房的培养、囊胚的培养均已取得进展。
植物器官培养是指以植物的根、茎、叶、花、果实等器官为外植体的离体无菌培养。很多作物都带有病毒，尤其是无性繁殖的植物，如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等。长期的病毒感染并在植物体内的积累，使植物的产量和品质不断下降，比如草莓果实越来越小。如利用茎、叶和花器官培养建立的试管苗，可在短期内提高繁殖速率，进行名贵品种的快速繁殖；利用茎尖培养可得到无毒试管苗，解决品种退化问题，提高产量和质量。
(4)细胞培养和器官培养的意义
①可以在实验室、试管等器皿中进行植物的 受精 过程和自受精卵进行的植物 胚胎发育 过程，以及调节控制这些过程的 环境 因素、遗传基础和分子及生理生化机理研究。
②可以进行遗传工程的操作，完成与植物生长发育有关的 重要基因 或 影响因素 的研究。
③可以方便地通过实验手段培育 植物新品种 。
例1　(2019·嘉兴高二检测)下列有关细胞全能性的叙述，错误的是(　　)
A.受精卵在自然条件下能使后代细胞形成完整个体，因此全能性最高
B.生物体内的体细胞由于细胞分化，全能性不能表达
C.卵细胞与受精卵一样，细胞未分化，全能性最高
D.植物细胞在一定条件下离体培养能表现出全能性
解析　受精卵是进行有性生殖的生物个体发育的起点，在自然条件下，通过细胞的分裂、分化形成完整的个体，所以受精卵的全能性最高，A项正确；生物体内的体细胞由于细胞分化，分别形成具有特定功能的组织细胞，因而其全能性不能表达，B项正确；卵细胞在一定条件下，全能性比体细胞高，但与受精卵不同，卵细胞的分化程度也很高，C项错误；分化的植物细胞如果全能性要表达出来，需在一定条件下进行离体培养，D项正确。答案　C
例2　(2018·浙江淳安中学检测)从红豆杉的树皮和树叶中提炼出来的紫杉醇属于植物的次生代谢产物，它对多种晚期癌症疗效突出。下列有关紫杉醇获取途径的叙述错误的是(　　)

A.从愈伤组织中分散得到的单细胞细胞质丰富、液泡大且核也大
B.将愈伤组织培养成植株还是特定细胞系要通过平衡生长调节剂的配比进行调控
C.在选择红豆杉时除了要考虑其优良性状外，还需考虑细胞全能性的表达能力
D.通过培养特定细胞系，可以实现对重要次生代谢产物的工业化生产
解析　从愈伤组织中分散得到的单细胞属于胚性细胞，特点是细胞核大、细胞质丰富、液泡小，A错误；将愈伤组织培养成植株还是特定细胞系需要调节培养物中激素配比，B正确；选择细胞进行培养，为增加成功概率需考虑其全能性的表达能力，C正确；紫杉醇是细胞的次生代谢产物，通过特定细胞系的培养，可实现工业化生产，D正确。答案　A
二、原生质体培养与植物细胞工程
1.原生质体：细胞中有代谢活性的部分，包括细胞膜、细胞质和细胞核。
原生质体特点：比较容易摄取外来遗传物质；便于细胞融合，形成杂交细胞；与完整细胞一样具有全能性，仍可以产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
2.植物原生质体的获得方法
在0.5～0.6 mol/L的 甘露醇 溶液环境(较高渗透压)下用 纤维素酶 和 果胶酶 混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞，将 细胞壁 消化除去，获得球形的原生质体。
特别提醒　(1)通过酶解法获取原生质体时，加入高浓度高渗甘露醇溶液的作用是维持渗透压。
(2)获得次生代谢产物时，一般将细胞培养至愈伤组织阶段即可，因此不涉及再分化过程。
(3)原生质体培养成功的表现是细胞壁再生。
3.植物细胞工程的操作过程

4.植物体细胞杂交过程图示



原生质体融合技术：物理方法：离心、震荡、电刺激；化学方法：聚乙二醇(PEG)诱导等。
植物体细胞杂交克服了植物远缘杂交不亲和的障碍，在培育作物新品种方面具有广阔的应用前景。例如白菜—甘蓝、烟草—海岛烟草等种间杂种。
5.应用
①使抗虫害、抗干旱、抗盐碱、抗低温和优质高产作物新品种的培育进入了新高潮。
②原生质体的培养结合基因工程操作，也为许多遗传学、植物生理学和细胞生物学问题提供了良好的研究基础。
6.多途径的植物克隆实践
(1)将外源遗传物质导入宿主细胞，可以培育出抗逆、高产及优质的转基因植株。
(2)通过大量培养特定细胞系，实现了能产生重要次生代谢产物的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。
(3)通过花粉培养，进行单倍体克隆。
(4)从通过细胞培养产生出遗传变异的新植株中，选择具备有益性状的作物新类型。
(5)在培养基中加入不同浓度的NaCl或病原体的毒蛋白，诱发和筛选出抗盐或抗病突变体。
(6)在培养基中加入不同浓度的赖氨酸类似物，能够产生抗赖氨酸类似物突变体。
例3　(2018·宁波高二检测)如图表示利用植物细胞工程对棉花进行改良的过程，据图分析错误的是(　　)
A.①过程需在适宜条件下用纤维素酶和果胶酶处理
B.②过程能定向改变原生质体的遗传特性
C.③过程需要通过液体悬浮培养
D.④过程需用适宜浓度的生长调节剂处理
解析　①过程需在适宜条件下用纤维素酶和果胶酶处理去掉细胞壁，获得原生质体，A正确；②过程为转基因技术，能定向改变原生质体的遗传特性，B正确；③过程需要在固体培养基上培养，C错误；④过程需用适宜浓度的生长调节剂处理，促进根、芽的发育，D正确。答案　C
易混易错　植物组织培养会涉及固体培养基和液体培养基。获取愈伤组织都是在固体培养基上进行的，而获取胚性细胞，需将原生质体进行液体悬浮培养(液体培养基)。
例4　(2016·浙江10月选考节选)某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答：
(1)原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5 mol/L甘露醇(维持较高渗透压)的________________________混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。
(2)原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该________培养基中甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。途径一：细胞团经球形胚、______和胚状体，最后发育成植株。途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是____________。胚性细胞的主要特点是________(A.液泡小、细胞核小　B.液泡大、细胞核大　C.液泡大、细胞核小　D.液泡小、细胞核大)。
(3)为了对烟草的某些性状进行改良，分离得到两种烟草的原生质体后，通过_______________方法将它们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA，采用________扩增相关基因，来鉴定遗传物质是否成功重组。
答案　(1)纤维素酶和果胶酶　(2)降低　心形胚　细胞分裂素　D　(3)原生质体融合　PCR
解析　(1)去除植物细胞壁，获得植物细胞的原生质体，常用的方法是利用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞。(2)在获取原生质体时甘露醇是作为维持细胞膜内外渗透压平衡的稳定剂使用的，其具体作用是提高渗透压，防止水分渗入细胞内部，造成细胞破裂。在原生质体形成新细胞壁后，细胞壁有支持与保护作用，所以要降低甘露醇的浓度；由细胞团形成再生植株，途经：从胚性细胞→细胞团→球形胚→心形胚→胚状体，然后再生出完整的植株；为快速诱导芽的分化，培养基中往往添加细胞分裂素；胚性细胞的特点是液泡小、细胞核大。(3)植物细胞工程中，利用原生质体融合的方法获得杂种细胞；体外扩增DNA技术常用的是PCR技术。
方法技巧　植物细胞培养、器官培养和原生质体培养的关系


1.判断正误：
(1)培养形成愈伤组织和形成新植株所用的培养基生长调节剂的配比不同(　　)
(2)一般植物的每个细胞都具有发育成完整植株的潜能(　　)
(3)愈伤组织是一种由相对分化的薄壁细胞团组成的新生组织(　　)
(4)胚性细胞细胞质丰富、液泡小而细胞核大(　　)
(5)同一植物个体所有具细胞核的活细胞全能性表达程度相同(　　)
(6)有的植物(如风信子)可以在愈伤组织的基础上直接发育出花器官(　　)
(7)获得大量重要次生代谢产物，需通过植物组织培养技术获得再生植株才可实现(　　)
(8)配制植物组织培养基时，需要先灭菌，再加入适当营养物质和植物生长调节剂(　　)
(9)植物组织培养所用的小组织块需要消毒(　　)
(10)将植物组织块放在培养基上经再分化可形成愈伤组织(　　)
答案　(1)√　(2)√　(3)×　(4)√　(5)×　(6)√　(7)×　(8)×　(9)√　(10)×
2.(2018·浙江名校协作体联考)植物组织培养基中肯定没有下列哪种物质(　　)
A.血清 B.生长素 C.无机盐 D.蔗糖
解析　植物组织培养基中通常含有植物激素(如生长素、细胞分裂素等)、无机盐(维持渗透压)、蔗糖(提供能量)等，不含有血清。答案　A
3.下列关于植物组织培养技术的叙述中，错误的是(　　)
A.培养基中添加营养物质的目的是提供营养和调节渗透压
B.培养基中的植物生长调节剂影响愈伤组织的生长和分化
C.离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织
D.同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因型相同
解析　植物组织培养技术既可对植物体细胞进行组织培养，也可对生殖细胞进行组织培养。假设某植株的基因型为Aa，取其根尖细胞离体培养形成的新植株基因型仍为Aa；若取该植株花药细胞离体培养，形成的新植株基因型为A或a。答案　D
4.紫草素是紫草细胞的代谢产物，可作为生产治疗烫伤药物的原料。研究人员欲用植物组织培养技术通过培养紫草细胞生产紫草素。下列相关操作不合适的是(　　)
A.对作为外植体的紫草叶片进行消毒处理既保证其活性也可减轻污染
B.培养基中要加入植物激素以保证已分化的植物细胞脱分化形成愈伤组织
C.调节植物激素的种类和比例以保证愈伤组织再分化为胚状体
D.在培养细胞的过程中要不断通入无菌空气以保证氧气的充足供应
解析　植物组织培养需要无菌无毒的条件，对作为外植体的紫草叶片进行消毒处理既可保证细胞活性也可减轻污染，A正确；决定植物细胞脱分化和再分化的关键因素是植物激素的种类和比例，所以培养基中加入植物激素可以保证已分化的植物细胞脱分化形成愈伤组织，B正确；本题植物组织培养的目的是获得细胞代谢产物，而不是完整植株，培养到愈伤组织阶段即可，C错误；植物细胞培养过程需要充足的氧气，D正确。答案　C
5.(2018·金华高二检测)下图中的①②③代表通过植物组织培养技术培育新植株的三条途径，请回答：

(1)外植体a、b、c来自同种植株，植株A、B、C中的细胞，全能性表达程度__________(填“相同”或“可能不同”)。
(2)途径②和③需要用到______________和____________(填培养基的物理性质)培养基两种。
(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的______(A.甘露醇　B.盐酸　C.蒸馏水　D.氯化钠)以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着______________技术又向前迈进了一步。
(4)通过大量培养特定细胞系，可以实现能产生重要________________(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。
答案　(1)可能不同　(2)液体培养基　固体(或半固体) (3)A　植物细胞工程　(4)次生代谢产物
解析　(1)不同植株，全能性存在差异，即使同种植株，基因型不同个体之间全能性也存在差异。(2)分析题图可知，途径②和③均借助了摇床，即进行液体悬浮培养，获得单细胞，因此该途径所用培养基为液体培养基。同时途径②和③均涉及愈伤组织的获得，需利用固体培养基(或半固体培养基)。(3)植物克隆工程中，去除植物细胞的细胞壁，获得原生质体，一般在高浓度甘露醇溶液中进行，使用高浓度甘露醇的目的是维持渗透压，防止原生质体吸水胀破。原生质体的培养成功，标志着植物细胞工程的进步。(4)通过培养大量特定细胞系，可以实现能产生重要次生代谢产物(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。

题组一　植物细胞的全能性
1.以下不能说明细胞全能性的是(　　)
A.玉米花粉粒培育出植株 B.转入贮存蛋白基因的向日葵细胞培育出植株
C.烧伤病人的健康细胞培养出皮肤 D.用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成了可育的植株
解析　细胞的全能性是指已分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能。烧伤病人的健康细胞培养出皮肤，属于器官水平的培养，没有形成完整个体，因此不能说明细胞全能性。答案　C
2.下列有关植物细胞全能性的叙述，正确的是(　　)
A.只有体细胞才具有发育成完整个体的潜能
B.由全能性诱导出的植株，在多次继代组织培养后不会丧失全能性的表达能力
C.发育成完整个体所需的所有基因都存在于细胞核中
D.去除细胞壁的植物细胞不会失去全能性
解析　植物体细胞、生殖细胞都具有发育成完整个体的潜能，A错误；由于不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传性的差异，细胞全能性的表达程度大不相同，如拟南芥、烟草和番茄等的培养细胞很容易再生出新植株，并能在多个世代中保持细胞全能性的表达，而小麦、玉米和水稻等作物的一些品种或品系的培养细胞所诱导出的再生植株，在多次继代培养后，会丧失细胞全能性的表达能力，B错误；植物细胞中的基因除了存在于细胞核中外，还有少量基因存在于细胞质的线粒体和叶绿体中，C错误；去除细胞壁的植物细胞是原生质体，可以再生细胞壁，仍具有全能性，D正确。答案　D
题组二　植物组织培养、细胞培养和器官培养
3.(2019·舟山高二检测)如图表示植物组织培养过程。据图分析下列叙述正确的是(　　)
A.⑤植株根尖细胞的全能性比①植株根尖细胞的强
B.②试管的培养基中含有植物生长调节剂，不含有机物
C.③试管中的细胞具有细胞质丰富、细胞核和液泡都大的特性
D.调节④培养基中植物生长调节剂的比例可诱导产生不同的植物器官
解析　通过调节④培养基中植物生长调节剂的比例可诱导愈伤组织细胞分化产生不同的植物器官，选项D正确。答案　D
4.植物细胞培养是在植物组织培养技术的基础上发展起来的，有关植物细胞培养的叙述，不正确的是(　　)
A.植物细胞培养技术的目的是为了获得大量有生理活性的次生代谢产物
B.植物细胞培养技术快速、高效，不受季节、外部环境等条件的限制
C.利用生物反应器悬浮培养人参细胞，提取人参皂甙，用于生产保健药品和美容护肤用品
D.植物细胞培养需要在一定的温度、pH等条件下进行，但不需要进行无菌操作
解析　植物细胞培养和植物组织培养一样，整个培养过程必须在无菌条件下进行，否则培养基内将长出许多杂菌与离体细胞争夺营养与生存空间，影响细胞增殖和细胞次生代谢产物的获得。A项所述为植物细胞培养的目的，B项为植物细胞培养的特点，C项为植物细胞培养的应用。答案　D
5.植物组织培养，一般取植物的芽、茎尖或根尖的组织细胞进行培养。下列不属于取材理由的是(　　)
A.植物的芽、茎尖或根尖的组织细胞一般没有病毒积累
B.植物的芽、茎尖或根尖的组织细胞具有较强的分裂能力，全能性高
C.植物的芽、茎尖或根尖的组织细胞的分化程度相对较低，容易脱分化
D.植物的芽、茎尖或根尖的组织细胞进行分裂形成了愈伤组织
解析　进行植物组织培养时，一般选择植物的根尖、茎尖或芽的组织细胞进行培养，是因为该部位的细胞一般没有或者很少有病毒积累，且分裂能力较强，分化程度较低，全能性较高，A、B、C正确；除芽、茎尖或根尖外，植物其他细胞也能经脱分化形成愈伤组织，D错误。答案　D
6.下列有关植物克隆技术的叙述中，错误的是(　　)
A.诱导某些植物的愈伤组织能使其直接发育成花芽
B.植物组织培养中通过调节营养物质的配比可以实现器官发生和形态建成
C.植物愈伤组织通过液体悬浮培养能分散成单细胞，这种单细胞发育成胚状体
D.通过大量培养特定细胞系，可以克隆出大量能产生重要次生代谢产物的细胞
解析　诱导某些植物的愈伤组织能使其直接发育成花芽，如风信子，A正确；植物组织培养中主要通过平衡的植物激素配比实现器官发生和形态建成，B错误；植物愈伤组织通过液体悬浮培养能分散成单细胞，这种单细胞能发育成胚状体，C正确；通过大量培养特定植物的细胞系，可实现细胞产物的工厂化生产，D正确。答案　B
题组三　原生质体培养与植物细胞工程
7.下列有关高等植物原生质体制备和培养的叙述，正确的是(　　)
A.纤维素酶和果胶酶混合液可用于制备悬浮培养细胞的原生质体
B.加入0.6 mol/L甘露醇的目的是保护纤维素酶和果胶酶
C.从不同植物组织分离得到的原生质体大小、形状相同
D.所有植物的愈伤组织经原生质体培养均可得到再生植株
解析　植物细胞壁由纤维素和果胶构成，因此可以采用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁，获得原生质体，A正确；加入0.6 mol/L甘露醇的目的是防止原生质体吸水胀破，B错误；不同植物组织分离得到的原生质体大小、形状存在差异，C错误；不同植株或基因型个体，细胞全能性存在差异，愈伤组织经原生质体培养不一定能得到再生植株，D错误。答案　A
8.如图表示利用棉花叶肉细胞原生质体进行培养、遗传改良的过程，据图分析错误的是(　　)
A.①过程需在适宜条件下用纤维素酶和果胶酶处理
B.②过程能定向诱导原生质体产生优良性状的突变
C.③过程中叶肉细胞失去了原来特有的结构和功能
D.④过程需用适宜浓度的生长素和细胞分裂素处理
解析　①过程是去除细胞壁的过程，需在适宜条件下用纤维素酶和果胶酶处理，A项正确；②过程是通过紫外线照射，诱发原生质体发生基因突变，但基因突变是不定向的，B项错误；③过程表示脱分化，该过程中高度分化的叶肉细胞失去了原来特有的结构和功能，C项正确；④过程是再分化，该过程需用适宜浓度的生长素和细胞分裂素处理，诱导愈伤组织分化为植物的不同组织、器官，D项正确。答案　B
9.下列有关植物细胞工程的叙述，错误的是(　　)
A.通过培养植物细胞，可获取大量的细胞代谢产物
B.在培养基中加入不同浓度的氯化钠溶液，可诱发和筛选出抗盐植株
C.原生质体培养结合基因工程技术，可获得具有特定性状的新植株
D.由于植物细胞具有全能性，同种植物的不同基因型个体，它们细胞全能性的表达程度相同
解析　如果植物细胞培养仅培养到愈伤组织阶段，则可利用愈伤组织增殖能力强、种类单一等特点，生产细胞代谢产物，A正确；改变外界条件，既可进行筛选也可进行诱变，B正确；基因工程可以定向改造生物性状，C正确；对于同种植物的不同基因型的个体，它们的细胞会发生分化，而细胞分化的程度不同，直接导致细胞全能性的表达程度不同，D错误。答案　D
10.下图表示基因型为AaBb的水稻的花药通过无菌操作，接入试管后，在一定条件下形成试管苗的培育过程。下列相关叙述错误的是(　　)
A.愈伤组织是花粉细胞通过有丝分裂后形成的不规则的细胞团
B.在愈伤组织的形成过程中，必须从培养基中获得水、无机盐和小分子的有机物等营养物质
C.为促进花粉细胞分裂生长，在培养基中应加入适宜浓度的生长素等激素
D.试管苗可能出现的基因型有AABB或AAbb或aaBB或aabb
解析　花粉是通过减数分裂形成的，其基因型为AB或Ab或aB或ab，由花粉发育而来的个体未经秋水仙素处理，是单倍体植株。答案　D
11.(2019·湖州高二检测)红豆杉是濒危植物，其树皮产生的紫杉醇对癌症有一定的疗效。如图是红豆杉植株组织培养和细胞培养的流程图。请据图回答下列问题：
(1)图中②为愈伤组织，通过B过程可最终产生新的植株，通过C过程可产生大量细胞，则图中A、B、C分别表示的过程为__________、___________、____________。其中B过程的实质是____________________。
(2)对⑤的培养一般要采用________培养基，且要不断通入无菌空气。
(3)从生殖方式上分析①→④属于________生殖。
(4)若①是红豆杉的花药，则得到的个体④为(　　)
A.单倍体 B.二倍体 C.单体 D.多倍体
答案　(1)脱分化　再分化　有丝分裂(或细胞培养)　基因的选择性表达　(2)液体　(3)无性　(4)A
解析　(1)据图可知，过程A表示脱分化，即由图中①红豆杉离体的植物器官、组织或细胞(外植体)，经脱分化形成②愈伤组织的过程。过程B表示再分化，即由愈伤组织通过诱导分化为③试管苗的过程，该过程的实质是基因的选择性表达。过程C表示细胞培养过程，该过程主要是细胞的有丝分裂和生长过程。
(2)⑤为通过细胞培养产生的大量红豆杉细胞。⑤的培养目的是使细胞快速增殖，一般采用液体培养基进行悬浮培养。
(3)从生殖方式上分析，①→④表示通过组织培养技术获取新植株的过程，该过程没有有性生殖细胞的产生和两性生殖细胞的受精过程，因而属于无性生殖。
(4)花药细胞中染色体减半，因而由花药通过组织培养获得的个体④为红豆杉的单倍体，选项A正确。
12.(2018·绍兴高二检测)应用植物组织培养技术，不仅可实现种苗的快速繁殖、培育无病毒植株，也可加快作物及苗木育种的进程。下面是培育柑橘耐盐植株的实验流程：
→→
回答下列问题：
(1)愈伤组织是由离体的茎段经__________过程形成的，此时愈伤组织细胞________(填“具有”或“不具有”)全能性。
(2)对愈伤组织进行了两次处理，处理1中γ射线照射的目的是______________，用γ射线不直接处理茎段而是处理愈伤组织，原因是_________________________________；处理2中添加的物质X为______________。
(3)植物组织培养技术也被广泛应用于其他作物的育种中。下列作物育种技术中必需用到植物组织培养技术的是________(A.白菜—甘蓝　B.三倍体无籽西瓜　C.抗虫棉)。
答案(1)脱分化　具有　(2)诱导基因突变　愈伤组织细胞分裂能力强，易诱发基因突变　NaCl(或盐)　(3)A、C
解析　(1)离体的茎段经脱分化过程形成愈伤组织，此时愈伤组织具有未分化的特点，细胞依然具有较高的全能性。
(2)对愈伤组织进行了两次处理，处理1中γ射线照射的目的是诱导基因突变。愈伤组织细胞处于不断分裂状态，易受到培养条件和外界压力的影响而产生突变，因此通常用γ射线处理植物的愈伤组织，能获得较好的效果。该技术最终培育成柑橘耐盐植株，因此处理2中添加的物质X为NaCl，起选择作用。
(3)三倍体无籽西瓜的培养过程是：利用秋水仙素处理二倍体西瓜的幼苗，使之变成四倍体植株，再用二倍体西瓜给四倍体西瓜授粉，结出三倍体的种子，第二年将此三倍体的西瓜种子种下去，授以二倍体的花粉，结出三倍体的无籽西瓜，整个过程中没有用到植物组织培养。抗虫棉育种研究中常用农杆菌转化法将含抗虫基因的Ti质粒导入棉花体细胞中，再利用植物组织培养技术获得抗虫棉植株。运用细胞工程培育白菜—甘蓝杂种植株，需要利用植物组织培养技术将杂种细胞培养成杂种植株。
13.(2018·余姚中学期中)卡那霉素和头孢霉素都有抗菌作用，此外，卡那霉素还对葡萄细胞有抑制作用。研究人员将Barnase基因(雄性不育基因)转入葡萄细胞，利用卡那霉素和头孢霉素，通过植物克隆方法成功培育出大粒、无核的葡萄新品种。请回答：
(1)构建含Barnase基因、β-葡糖苷酸酶基因和卡那霉素抗性基因的重组质粒，将其导入农杆菌，在固体培养基中培养形成________以便鉴定是否混有杂菌，再用________将农杆菌转移至LB________培养基中进行扩大培养。构建重组质粒需要用到的工具酶是______________、__________________。
(2)将经过________的幼嫩葡萄叶片切成小块，浸入农杆菌悬浮液中，4分钟后取出(此时已有较多农杆菌附着在叶片小块上)并接种到固体培养基中。培养至第3天时，可以看到在叶片小块周围出现__________和大量菌落。这时再用头孢霉素处理叶片小块，其目的是__________(A.抑制葡萄细胞脱分化　B.促进葡萄细胞再分化 C.杀灭农杆菌　D.促进农杆菌生长)。
(3)将叶片小块放入卡那霉素培养基中培养一段时间后，转移至生芽培养基中，待其长出________后，再转移至生根培养基中继续培养形成试管苗。卡那霉素培养基起着________作用，植物克隆的技术基础是______________________________________。
(4)在卡那霉素培养基中，由于转化细胞对周围的非转化细胞有保护作用，获得的试管苗中可能存在假的转基因试管苗，因此还需对试管苗的__________________基因的表达产物进行生化检测，鉴别出真正的转基因试管苗。
答案　(1)单菌落　接种环　液体　限制性核酸内切酶 DNA连接酶　(2)消毒　愈伤组织　C　(3)丛状苗　筛选　植物组织培养　(4)β-葡糖苷酸酶
解析　(1)构建含Barnase基因、β-葡糖苷酸酶基因和卡那霉素抗性基因的重组质粒，抗性基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。在固体培养基中培养农杆菌形成单菌落，以便鉴定是否混有杂菌。构建重组质粒时需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。将菌种接种在液体培养基中需要用接种环接种。(2)将经过消毒的幼嫩葡萄叶片切成小块，以防止杂菌污染，离体植物组织或细胞在培养基中脱分化成愈伤组织。头孢霉素有抗菌作用，用头孢霉素处理叶片小块，目的是杀灭附着在叶片上的农杆菌。(3)将叶片小块离体培养后，转移到生芽培养基中，待其长出丛状苗后再移栽。卡那霉素和头孢霉素都有抗菌作用，卡那霉素培养基起着筛选作用。植物克隆的技术基础是植物组织培养。(4)重组质粒含有Barnase基因、β-葡糖苷酸酶基因和卡那霉素抗性基因，因此对试管苗的β-葡糖苷酸酶基因的表达产物进行生化检测，就能鉴别出真正的转基因试管苗。
三、 动物的克隆
(一)动物细胞的培养和克隆形成
动物克隆的技术基础： 动物的细胞和组织培养 。
1.动物细胞的培养
(1)动物细胞培养的原理是 细胞增殖 。
(2)条件：
①充足的营养供给：微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。
②适宜的温度：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。
③气体环境：95%的空气(氧气用于需氧呼吸、细胞代谢)，5%的CO2(调节pH)——可使用CO2培养箱。
④无菌无毒环境：培养液和培养用具无菌处理；培养过程加抗生素杀菌；定期更换培养液，清除代谢产物。
(3)培养过程

(4)培养瓶内细胞生长特点
①贴附在瓶壁上，称为 细胞贴壁 生长。
②接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞 停止分裂增殖 的现象。
(5)应用
①生产病毒疫苗、单克隆抗体、干扰素等。
②利用动物细胞培养技术中的细胞贴壁生长和接触抑制的特点，可用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞，以供植皮所需。
③培养的动物细胞用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。
④用于生理、病理、药理等方面的研究。
特别提醒　
(1)选取幼龄动物的组织、器官作为材料的原因：不是所有的动物细胞都能在离体情况下表现出生命活动，动物细胞培养中的取材很重要，大部分取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，这是因为幼龄动物的组织、器官，其细胞的分化程度较低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。
(2)培养前要将动物组织分散成单个细胞的原因：成块组织不利于培养，其中的细胞不能与培养液充分接触；而且动物细胞具有接触抑制的特性，分散成单个细胞更易进行物质交换，有利于培养。
(3)放入CO2培养箱中保温培养的原因：动物细胞培养过程中通入CO2的目的是调节pH。
(4)培养液中加血清原因：由于人们对细胞所需的营养物质还没完全搞清楚，而血清中含有许多未知成分，对细胞的生长增殖是必要的，因此，在使用合成培养基时，一般加入动物血清、血浆等一些天然成分，是动物体细胞生长所需要的营养物质。
(5)动物细胞培养中胰蛋白酶可消化组织中的胶原纤维和细胞外的其他成分，获得细胞悬浮液。动物细胞培养中两次用到胰蛋白酶，第一次的目的是处理剪碎的组织，使之分散成单个细胞，第二次的目的是使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来。
(6)贴壁生长：动物细胞在液体培养基中悬浮生长一段时间之后，大部分细胞会贴附在培养瓶的内壁生长。除此之外，也有一些细胞(如淋巴细胞)能够持续在悬浮状态下生长。
(7)接触抑制：大多数细胞不适应悬浮生长，它们必须在固体的表面上生长和分裂。细胞在培养瓶中贴壁生长，随着细胞数量越来越多，当贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时就停止分裂增殖的现象。
(8)①动物克隆的原理：动物细胞细胞核的全能性；②动物克隆的技术基础：动物细胞和组织培养；③动物细胞和组织培养原理：细胞的增殖。
2.动物组织培养
(1)概念：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或 生长 特性。
(2)动物组织培养的特点：
①动物组织培养过程中可以伴随 组织分化 。
②不管采用什么手段和培养条件，组织培养中主要的生命活动成分仍是以细胞为单位的。
③结果：由于细胞的运动、变化和培养物的组织成分发生变化，长期的培养结果最终成了简单的细胞培养。
④在广义的组织培养中还包括器官培养，即 器官的原基 、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存、生长，在此过程中保持器官的结构、功能及 分化 能力。
(3)综合细胞培养和组织培养的含义和规律，两者在一定程度上可看作是同义语，统称组织培养(组培)。
3.动物组织培养技术的发展
(1)原代培养与传代培养
①原代培养：从 机体取出后 立即进行的细胞、组织培养为原代细胞。
②传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续 生长、增殖 。
(2)原代培养的细胞因代谢消耗和接触抑制，培养到一定时期必须进行传代培养。
原代培养：①细胞悬浮液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养。
②第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。
传代培养：①细胞悬浮液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养。
②传10代以后的细胞培养，统称为传代培养。
例1　下列关于动物细胞培养和植物组织培养的叙述，正确的是(　　)
A.动物细胞培养和植物组织培养所用培养基成分不同，但能源物质相同，都是葡萄糖
B.植物组织培养无需添加抗生素，动物细胞培养过程中必须添加抗生素
C.通过烟草叶片细胞离体培养能产生新个体，可获单倍体烟草植株
D.动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖培养可用于植物脱除病毒
解析　植物组织培养所用培养基中能源物质为蔗糖，A错误；动、植物组织培养过程中，都需要加入适量的抗生素，B错误；烟草叶片细胞离体培养获得的是正常植株，花药离体培养得到的才是单倍体植株，C错误；动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖细胞几乎不含病毒，可通过植物组织培养获得脱毒幼苗，D正确。答案　D
例2　如图是动物细胞培养的基本过程示意图，请据图回答：
(1)动物细胞培养的理论基础是(　　)
A.细胞分化 B.细胞增殖 C.细胞全能性 D.细胞膜流动性
(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是______________，
然后用________酶处理，这是为了使细胞分散开来。这样做的目的是__________________________________________________________。
(3)培养首先在B瓶中进行。在此瓶培养一段时间后，细胞出现接触抑
制现象，到这时的培养称为_______________。
(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用__________处理，然后配制成__________，再分装。
(5)在C瓶中正常培养细胞的过程称为______________________________________。
答案　(1)B　(2)剪碎组织　胰蛋白　使细胞与培养液充分接触　(3)原代培养　(4)胰蛋白酶　细胞悬浮液(5)传代培养
(1)动物细胞培养的理论基础是细胞增殖。(2)在进行培养时应尽量使细胞分散，便于与培养液充分接触进行物质交换，使其分散需要用胰蛋白酶处理。(3)培养的过程分为原代培养和传代培养两大阶段。(4)用胰蛋白酶处理使细胞从玻璃瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液继续培养。(5)在C瓶中的培养属于传代培养。
方法技巧　植物组织培养与动物细胞培养的比较
比较项目
植物组织培养
动物细胞培养
理论基础
细胞的全能性
细胞的增殖
培养基
类型
固体或半固体培养基
液体培养基
成
分
水、矿质元素、维生素、蔗糖、琼脂、
植物激素
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清
取材部位
植物幼嫩部位或花药等
动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
对光
的需求
再分化阶段需光
不需光
过程


结果
获得植株新个体或获得大量的细胞和细胞产物
只能获得大量细胞或细胞产物，不能得到生物个体
用途
①植株快速繁育；②脱毒植物的培育；③制造人工种子；④生产药物、杀虫剂等；⑤转基因植物的培育
①蛋白质生物制品的生产；②皮肤移植材料的培养；③检测有毒物质；④生理、病理、药理学研究
共性
①都需无菌条件，培养基中含有有机物和无机物等营养物质；
②都是细胞有丝分裂过程
4.细胞系和细胞株
项目
细胞系
细胞株
定义
可 连续传代 的细胞。原代培养物在首次传代时就成为细胞系。
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的 具有特殊性质 的细胞。
种类
连续细胞系
(能连续培养下去的细胞系)
有限细胞系
(不能连续培养下去的细胞系)
连续细胞株
(可以连续多次传代的细胞株)
有限细胞株
(传代次数有限的细胞株)
来源
由传代细胞连续培养建成
二倍体细胞通常为有限细胞系
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞。
特点
发生了转化，多数具有异倍体核型；有些是恶性细胞系，具有异体致瘤性；有些具有不死性，但保留接触抑制现象，不致癌。
有接触抑制；
不能连续培养。
可连续多次传代
传代次数有限
一般具有恒定的 染色体组型 、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等。
注意
细胞系所有细胞都能传代培养，却不一定具有相同的特征，不能称为细胞克隆；而细胞株是具有特殊性质的细胞系，一个细胞株就是一个细胞克隆。

5.克隆培养法(或细胞克隆)
(1)概念：把一个 单细胞 从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的 细胞群体 的技术。
(2)培养结果：经过克隆以后的细胞的后裔细胞群，由于来源于一个共同的祖细胞，所以称为纯系，也就是克隆。其遗传性状均一，表现的性状相似。
(3)基本要求：所建成的克隆来源于 单个细胞 。
(4)提高细胞克隆形成率的措施：
①选择适宜的培养基； ②添加 血清(胎牛血清最好) ； ③以 滋养细胞 支持生长；
④ 激素(胰岛素等) 刺激； ⑤使用 CO2 培养箱、调节pH等。
(5)应用 ①单一细胞的克隆由于基因型一致，是研究遗传规律和生理特性的重要材料。
②分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。如研究缺少某种特殊蛋白的细胞从而发现这种蛋白的功能。
克隆的类型

例3　下列有关动物细胞培养的叙述，错误的是(　　)
A.细胞克隆需要滋养细胞支持生长
B.长期动物组织培养最终会成为简单的细胞培养
C.细胞系在连续传代过程中遗传性状始终保持均一
D.细胞株是从原代培养物或细胞系中选择出的具有特殊性质的细胞
解析　提高动物细胞克隆形成率的措施有：选择适宜的培养基、激素刺激、添加血清及以滋养细胞支持生长等，A正确；动物组织培养过程中，长期的组织培养最终会成为简单的细胞培养，B正确；细胞系在连续传代的过程中大多数会发生遗传物质改变，而具有异倍体核型，C错误；细胞株是从原代培养物或细胞系中经过选择或纯化，获得的具有特殊性质的细胞，D正确。答案　C
例4　不属于细胞株特点的是(　　)
A.不具有恒定的染色体组型 B.具有同功酶类型 C.具有病毒敏感性 D.具有生化特性
解析　细胞株的特点是具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性。答案　A
例5　实验小鼠皮肤细胞培养(非克隆培养)的基本过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.甲过程需要对实验小鼠进行消毒
B.乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶消化
C.丙过程得到的细胞大多具有异倍体核型
D.丁过程得到的细胞可能具有异质性
解析　进行细胞培养前需要对提供实验材料的动物进行消毒，A正确；进行培养的组织需先用胰蛋白酶处理，使其消化分散成单个细胞，B正确；丙过程属于原代培养，细胞的核型稳定，C错误；丁过程属于传代培养，期间部分细胞会出现异质性，D正确。答案　C

1.判断正误：
(1)在人工控制的培养条件下，动物细胞培养的细胞能无限增殖(　　)
(2)细胞培养中，原代培养是指第一代细胞的培养(　　)
(3)从原代培养物中获得的细胞叫细胞株(　　)
(4)动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶(　　 )
答案　(1)×　(2)×　(3)×　(4)×
2.下列有关动物细胞培养的说法中，正确的是(　　)
A.通过动物细胞培养获得细胞株或细胞系，证明了动物体细胞也具有全能性
B.癌细胞培养到一定时期不传代培养也能无限增殖
C.动物细胞培养时必须使用相关的酶才能使细胞分散成单个细胞
D.动物细胞培养时应置于CO2培养箱中，使培养液的pH保持相对稳定
解析　通过动物细胞培养获得细胞株或细胞系，但没有形成完整个体，因此不能证明动物体细胞具有全能性，A错误；癌细胞具有无限增殖的能力，只有在适宜的环境和营养条件下才能无限增殖下去，B错误；动物细胞培养时，经过机械消化或胰酶消化使细胞分散成单个细胞，C错误；动物细胞培养时应置于CO2培养箱中，使培养液的pH保持相对稳定，D正确。答案　D
3.(2018·鄞州中学测试)下列关于动物细胞培养的叙述，错误的是(　　)
A.在培养基中加入胰岛素可提高动物细胞克隆形成率
B.细胞克隆可以从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系
C.连续细胞系可认为是发生了转化的细胞系，大多数具有二倍体核型
D.连续细胞系比有限细胞系更容易克隆
解析　在培养基中加入胰岛素可提高动物细胞克隆形成率，A项正确；细胞克隆即克隆培养法，是将单一细胞从细胞群体中分离出来单独培养形成纯系的技术，从普通细胞系中分离出单个突变细胞即可采用这种方法培养成细胞系，B项正确；连续细胞系被认为是发生了转化的细胞系，大多具有异倍体核型，C项错误；连续细胞系增殖能力更强，更易克隆，D项正确。答案　C
4.下列关于细胞系和细胞株的说法中，正确的是(　　)
A.细胞系有分裂次数的限制，细胞株可连续传代
B.细胞系的遗传物质没有变化，细胞株的遗传物质也没有改变
C.细胞系是原代培养建成的，细胞株是传代培养建成的
D.细胞系是可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系
解析　细胞系是指可连续传代的细胞，分为有限细胞系和连续细胞系，连续细胞系是发生转化的细胞，遗传物质已经发生变化；从细胞系中选择出的具有特殊性质的细胞是细胞株。答案　D
5.(2019·台州高二检测)根据所学知识回答下列问题：
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面____________时，细胞会停止分裂增殖，此时，瓶壁上形成的细胞层数是________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是____________。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现________________的细胞，但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成__________细胞，这种细胞的粘着性________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量________。
(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不被染色，原因是__________________________________________________________________________________________。
(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到________(A.有丝分裂前期　B.有丝分裂中期　C.有丝分裂后期　D.有丝分裂末期)的细胞用显微镜进行观察。
(5)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了免疫排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作________进行攻击。
答案　(1)相互接触　单层(或一层)　胰蛋白酶　(2)衰老甚至死亡　不死性(或无限增殖)　降低　减少
(3)活细胞的细胞膜具有选择透性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色(或死细胞的细胞膜丧失了选择透性，大分子染料能够进入死细胞内而着色)　(4)B (5)抗原
解析　(1)动物细胞培养过程中当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制，此时，瓶壁上形成单层细胞。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用胰蛋白酶处理。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡，但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成无限增殖的细胞，该种细胞的粘着性降低，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量减少。
(3)用大分子染料对细胞进行染色时，活细胞不被染色，原因是活细胞的细胞膜具有选择透性，大分子染料不能进入活细胞内。
(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到有丝分裂中期的细胞用显微镜进行观察，因为有丝分裂中期的染色体形态稳定、数目清晰，便于观察。
(5)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了免疫排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作抗原进行攻击。
6.某医院病理室为确诊患者的肿瘤是良性还是恶性，切取一小块肿瘤组织进行培养。请回答下列问题：
(1)实验中所用的细胞培养液中，除水之外通常需要维生素、无机盐、葡萄糖和________等。
(2)若开始培养时取一滴培养液观察有100个肿瘤细胞，经24 h培养后，取一滴稀释100倍后再取一滴(设三次“一滴”等量)观察，发现有64个肿瘤细胞，此肿瘤细胞的细胞周期约为________ h。
(3)与正常细胞相比，在显微镜下可见明显增多的细胞器是________。
(4)某科研单位研制出一种新型药物X，据说对此类肿瘤有较好的疗效，请你设计一个方案加以验证。写出你所设计的实验步骤：
①________________________________________________________________________。
②________________________________________________________________________。
③________________________________________________________________________。
(5)设计表格记录实验结果。
答案　(1)氨基酸、血清　(2)4　(3)线粒体、核糖体(其他正确答案也可)　(4)①将相同的培养液分为相等的两份，一份(A)加入药物X，另一份(B)不加药物X ②将等数量的肿瘤细胞置于两份培养基中 ③放在相同条件下培养，定期取样观察肿瘤细胞生长情况
(5)实验结果如表所示
项目
培养液A
培养液B
4 h


8 h


12 h


…


解析　(1)动物细胞培养所需营养物质有糖类、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，另外还需加入血清、血浆等一些天然成分。(2)由2n＝6 400/100＝64，可得n＝6，即24小时分裂6次，一个细胞周期为4 h。(3)肿瘤细胞能无限增殖，在分裂时要进行DNA的复制和有关蛋白质的合成，因此线粒体、核糖体等细胞器较多。(4)设计实验要注意控制无关变量，即遵循单一变量原则。

题组一　动物细胞培养和动物组织培养
1.下列关于动物细胞和组织培养的叙述，错误的是(　　)
A.动物细胞和组织培养是动物克隆技术的基础
B.用于培养的细胞最好取自健康动物体内的组织细胞
C.动物细胞培养是将所取的组织先用胰蛋白酶进行处理，使其分散成单个细胞
D.动物细胞、组织通过培养最终在体外能发育成一个新个体
解析　动物细胞的全能性随分化程度的提高而受到限制，分化潜能变弱。动物细胞和组织在体外不能发育为成熟的动物个体。答案　D
2.下列关于动物细胞培养的叙述中，正确的是(　　)
A.培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞
B.克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变
C.二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的
D.恶性细胞系的细胞可进行传代培养
解析　动物细胞在培养过程中有接触抑制现象，细胞在培养瓶中会贴壁生长，形成一层细胞，相互接触后停止生长，A错误；克隆培养法培养过程中，仅有极少数细胞的基因型会发生改变，B错误；二倍体细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去了，C错误；恶性细胞系的细胞具有不死性，可以进行传代培养，D正确。答案　D
3.某研究小组对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行培养，下列叙述正确的是(　　)
A.制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理
B.肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸
C.为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的干扰素
D.甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象
解析　制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胰蛋白酶处理，使组织细胞分散开，A项错误；肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2维持培养液pH，不是刺激细胞呼吸，B项错误；抗生素可以杀死细菌，而干扰素对病毒起作用，因此，为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素，C项错误；甲(肝肿瘤细胞)失去接触抑制，而乙(正常肝细胞)具有接触抑制现象，因此甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象，D项正确。答案　D
题组二　原代培养与传代培养、细胞系和细胞株
4.动物体内的细胞不易受到外界细菌、病毒等微生物的感染，原代培养的细胞(　　)
A.对微生物有一定的防御能力
B.细胞培养的环境中可以有一定量的微生物
C.对微生物已失去了防御能力
D.刚离体的细胞必须生活在无菌条件下，以后的培养对无菌条件要求不严格
解析　动物体具有一定免疫力，是因为动物体具有非特异性免疫系统和特异性免疫系统，对各种病原微生物有一定的防御能力，而离体的动物细胞失去了对各种微生物的防御能力，因此，动物细胞培养的环境中不能存在微生物，否则，动物细胞就会死亡。答案　C
5.动物细胞培养中，出现遗传物质改变的细胞是(　　)
A.连续细胞系 B.细胞株 C.原代细胞 D.传代细胞
解析　连续细胞系被认为是发生转化了的细胞系，大多数具有异倍体核型。答案　A
6.下列有关克隆技术的叙述正确的是(　　)
A.动物细胞培养时，保留接触抑制的连续细胞系获得不死性，但不致癌
B.由于植物细胞具有全能性，水稻等在多次传代培养后，细胞全能性的表达能力不变
C.从个体中分离出单个组织进行培养是细胞克隆最基本要求
D.原生质体的获取需在较低渗透压的环境下进行
解析　动物细胞培养时，保留接触抑制的连续细胞系获得不死性，但不致癌，A正确；植物细胞具有全能性，水稻等在多次传代培养后，细胞全能性的表达能力越来越小，B错误；从个体中将细胞分散成单个，制成细胞悬浮液，是动物细胞克隆最基本要求，C错误；原生质体的获取需在0.5～0.6 mol/L较高渗透压的甘露醇溶液中进行，D错误。答案　A
题组三　动物细胞培养与植物组织培养的比较
7.动物细胞培养与植物组织培养的重要区别在于(　　)
A.培养基不同 B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行
C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能 D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株
解析　动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基不同，动物细胞一般用液体培养基培养，而植物细胞一般用固体培养基培养；与植物组织培养的培养基相比，动物细胞培养的培养基中还要添加动物血清等；它们都是在无菌条件下培养的。答案　A
8.(2018·温州高二检测)下表是有关动物细胞培养与植物组织培养的比较，错误的是(　　)
选项
比较项目
动物细胞培养
植物组织培养
A
原理
动物细胞核的全能性
植物细胞的全能性
B
培养基
液体培养基
固体培养基
C
主要过程
原代培养，传代培养
脱分化，再分化，形成植株
D
主要应用
获得大量细胞或细胞产物
植物快速繁殖、获得脱毒苗等
解析　植物组织培养的原理是植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理是细胞增殖，A项错误；动物细胞培养使用液体培养基，制成细胞悬浮液，植物组织培养一般使用固体培养基，B项正确；动物细胞培养的主要过程是原代培养和传代培养，植物组织培养的主要过程是脱分化，再分化，形成植株，C项正确；动物细胞培养的主要应用是获得大量细胞或细胞产物，植物组织培养的主要应用是植物快速繁殖、获得脱毒苗、制备人工种子等，D项正确。答案　A
9.(2018·义乌高二检测)下列关于动物细胞培养和植物组织培养的叙述，错误的是(　　)
A.动物细胞培养中用于培养的细胞多取自动物胚胎或幼龄动物
B.动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶
C.烟草叶片离体培养能产生新个体，动物细胞可离体培养增殖
D.动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖培养可用于植物脱除病毒
解析　动物细胞培养中一般选择幼嫩的细胞，如胚胎细胞或幼龄动物的细胞，A项正确。动物细胞培养需利用胰蛋白酶将动物组织分散成单个细胞再进行培养，植物组织培养中不需要将细胞分离为单个细胞，B项错误。叶片细胞高度分化，但仍具有全能性，可以通过植物组织培养形成新个体；动物细胞可离体培养增殖，C项正确。有毒物质会影响动物细胞正常的生命活动，故可根据动物细胞在培养过程中生命活动的变化情况检测有毒物质；植物茎尖细胞分裂较快，细胞中几乎无病毒，故可用茎尖通过植物组织培养形成脱毒苗，D项正确。答案　B
10.动物细胞体外培养时，通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。如图是血清对正常细胞和癌细胞培养的影响实验结果。从该图提供的信息获得的结论，不正确的是(　　)
A.正常细胞与癌细胞的增殖速率相同
B.有无血清对正常细胞培养的影响不同
C.培养基中补充血清有助于正常细胞的培养
D.培养基中是否补充血清对癌细胞的培养影响不大
解析　动物细胞培养时通常要在培养基中加入血清等物质。从图示中可看出，癌细胞与正常细胞的增殖速率不同；有血清时正常细胞增殖快，而有无血清对癌细胞的培养影响不大。答案　A
11.(2018·乐清高二检测)请回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)在动物细胞培养中，通常在合成培养基中加入一定量的抗生素，其目的是__________________________。
(2)在使用合成培养基时，通常需加入血清等一些天然成分，作用是__________________________________。
(3)在细胞培养过程中，通常在______________________________条件下保存细胞。
(4)若在营养全面的动物细胞培养液中不慎混入了一种细菌，结果所培养的细胞全部死亡。从科学严谨性的角度考虑，能不能直接认为这些细胞的死亡就是该种细菌导致的？________，理由是___________________
__________________________________________________________________________________________。
答案　(1)防止杂菌污染　(2)补充培养基中缺乏的物质
(3)冷冻(或超低温、液氮)　(4)不能　也可能是环境中其他因素或操作错误或取材不当导致了细胞的死亡
解析　(1)通常在动物细胞培养基中加入一定量的抗生素，以防止培养过程中的杂菌污染。
(2)在动物细胞体外培养过程中，使用合成培养基时通常需加入血清等天然成分，补充培养基中缺乏的物质。
(3)通常在冷冻(或超低温、液氮)条件下保存细胞，这种条件下，细胞中酶的活性降低，细胞代谢速率降低。
(4)从科学严谨性的角度考虑，这些细胞的死亡可能是该种细菌导致的，也可能是环境中其他因素或操作错误或取材不当导致的。
12.动物器官的体外培养技术对于研究器官的生理、病理过程及其机制意义重大。如图是一个新生小鼠的肝脏小块培养装置示意图。请回答下列问题：
(1)将肝脏切成小薄片，这有利于肝脏细_________________________________________________________。
(2)气室中充入5% CO2气体的主要作用是_______________________________________________________。
(3)如果经细胞培养形成的皮肤组织移植给患者，培养的细胞来源最好是________________________，以避免移植后发生排斥现象。
答案　(1)吸收氧气和营养物质、排出代谢废物　(2)维持培养液适宜的pH　(3)患者本人的健康皮肤
解析　(1)将肝脏切成小薄片，有利于肝脏细胞透过滤纸从培养液中吸收营养物质。同时有利于与外界进行气体交换和自身代谢废物的排出。(2)组织培养时5% CO2有维持培养液pH的功能。(3)皮肤克隆就是皮肤细胞进行有丝分裂增殖，其遗传物质没有改变，培养的细胞来源最好是患者本人的健康皮肤，以防移植后发生排斥现象。
13.下图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线(图中B、E两点表示经筛选后继续培养)，请据图回答下列问题：
(1)OB段的培养称为________培养，AB段可能发生了____________现象，需要用________酶处理使组织细胞分散开来，分装到多个卡氏瓶中进行________培养。
(2)上述动物细胞培养过程中有很多重要的现象，下列叙述正确的是________。
A.E点以后的细胞大多数具有二倍体核型
B.培养过程中某些细胞癌变后能在合适条件下逆转为正常细胞
C.由B点后筛选出多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆
D.未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状
(3)动物细胞培养一般放在__________培养箱中，提高培养成功率还可在培养基中添加一些物质或细胞，加入滋养细胞的目的是____________。
答案　(1)原代　接触抑制　胰蛋白　传代　(2)B　(3)CO2恒温　支持生长
解析　(1)动物细胞10代以内的培养都可以称为原代培养，培养过程中由于存在接触抑制，会出现增殖停止现象，此时需要用胰蛋白酶处理使细胞分散开来，进行传代培养。(2)E点以后的细胞可以无限增殖，大多数具有异倍体核型，A错误；癌细胞在适宜的条件下可以逆转为正常细胞，B正确；由B点后筛选出1个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆，C错误；未经克隆化的细胞系具有异质性，D错误。(3)动物细胞培养一般放在CO2恒温培养箱中，为提高培养成功率，培养基中还需加入滋养细胞以支持生长。
(二)动物的细胞融合技术及应用
1.细胞融合与细胞杂交
(1)细胞融合
①含义：指 两个或多个细胞 融合成一个细胞的现象。
②原理：细胞膜的流动性
③促融方法：灭活的 仙台病毒 、 聚乙二醇 介导下融合、电融合技术(低压交流电场中击穿质膜脂双层导致胞质通融)等，其中 电融合技术 是效率很高的新型细胞融合技术。
(2)细胞杂交
①概念： 基因型不同 的细胞间的融合。
②应用：细胞杂交中 染色体 容易丢失，利用杂交细胞检测特定 染色体丢失 与特定基因产物(蛋白质)减少的对应关系可进行 基因定位 。
(3)细胞融合成功的标志：杂交细胞进行有丝分裂。
(4)优点：克服了有性杂交方法的局限性，打破了物种界限的限制。
(5)应用：应用于细胞遗传、细胞免疫、肿瘤防治和生物新品种培育等，特别是利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术。
2.单克隆抗体的制备
(1)原理：一个(或一种)浆细胞(效应B细胞、B淋巴细胞)只产生一种抗体，小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖。因此杂交瘤细胞具备了既能无限增殖，又能大量产生单一抗体的特征。
(2)用杂交瘤技术制备单抗的基本方法
①用外界抗原刺激动物(如小鼠、兔子等)，使其发生免疫反应，使B淋巴细胞产生抗体；
②利用仙台病毒或聚乙二醇等作介导，使经免疫的动物的细胞与可以无限传代的骨髓瘤细胞融合；
③经过筛选、克隆培养，获得来自单一细胞的既能产生特异抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞克隆。
(3)过程

(4)杂交瘤细胞的特点： 无限增殖 ，产生 单克隆抗体 。
(5)单克隆抗体的优点：其识别抗原部位的专一性，比一般抗血清 优越得多 ，原因是一般抗血清中的抗体是 一群识别不同抗原部位的抗体混合物 。
(6)单克隆抗体的应用：单抗可作为 特异探针 ，研究相应抗原蛋白的 结构 、 细胞学分布 及其 功能 。
特别提醒　单克隆抗体与血清抗体比较
项目
分泌细胞
特点
生产
单克隆抗体
杂交瘤细胞
特异性强、灵敏度高
产量高，易纯化分离
血清抗体
各B淋巴细胞
特异性差、灵敏度低
产量低，分离困难


归纳总结　有关细胞融合与制备单克隆抗体的几个关键点
(1)细胞融合完成的标志：细胞核融合成一个核。
(2)杂交瘤细胞的特点：兼有两个亲本细胞的特性，即在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生具有某种特异性的抗体。
(3)获取单克隆抗体的场所：若在培养基中进行杂交瘤细胞培养，则从培养液中提取；若在小鼠或其他动物腹腔中培养，则从腹水中提取。(扩大培养)
(4)制备单克隆抗体的过程中两次筛选的目的不同。
①第一次筛选：由于细胞融合是随机的，因此细胞混合物中融合细胞将以多种形式出现，因此必须从中筛选出既能分泌抗体同时又能大量增殖的杂交瘤细胞。可用特定的选择培养基筛选，得到杂交瘤细胞。
②第二次筛选：从杂交瘤细胞群中选出能产生专一抗体的特异性杂交瘤细胞。
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养基获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。可用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群。
(5)B淋巴细胞和骨髓瘤细胞诱导融合后不只产生一种细胞。融合后可能存在五种细胞，即未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、B—B融合细胞、瘤—瘤融合细胞、B—瘤融合细胞。
(6)一般血清中的抗体是一群识别不同抗原部位的抗体混合物，而单抗可以专一性识别抗原分子的特殊部位，比一般血清中的抗体优越。
例1　单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培养基上不能存活增殖的细胞是(　　)
①B淋巴细胞　②小鼠骨髓瘤细胞　③B淋巴细胞自身融合细胞　④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞　⑤杂交瘤细胞
A.①②③④ B.①③⑤ C.②④ D.①③
单克隆抗体的制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合时，有以下三种情况：未发生融合的细胞(B淋巴细胞、小鼠骨髓瘤细胞)；自身融合的细胞(B淋巴细胞自身融合、小鼠骨髓瘤细胞自身融合)；骨髓瘤细胞与单个B淋巴细胞融合的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞是制备单克隆抗体必需的，要将其筛选出来。答案A
例2　(2019·衢州高二检测)如图为制备单克隆抗体的流程。请据图回答下列问题：

(1)诱导动物细胞融合的基本原理是________________________________________________。
(2)诱导动物细胞融合的方法和诱导植物原生质体融合的方法类似，两者常用的化学诱导剂是______________，两者的主要区别是可用______________________来诱导动物细胞融合。
(3)过程③要获得所需要的X细胞，至少需要通过2次筛选和克隆培养，其中第一次筛选的目的是获得____________。图中X细胞具有_________________________________________________________的特点。
(4)从图中可以看出，单克隆抗体的制备过程运用了动物细胞融合、________________等动物细胞工程技术。
答案　(1)细胞膜的流动性　(2)聚乙二醇(PEG)　灭活的仙台病毒　(3)杂交瘤细胞　既能无限增殖，又能产生特异性抗体　(4)动物细胞培养
解析　(1)诱导细胞融合的基本原理是细胞膜的流动性。
(2)诱导动物细胞融合的方法和诱导植物原生质体融合的方法类似，两者常用的化学诱导剂是聚乙二醇，两者的主要区别是可用灭活的仙台病毒来诱导动物细胞融合。
(3)融合后的细胞经过筛选才能获得所需要的目的细胞：第一次筛选是在选择培养基上培养，非杂交瘤细胞和未融合的细胞不能在此培养基上生长，杂交瘤细胞能在此培养基上生长。杂交瘤细胞具有既能无限增殖，又能产生特异性抗体的特点。
(4)从图中可以看出，单克隆抗体的制备过程运用了动物细胞融合、动物细胞培养等动物细胞工程技术。
(三)动物的克隆繁殖
1.不同的动物细胞及全能性的表现程度
(1)受精卵：具有使后代细胞形成 完整个体 的潜能。
(2)二分裂球：具有 全能性 ，每一个细胞都可以发育为完整的个体，可形成 同卵孪生 个体。
(3)多能细胞：具有分化为 多种组织细胞 的潜能。
(4)单能细胞：只能分化为 一种细胞 。
(5)已分化的细胞： 不再分化 为其他细胞，甚至终生不再分裂。
2.动物难以克隆的根本原因：
(1)在动物的个体发育过程中，动物的体细胞已发生分化，细胞分化使得细胞在形态和功能上高度特化，但是各种特化细胞的细胞核中遗传物质不变，即物质的基因组完整，具有全能性。基因组中的基因并不同时进行活动，有的基因甚至不表达任何基因产物，这是由于细胞内伴随着它们在发育过程中时间、空间的变化，发生了基因的差异表达，有的基因开放，有的基因关闭。
(2)来自动物的体细胞均已发生了分化，基因组中基因的活动 很不完全 ，不能像受精卵那样发挥细胞的全能性，以此为起点进行动物克隆，难度很大。
(3)基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。
(4)不同的分化细胞，其基因组的表达情况不同：一类基因是维持生存的，这些基因在任何活细胞中均能表达，如与细胞呼吸有关的酶的基因；另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达，如胰岛素原基因只在胰岛β细胞中才能表达，在其他任何细胞均不能表达。
3.实现动物克隆的基本要求
(1)分化程度低的细胞比较容易实现克隆，如胚胎细胞。
(2)细胞核具有全能性，要保证细胞的完整性。
(3)必须提供促进基因表达全能性的条件，如去核的卵细胞，它的体积相对较大，易操作，此外卵细胞的细胞质含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。
4.动物体细胞克隆

原理和主要技术：利用 细胞核 的全能性进行 核移植 ，将动物的一个细胞核移入一个已经去掉细胞核的 卵细胞 中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体(克隆动物)。
5.克隆动植物的应用
(1)为 遗传疾病 的治疗、优良品种的培育等提供了重要途径。
(2)对物种的优化、 濒危动物 的保存和对转基因动物的扩群有重要意义。
(3)丰富了人们的物质生活，可降低畜牧业的成本，缩短 育种年限 ，提高生产效率。
归纳总结
1.细胞核移植的原理
动物体细胞核移植的原理是细胞核的全能性，而不是动物细胞的全能性。因为动物体细胞的全能性受到限制，不能经培养直接发育成完整个体，所以用体细胞核移植技术能够得到克隆动物，说明动物体细胞的细胞核具有全能性。
2.供体和受体的选择
(1)供体：一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。
(2)受体：卵细胞。其原因是：
①卵细胞的细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。
②卵细胞体积大，便于操作。
③卵细胞内卵黄多，营养物质丰富。
3.克隆动物的遗传特点
克隆动物的亲本有三个，即体细胞核供体、卵细胞细胞质供体和代孕母体。
(1)克隆动物细胞核基因来自于体细胞核供体，因此，克隆动物的性状与体细胞核供体基本相同。
(2)克隆动物的细胞质基因来自于卵细胞，因此，克隆动物的性状与卵细胞供体部分相同。
(3)代孕母体没有为克隆动物提供遗传物质，因此，克隆动物的性状与代孕母体没有直接关系。
4.动物克隆的成功证明：高度分化的细胞经过一定的技术处理，也可以恢复到类似受精卵时期的功能；在胚胎和个体发育过程中，细胞质具有调控细胞核(包括异源的细胞核)发育的作用。
5.无论是分化还是癌变，变化的都是表现型，基因组成的完整性可以保留，具有全能性，且癌细胞仍可逆转为正常细胞。
例3　(2018·宁波调研)下列有关克隆的叙述，错误的是(　　)
A.动物难以克隆的根本原因是基因组中的基因不完整
B.细胞克隆可用于从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系
C.“多莉”绵羊的性状与供核绵羊不完全相同
D.动物细胞培养需要用胰蛋白酶把组织分散成单个细胞
解析　动物难以克隆的根本原因是动物细胞的全能性受到抑制，全能性降低，A错误；细胞克隆的主要用途之一，就是从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系，B正确；“多莉”绵羊的细胞核基因来自供核绵羊，而细胞质基因来自提供细胞质个体，所以其性状与供核绵羊不完全相同，C正确；动物细胞培养需要用胰蛋白酶把组织分散成单个细胞，D正确。答案　A
易混易错　利用酶解法获得的组织单细胞悬液中含有不同类型的细胞，进行细胞克隆时，需要保证分离出来的细胞是一个而不是多个，即必须确保所建成的克隆来源于单个细胞。
例4　(2018·全国Ⅲ，38)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指_______________________________________。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目________(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度________(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是________________________________________。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得的两个克隆动物体细胞的常染色体数目____(填“相同”或“不同”)，性染色体组合____(填“相同”或“不同”)。
答案　(1)将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵细胞中　不变　(2)小于　胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易　(3)相同　不同
解析　(1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵细胞中，形成重组细胞。重组细胞形成的早期胚胎可移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞的染色体数目与提供细胞核的个体的体细胞相同。
(2)由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。
(3)哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目是相同的，性染色体组合是不同的。若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，则得到的克隆动物的体细胞中常染色体的数目相同，性染色体组合不同。

1.判断正误：
(1)细胞核移植是体细胞克隆的关键步骤(　　)
(2)动物杂交瘤细胞产生单克隆抗体体现了细胞的全能性(　　)
(3)体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体(　　)
(4)细胞克隆可以来源于多个细胞(　　)
(5)B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞既能产生特殊的抗体又能在细胞培养条件下无限增殖(　　)
(6)核移植后的重组细胞最初分裂时复制了DNA，也进行了基因表达(　　)
(7)单抗的制备运用了动物细胞培养技术和动物细胞融合技术(　　)
(8)将雄羊的体细胞核移入雌羊的卵细胞中，产生的克隆羊发育成熟后分泌雌激素(　　)
答案　(1)√　(2)×　(3)×　(4)×　(5)√　(6)×　(7)√　(8)×
2.下列关于动物细胞融合的说法，不正确的是(　　)
A.细胞融合和细胞培养是细胞工程的主要技术手段
B.细胞融合可以发生在相同基因型或不同基因型细胞之间
C.常用于诱导动物细胞融合的手段：聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激、紫外线照射
D.细胞融合被誉为免疫学中的一次革命，主要是其促进了单抗技术的发展
解析　动物细胞工程的主要技术手段有动物细胞培养和动物细胞融合，A正确；细胞融合可以在基因型相同或不同的细胞间进行，B正确；常用于诱导动物细胞融合的手段：聚乙二醇、灭活的仙台病毒、电刺激等，紫外线照射不可以诱导动物细胞融合，C错误；细胞融合技术促进了单抗技术的发展，被誉为免疫学中的一次革命，D正确。答案　C
3.(2019·海宁高二检测)下列有关动物细胞全能性的叙述中，错误的是(　　)
A.低等动物细胞全能性一般比较容易体现
B.受精卵第一次卵裂产生的细胞具有全能性
C.造血干细胞在体外培养可培育成一个生物体
D.癌细胞仍可能转化成为正常细胞，因为它保留了基因组的完整性
解析　造血干细胞分化潜能变窄，只能分化为多种血细胞或某种血细胞。答案　C
4.下图为克隆羊“多莉”的培育过程示意图，下列相关表述错误的是(　　)

A.克隆羊“多莉”的主要性状与甲羊一致，因为其细胞核基因来自甲羊
B.克隆羊“多莉”的培育过程中采用的生物技术有细胞核移植和胚胎移植
C.乙羊的去核卵细胞为重组细胞的基因表达提供了细胞内的环境条件
D.此过程说明高度分化的动物细胞具有全能性
解析　生物的性状主要由细胞核中的遗传物质控制，克隆羊的主要性状与提供细胞核的个体基本一致，A正确；甲羊的体细胞核移植到去核的卵细胞中形成重组细胞后，在体外适宜条件下培养至早期胚胎再移植到第三只羊的子宫内完成妊娠、分娩等过程，用到了细胞核移植技术和胚胎移植技术，B正确；选择去核卵细胞是因为其细胞质中含有使体细胞核表达全能性的物质，C正确；此实验只能说明高度分化的动物细胞的细胞核具有全能性，D错误。答案　D
5.单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV－1)可引起水泡性口唇炎。利用杂交瘤技术制备出抗HSV－1的单克隆抗体可快速检测HSV－1。回答下列问题：
(1)在制备抗HSV－1的单克隆抗体的过程中，先给小鼠注射一种纯化的HSV－1蛋白，一段时间后，若小鼠血清中抗______________的抗体检测呈阳性，说明小鼠体内产生了________反应，再从小鼠的________中获取B淋巴细胞。将该B淋巴细胞与小鼠的________细胞融合，再经过筛选、检测，最终可获得所需的杂交瘤细胞，该细胞具有的特点是__________________。
(2)若要大量制备抗该蛋白的单克隆抗体，可将该杂交瘤细胞注射到小鼠的________中使其增殖，再从________中提取、纯化获得。
(3)通过上述方法得到的单克隆抗体可准确地识别这种HSV－1蛋白，其原因是该抗体具有________和________等特性。
答案　(1)HSV－1蛋白　体液免疫　脾脏　骨髓瘤　无限增殖且产生专一抗体　(2)腹腔　腹水　(3)纯度高　特异性强
解析　(1)给小鼠注射HSV－1后，小鼠体内发生体液免疫，小鼠血清中产生抗HSV－1蛋白的抗体。B淋巴细胞是从小鼠的淋巴器官中(如脾、骨髓、扁桃体、胸腺等)获取。杂交瘤细胞由B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合而来，具有两个亲本细胞的特性；既能无限增殖，又能产生特异性抗体。(2)若想获得大量单克隆抗体，通常有两种方法：一是将杂交瘤细胞在动物细胞培养液中培养，然后从动物细胞培养液中筛选分离出单克隆抗体；二是将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中使其增殖，然后从小鼠的腹水中提取纯化获得。(3)单克隆抗体具有特异性强、纯度高的特点。

题组一　细胞融合与细胞杂交
1.(2019·金华模拟)在“神舟”宇宙飞船上，科学家进行了空间动物细胞融合实验，该实验所依据的原理和促进细胞融合的方法分别是(　　)
A.细胞的全能性；灭活病毒诱导融合 B.细胞的全能性；电融合
C.细胞膜的流动性；灭活病毒诱导融合 D.细胞膜的流动性；电融合
解析　细胞融合的理论基础是细胞膜的流动性，在“神舟”飞船上进行动物细胞融合所用融合方法是电融合。答案　D
2.将基因型为Aa和基因型为Bb的动物体细胞混合，用灭活的仙台病毒处理后，不可能获得下列哪种基因型的细胞(　　)
A.AAaa B.AaBb C.Aabb D.BBbb
解析　基因型为Aa和基因型为Bb的动物体细胞之间可以自由融合，在两两融合(即Aa和Aa、Aa和Bb、Bb和Bb)的情况下，可产生AAaa、AaBb、BBbb三种基因型的细胞。答案　C
题组二　杂交瘤技术和单克隆抗体制备
3.制备单克隆抗体时，在培养基中加入某种试剂能筛选出杂交瘤细胞，该试剂的作用是(　　)
A.能选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制 B.能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活
C.能抑制淋巴细胞的DNA复制 D.能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质的合成
解析　在细胞融合过程中，如果仅考虑两个细胞的融合，会有淋巴细胞的两两融合、骨髓瘤细胞的两两融合、淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。单独的和融合的淋巴细胞没有增殖能力，培养一段时间会被清除；如果加入一种抑制骨髓瘤细胞DNA复制的试剂，只有杂交瘤细胞因保留有淋巴细胞的DNA复制方式，可通过选择保留下来，A项正确。答案　A
4.(2018·三门高二检测)下图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是(　　)

A.①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应细胞毒性T细胞
B.②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C.③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性
D.④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群
解析　①是已经获得免疫的B淋巴细胞，A项错误；胰蛋白酶使得组织块分散为单个细胞，B项错误；③同时具有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性，C项错误；④是经筛选后能够获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，D项正确。答案　D
5.胃癌是我国发生率很高的一种恶性疾病，制备抑制胃癌细胞增殖的单克隆抗体对治疗胃癌具有重要意义。抗胃癌单克隆抗体制备过程如下图所示。以下说法正确的是(　　)

A.诱导骨髓瘤细胞与甲融合，可用的诱导因素只有灭活的病毒
B.在甲、乙、丙及骨髓瘤细胞中，乙、丙经培养后，均可获得大量的抗胃癌单克隆抗体
C.用人的胃癌细胞反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体
D.单克隆抗体制备过程中需加入血清或血浆
解析　诱导动物细胞融合的因素除了灭活的仙台病毒外，还有聚乙二醇、电激等，A错误；只有细胞丙既能无限增殖又能产生单一抗体，B错误；用人的胃癌细胞反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体不是单克隆抗体，C错误；动物细胞培养过程中需要向合成培养基中加入血清或血浆，因为其中含有动物细胞生长所需的一些未知天然成分，D正确。答案　D
6.(2019·龙泉高一期末)下列关于用动物细胞工程获得单克隆抗体的实验步骤错误的是(　　)
A.将抗原注入小鼠体内，获得能产生相应抗体的B淋巴细胞
B.用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞
C.用聚乙二醇作诱导剂，使能产生相应抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合
D.筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体
解析　单克隆抗体的制备过程是：将一种抗原注入小鼠体内，获得能产生相应抗体的B淋巴细胞，然后将B淋巴细胞与小鼠骨髓廇细胞同时培养，在聚乙二醇的诱导下，促使经免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞，从中选出能产生相应抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体；因为动物细胞无细胞壁，所以用不到纤维素酶。答案　B
题组三　细胞核移植实验和动物的克隆繁殖
7.下列关于动物体细胞克隆的叙述中，错误的是(　　)
A.供体为体细胞的细胞核 B.受体为去核卵细胞
C.细胞核移植是动物克隆的关键步骤 D.克隆出的后代与供体的遗传物质和表现型完全一致
解析　经体细胞核移植形成的克隆动物，遗传物质主要由供体细胞核提供，但也含有受体细胞质中的遗传物质，因此克隆动物与供体的遗传物质不完全相同，在相同条件下其表现型也不完全相同。答案　D
8.(2018·绍兴高二检测)美国食品和药物管理局2008年1月15日宣布，经过克隆的牛、猪和山羊以及它们的后代均可以安全食用，克隆牛产的奶也可安全食用。除个体水平的克隆外，还有分子、细胞、器官等水平的克隆，下列不属于克隆技术的是(　　)
A.从出生不久的小鼠心脏取下细胞在体外离体培养成细胞系
B.使某些特定的外源基因在哺乳动物体内表达
C.农业生产上利用马铃薯的芽繁殖马铃薯
D.将单个B淋巴细胞进行无性繁殖
答案　B
9.美国德克萨斯州科学家培育出世界上第一只克隆猫，这只小猫毛色花白，看上去完全不像生养它的花斑猫妈妈，也不完全像为它提供细胞核的基因猫妈妈。对该克隆猫毛色的解释合理的是(　　)
①发生了基因突变　②提供卵细胞的雌猫细胞质基因进行了表达　③表现型是基因型与环境共同作用的结果　④代孕花斑猫妈妈的基因进行了表达
A.① B.②③ C.②③④ D.①②③④
解析　克隆猫的基因主要来自于重组细胞核提供者，其细胞质基因来自于卵细胞提供者，代孕者不提供遗传物质。因此，其毛色完全不像生养它的花斑猫妈妈，也不完全像为它提供细胞核的基因猫妈妈。其实，即使其遗传物质完全来自于核提供者——基因猫，毛色也未必就与之完全相同，因为生物的表现型也会受到环境的影响。答案　B
10.(2018·台州中学检测)图中甲、乙、丙表示生物个体或结构，
①～③表示相应过程，下列叙述与图示不符的是(　　)

A.若甲为二倍体植株，乙为花粉粒，丙为单倍体，则③过程需要用秋水仙素处理
B.若甲为植物体的一部分，乙为愈伤组织，丙为胚状体，则①过程通常在避光的条件下进行
C.若甲为成熟哺乳动物个体，乙为配子，丙为受精卵，则基因重组发生在②过程中
D.若甲为成年母羊，乙为去核的卵细胞，丙为重建合子，则②过程的核心技术有核移植技术
解析　若甲为二倍体植株，乙为花粉粒，丙为单倍体，则①表示减数分裂，②表示花药离体培养，③过程需要用秋水仙素处理，A项与图示相符；若甲为植物体的一部分，乙为愈伤组织，丙为胚状体，则①过程表示脱分化，通常在避光的条件下进行，B项与图示相符；若甲为成熟哺乳动物个体，乙为配子，丙为受精卵，则基因重组发生在①减数分裂过程中，C项与图示不符；若甲为成年母羊，乙为去核的卵母细胞，丙为重建合子，则②过程的核心技术有核移植技术，D项与图示相符。答案　C
11.(2018·绍兴一中模拟)甲、乙两图分别是单克隆抗体制备过程和克隆羊“多莉”培育过程示意图，请据图回答下列问题：

(1)图甲和图乙所示的过程中，都必须用到的动物细胞工程技术手段是______________。
(2)图甲中②过程常在________________诱导下完成，④过程与体外培养相比，其优点是不需特定的培养基，不需严格的外界环境条件。融合的细胞具有两种细胞的特性，即____________和____________________。
(3)单克隆抗体能定向攻击癌细胞，主要是利用其________。
(4)若不考虑环境因素影响，克隆羊的性状并非全部像白面绵羊的原因是_____________________________。
(5)图乙过程的技术具有多种用途，但是不能(　　)
A.有选择地繁殖某一性别的家畜 B.繁殖家畜中的优良个体
C.用于保存物种 D.改变动物的核基因
(6)在目前现有技术条件下，还不能将从动物体内分离出来的成熟的体细胞直接培养成一个新个体，而是必须将体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中才能发育成新个体，你认为最主要的原因是(　　)
A.卵细胞大，便于操作 B.卵细胞含有的营养物质多
C.卵细胞的细胞质可使体细胞细胞核全能性得到表达 D.重组细胞才具有全能性
答案　(1)动物细胞培养　(2)聚乙二醇(或灭活的仙台病毒、电刺激)　无限增殖　产生单一抗体　(3)特异性
(4)卵细胞的细胞质中的遗传物质也能控制某些性状 (5)D 　(6)C
解析　(1)制备单抗和培养克隆羊的过程中都用到了动物细胞培养技术。(2)形成杂交瘤细胞，可用一些方法诱导完成：物理方法如电融合技术，化学方法如聚乙二醇，生物方法如灭活的仙台病毒。杂交瘤细胞不但具有无限增殖的特性，还能产生特定的单一抗体。(3)单克隆抗体由于具有特异性，所以可以定向与抗原结合。(4)不考虑环境因素的影响，克隆羊的性状也不完全和提供细胞核的绵羊相同，因为卵细胞的细胞质中也有遗传物质，也能控制某些性状。(5)图乙过程用到的技术有核移植技术、胚胎培养和胚胎移植技术，可以用于保存濒危物种、繁殖家畜中的优良个体、有选择地繁殖某一性别的家畜等，但是无法改变动物的核基因。(6)将体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中才能发育成新个体，主要是因为卵细胞的细胞质可使体细胞的细胞核全能性得到表达。
12.(2019·杭州高二检测)现代人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程之一如图。据图回答下列问题：

(1)过程①代表的是______________，过程①所需原料为________________________。
(2)过程⑥采用的实验技术是________________，获得的X是______________。B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，至少需经________次筛选才能选出产生所需单一抗体的杂交瘤细胞，然后要用________________技术在体外培养，培养时配制的培养基是________(填“固体”或“液体”)培养基，其成分与培养植物细胞的培养基相比，不同的是含有葡萄糖和___________等。
(3)若将含有A基因的受体细胞在体外培养时，必须满足无菌无毒、营养、________________、气体环境等条件，才能使细胞大量增殖，其中培养环境中的空气必须加5%的CO2，目的是______________________。
(4)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的__________制成的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离出病毒，与已知病毒的____________进行比较；或用图中的________________________进行特异性结合检测。
答案(1)逆转录　4种游离的脱氧核苷酸　(2)动物细胞融合　杂交瘤细胞　两　动物细胞培养　液体　血清 (3)(适宜的)温度和pH　维持培养液的pH　(4)A蛋白　核酸(基因)序列　抗A蛋白的单克隆抗体
解析　(1)过程①表示以病毒RNA为模板合成病毒DNA的逆转录过程。过程①所需原料为4种游离的脱氧核苷酸。
(2)过程⑥采用的是动物细胞融合技术，由B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成的X是杂交瘤细胞，至少需经两次筛选才能选出产生所需单一抗体的杂交瘤细胞，然后要用动物细胞培养技术在体外培养，培养时配制的培养基是液体培养基，其成分与培养植物细胞的培养基相比，不同的是含有葡萄糖和血清等。
(3)含有A基因的受体细胞(动物细胞)在体外培养时，必须满足无菌无毒、营养、(适宜的)温度和pH、气体环境等条件，其中培养环境中的空气必须加入5%的CO2的目的是维持培养液的pH。
(4)由题意“该病毒表面的A蛋白为主要抗原”可知：对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程产生的A蛋白制成的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离出病毒，与已知病毒的核酸(基因)序列进行比较，或用图中的抗A蛋白的单克隆抗体进行特异性结合检测。
13.如图是克隆羊的培育过程示意图，请据图回答：

(1)克隆羊D的繁殖方式是____________。
(2)写出图中①、②所指的细胞工程技术的名称：①______________；②______________。
(3)羊D的表现型与羊________相同，基因型是______，性别是________。请根据遗传学原理说明判断的依据：______________________________________________。
(4)若培育克隆羊时，将羊B换成雄性且基因型为Aa，那么培育出的克隆羊D的性别将是________。
答案　(1)无性繁殖　(2)细胞核移植　胚胎移植　(3)B
aa　雌性　羊D全部的细胞核基因来自于基因型为aa的羊B　(4)雄性