专题29 酶的应用(选修1)教师版

这是一份专题29 酶的应用(选修1)教师版，共16页。
专题29 酶的应用
考点
知识内容
考试属性及要求
加试
一、酶的应用
3.果汁中的果胶和果胶酶
4.α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
掌握程度参考本考试标准中的：二、(二)
3.实验与探究能力

一、果汁中的果胶和果胶酶
1、 果胶
（1）果胶的功能：果胶是植物 细胞壁 以及 胞间层 的主要成分。起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。
（2）果胶的组成：果胶是由 半乳糖醛酸 和 半乳糖醛酸甲酯 组成的高分子化合物，不溶于 水 。
（3）果胶的特性：果胶不溶于 乙醇 ，这是鉴别果胶的一种简易方法。
（4）应用： 山楂(山里红) 的果实中果胶含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕。
2、果胶酶
（1）果胶酶的化学本质：果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，主要包括 果胶酶、果胶甲酯酶 等，它的化学本质是 蛋白质 。(果胶酶水解半乳糖醛酸间的化学键；果胶甲脂酶水解半乳糖醛酸甲酯键。)
（2）作用：在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。 果胶酶 可水解果胶，瓦解植物的细胞壁和胞间层，使榨取果汁更容易，而果胶分解成可容性的 半乳糖醛酸 和 半乳糖醛酸甲酯 ，也使得浑浊的果汁变得澄清。
（3）来源：一些微生物，如 黑曲霉 、 苹果青霉等都可用于生产果胶酶。(植物、霉菌、酵母菌和细菌等)
（4）作用场所：在细胞外
（5）果胶酶的作用条件：最适pH： 3～6 ；最适温度： 45℃～50℃ 。
果胶与纤维素的比较
果胶与纤维素的比较

相同点
不同点
果胶
①都是高分子化合物
②都不溶于水
③都参与细胞壁的组成
①组成的基本单位：半乳糖醛酸
②分解所需的酶：果胶酶
纤维素
①组成的基本单位：葡萄糖
②分解所需的酶：纤维素酶
果胶酶与纤维素酶

组成
作用
果胶酶
多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶脂酶等
将不容性的果胶分解为可容性的半乳糖醛酸
纤维素酶
C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶
纤维素纤维二糖葡萄糖

果胶不溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。溶于甘油。
果胶酶并不是特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称。
知识拓展：
1、酶的提取方式
（1）提取存在于细胞内的酶：需要破碎生物组织细胞，可用破碎仪、研磨器或匀浆器等机械将组织细胞破碎，使酶从活细胞中释放出来，进入细胞外的溶液中，经过滤、离心制备成粗酶液。
（2）提取存在于细胞外的酶：唾液淀粉酶、胰蛋白酶等分泌到细胞外的酶，可以直接从动物分泌物或细胞外的组织间隙中提取。
2、制备果胶酶
（1）实验原理：从植物材料中提取果胶酶是在低温、偏酸性的提取液和NaCl作激活剂的条件下进行的。
（2）材料用具：新鲜的水果或蔬菜；质量分数为10%的NaCl溶液，0.1mol/L冰醋酸；研钵，剪刀，漏斗，纱布或滤纸，烧杯，紧密pH试纸，试管，酒精灯，离心机，榨汁机等。
（3）果胶酶的制备
①制作匀浆液：将50g新鲜的水果或蔬菜洗净，在预冷的研钵内用剪刀迅速剪碎后研磨，边研磨边加入质量分数为10%的NaCl溶液50mL，制成匀浆液。
②过滤：漏斗中放置滤纸或5层纱布过滤匀浆液，收集滤液。
③离心：以4000r/min的离心速率离心滤液15min。注意使用同一规格的离心管，离心管内滤液的高度不超过离心管长度的2/3，离心前要确保在离心机中对称放置的离心管(内含滤液)的质量相等。
④收集与保存：离心完毕后，果胶酶主要存在于离心管的上清液中，迅速地将上清液倒入洁净的小烧杯内，用0.1mol/L冰醋酸将pH调至3～4，在0～4℃下保存备用。
二、探究利用苹果或山楂匀浆制作果汁的最佳条件的实验
1、探究利用苹果或山楂匀浆制作果汁的最佳条件的实验
（1）实验原理
①果胶半乳糖醛酸+半乳糖醛酸甲酯
②果胶酶的活性受温度(或PH)的影响，处于最适温度(或PH)时活性最高。果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。
③果胶不溶于乙醇，也不溶于水。
（2） 实验流程
第一步
制备水果匀浆
第二步
烧杯A(100mL)
烧杯B(100mL)
5g匀浆
5g匀浆
10mL黑曲霉提取液(或果胶酶溶液)
10mL水
间歇搅拌20－30min
第三步
试管1
试管2
试管3
试管4
A烧杯混合物4mL
A烧杯混合物4mL
B烧杯混合物4mL
B烧杯混合物4mL
沸水浴(酒精灯上加热)
不加热
沸水浴(酒精灯上加热)
不加热
较澄清
最澄清
最浑浊
较浑浊
第四步
加入95%酒精4mL
沉淀物较少
沉淀物最少
沉淀物最多
沉淀物较多
（3） 实验结论：果胶酶能分解果胶，提高果汁的澄清度。
2、影响果汁产量的物质及处理方法
（1）影响果汁产量的物质：纤维素和果胶的存在使制作果汁时出现两个问题：一是果肉的出汁率低，耗时长；二是榨取的果汁浑浊、黏度高、容易发生沉淀。
（2）处理方法：酶解法(用果胶酶催化果胶水解为可容性半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯)。
（3）实验时可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的pH必须相同，否则将影响实验结果的准确性。











补充探究实验
1、探究温度对果胶酶活性的影响
（1） 实验原理
果胶酶的活性受温度影响。处于最适温度时，活性最高。果汁的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。
（2） 探究过程

注意：①果胶酶的适宜温度比较宽泛，因此，可以选用10℃作为温度梯度，设置的具体温度为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃等，也可以尝试以5℃作为温度梯度。
②苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。如选用苹果为原材料，一般可按每个中等大小的苹果加水100～200mL的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。
③果泥的用量可以采用5mL左右，果胶酶的用量可采用质量浓度为2%的果胶酶溶液2mL。
④水浴时间可以为20～30min。
⑤过滤果汁时，漏斗为应放置滤纸。
例：工业生产果汁时，常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高水果的出汁率，为研究温度对果胶酶活性的影响，某同学设计了如下实验：

Ⅰ．将果胶酶与苹果泥分装于不同试管，在10 ℃水浴中恒温处理10 min（如图甲）。
Ⅱ．将步骤Ⅰ处理后的果胶酶和苹果泥混合，再次在10 ℃水浴中恒温处理10 min（如图乙）。
Ⅲ．将步骤Ⅱ处理后的混合物过滤，收集滤液，测量果汁量（如图丙）。
Ⅳ．在不同温度条件下重复以上实验步骤，并记录果汁量，结果如下表：
果汁量/mL
8
13
15
25
15
12
11
10
温度/ ℃
10
20
30
40
50
60
70
80
根据上述实验，请分析回答下列问题。
（1）果胶酶能破除细胞壁，是因为果胶酶可以分解细胞壁中的果胶，产物是______________。
（2）实验结果表明，当温度为________左右时，果汁量最多，此时果胶酶的活性________。本实验是否设置了对照实验_____________（“是”或“否”）
（3）为什么该实验能够通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？
。
（1）半乳糖醛酸
（2）40℃ 最高   是
（3）果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反映了果胶酶催化果胶分解的能力（答案合理得分）
解析（1）果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要成分之一，是由半乳糖醛酸聚合而成的一种 高分子化合物。果胶酶可以将细胞壁中的果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸。
（2）本实验设置了不同温度下的对照实验。实验结果数据表明，当温度为40左右时，果汁量最多，说明此时果胶酶的活性最高。
（3）果胶酶将果胶分解为小分子物质半乳糖醛酸，小分子物质可以通过滤纸，果胶酶的分解能力大，产生的果汁多，因此苹果汁的体积大小反映了果胶酶催化果胶分解的能力。
2、探究pH对果胶酶活性的影响
（1） 实验原理：大部分酶的活性受环境pH的影响。在一定的pH下，酶反应具有最大的速率，高于或低于此值，反应速率均下降，通常称此pH为酶反应的最适pH。
（2） 实验操作流程

实验pH
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
果汁量(mL)









在探究不同pH对果胶酶活性的影响时，可以用体积分数为0.1%的NaOH溶液和盐酸进行调节pH。原因：0.1%的NaOH溶液和盐酸浓度较小，可以对pH进行微调；Na+、Cl-不参与酶的催化反应。水浴加热时要选定一个适宜的温度进行水浴加热。
3、探究果胶酶的用量对酶活性的影响
（1）实验原理：在一定的条件下，随着酶浓度的增加，果汁的体积增加；但酶浓度达到某一数值后，再增加酶的用量，果汁的体积不再改变，此值既是酶的最适用量。
（2）实验过程

实验结果分析及注意事项
（1）实验结果分析
①根据实验数据绘制出温度和pH对果胶酶活力(用酶促反应速度表示)影响的曲线图(如图a、b)、不同果胶酶用量对出汁率影响的曲线图(在浓度和体积相同的条件下，如图c)，并最终得到果胶酶最适温度、pH以及酶的最适用量。

②由于初次实验的梯度变量选择目的性不强，选择的范围有可能出现过高或过低的情况，这可以从画出的曲线中反映出来，如图所示，实验中可以根据出现的曲线进一步选择合适的梯度变量。

（2）注意事项
①苹果泥和果胶酶的用量及比例要适当。
②恒温水浴的温度可用上一实验测出的最适温度。
③在用果胶酶处理苹果泥时，为了使果胶酶能够充分催化反应，应用玻璃棒不时地搅拌反应化合物，但不宜剧烈搅拌。
探究性实验设计思维
①每个探究实验的设计，都要遵循实验设计的一般原则，特别是单因子变量原则。
②每个探究实验的设计思路都是先大梯度差值寻找最适范围，再小梯度差值选出最适温度、pH或酶用量。
③如果随酶浓度增加，果汁体积也增大，说明酶用量不足；当酶用量达一定值时，再增加酶用量，果汁体积不变，则说明这个值就是酶的最适用量。
④如果变量(温度、pH、酶浓度)梯度无法满足实验，即出现过高、过低等现象，则应及时调整实验。
（2）实验自变量与因变量的关系
变量名称
含义
实例
关系
自变量
实验中实验者所操作的因素或条件
温度或pH
自变量为原因，因变量为结果，二者是因果关系
因变量
由自变量改变而引起的变化或结果
果汁量
无关变量
除自变量以外的影响实验现象或结果的因素
酶的新鲜程度等
三、固定化酶与α-淀粉酶的固定化
（一）固定化酶
（1）固定化酶：将水容性的酶用 物理或化学 方法固定在某种介质上，使之成为 不溶于水而又有酶活性 的制剂。
（2）将酶改造成固定化酶的原因：由于酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用，所以要将酶改造成固定化酶。
（3）酶固定化方法：吸附法 、共价偶联法 、交联法 和包埋法 等。α-淀粉酶固定化实验用的是吸附法。
（4）固定化酶作用的机理：将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。






（二）常见固定化方法及其优缺点
方法
图示
原理
定义
优点
缺点
吸附法

离子键作用、物理吸附
将酶吸附到固体吸附剂的表面。固体吸附剂多为活性炭、多孔玻璃等。
适用的酶范
围广、酶活性高
酶与载体的结合力较弱，酶容易脱落
共价
偶联法

酶蛋白的一些基团，在温度和条件下与载体共价结合
将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖、离子交换树脂等载体上的固定方式。
结合稳定，
适用范围广
制备条件不够温和，酶活性较低
交联法

酶和多功能试剂
之间形成共价键
包埋法

将酶包埋在能固化的载体中
将酶包裹在多孔的载体中。常见的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
酶活性高，
稳定性也较高
适用范围窄
固定化酶技术的优点：
（1）固定在载体上的酶可以被反复利用。
（2）生产中，可通过离心法或过滤法把酶与反应液相互放开，在大规模的生产中所需工艺设备比较简单。
（3）稳定性好。
知识拓展：
1、影响酶在载体(吸附剂)上吸附程度的因素：
①pH：影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。
②离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
③蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
④温度：蛋白质往往随温度上升而减少吸附。
⑤吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
⑥载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
2、固定化酶的性质
天然酶制成水不溶性酶后，酶的性质必然有所改变，这些变化包括：
（1）稳定性增加：稳定性增加包括酶对热的稳定性、对蛋白酶的抵抗能力、对各种试剂的稳定性都有不同程度的增加。由于稳定性增加，保存期也相应延长。
（2）pH活性曲线和最适pH的变化：由于固定化后酶蛋白电荷状态变化和受载体表面电荷的影响，使得对底物作用的pH活性曲线和最适pH都将发生变化，最适pH可能向酸性或碱性方向移动，不同酶与pH有关变化需要通过实验进行确定。
（3）底物专一性：固定化酶底物专一性也有较大的变化，如蛋白酶固相酶对酪蛋白等大分子底物的催化活性降低，但对小分子底物的催化活性与天然酶差别不大。这可能是酶被固定化后引起空间障碍，大分子底物很难正确地与酶结合，不易吸附到固相酶表面而引起的。

①吸附法
利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。
常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
②载体结合法
最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括:氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂"对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺"偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。
③交联法
依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
④包埋法
酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。
酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍(如5′-磷酸二酯酶的工业应用)甚至几百倍(如青霉素酰化酶的工业应用)。
⑤磁性壳聚糖微球固体颗粒，可吸附果胶酶。
（三）淀粉水解的过程及其在淀粉指示剂下的颜色反应
（1）实验原理

本实验内容是用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。本实验使用的是枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适PH为 5.5－7.5 ，最适温度为 50－75℃ 。
（2）实验材料准备
①α-淀粉酶的固定化

②可溶性淀粉溶液：取50mg可溶性淀粉溶于100mL热水中，搅拌均匀。
③5mol/L KI－I2溶液：称取0.127g I2和0.83g KI，加蒸馏水100mL，完全溶解后装入滴瓶中。
（3）实验步骤
固定α-淀粉酶→滴管滴加淀粉溶液→加KI-I2溶液→观察→洗涤→几天后重复实验。
①将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管加淀粉溶液使淀粉溶液以0.3mL/min的流速过柱，在流出5mL后接收0.5mL流出液，加入1-2滴KI－I2溶液，观察颜色。用水稀释1倍后再观察颜色。
②实验后，以10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱，放置在4℃冰箱中，几天后再重复上述实验，观察结果。
实验结果
对照组
实验组
0.5mL淀粉液
0.5mL流出液
几天后重复实验中0.5mL流出液
加KI－I2
变蓝
红色
红色
再加水稀释1倍
浅蓝
浅红色
浅红色
注意：①在固定α-淀粉酶后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤固定化酶柱以除去未吸附的游离淀粉酶。
②实验结束后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤固定化酶柱是为了洗去残留的淀粉溶液和产物。

[诊断与思考]
1.果胶酶是一种酶，借助酶的专一性水解果胶。（  × ）
2.酶的提取一般在低温、低pH下进行。（  ×  ）
3.果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。（  √  ）
4.通过测定滤出的苹果汁的体积大小无法来判断果胶酶活性的高低。（  ×  ）
5.人们可以使用果胶酶、纤维素酶等解决制作果汁面临的出汁率低、浑浊等问题。（  √  ）
6.酶在催化时会发生变化，不可反复利用。（  ×  ）
7.固定化酶技术所用的固定载体一般为液相的。（  ×  ）
8.反应物对固定化酶的活性没有影响。（  √  ）
9.固定化酶既能与反应物接触，又能与反应物分离，提高产物品质。（  √  ）
10.一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应。（  √  ）
11.只能利用物理学的方法进行酶的固定。（  ×  ）
12.在果汁生产过程中，加入果胶酶和纤维素酶，可彻底水解细胞壁。（  √  ）
13.柱子底端分布着许多小孔的筛板属于半透膜。（  ×  ）










1．酶在大规模产业应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有（ ）
A.热稳定性 B.催化高效性 C.催化特异性 D.可反复使用性
答案D。
2．下列关于果胶酶的说法，错误的是（ ）
A.果胶酶可以分解细胞壁的主要成分果胶
B.果胶酶是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物
C.果胶酶不是特指某种酶，而是分解果胶的一类酶的总称
D.果胶酶的活性受温度、pH、酶活性抑制剂的影响
答案B。
3．下列不属于酶的固定方式的是（ ）
A.将酶包埋在细微网格中 B.将酶相互连结起来
C.将酶吸附在载体表面 D.给酶加上糖衣做成胶囊
答案D。
4．利用紫甘薯制酒可提高其附加值。请回答：
（1）为提高紫甘薯的利用率，工厂化生产时，可加入果胶酶和淀粉酶，其中果胶酶可来自 等微生物。由于酶在水溶液中不稳定，因此常将酶固定在某种介质上制成 。
（2）果胶酶可将紫甘薯匀浆中的果胶水解成
A.半乳糖醛酸和葡萄糖        B.半乳糖和果糖   
C.半乳糖醛酸甲酯和果糖      D.半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯
（3）紫甘薯匀浆流经α-淀粉酶柱后，取适量流出的液体，经脱色后加入KI-I2溶液，结果液体呈红色。表明该液体中含有
A.淀粉        B.糊精       C.麦芽糖       D.葡萄糖
（4）要发酵前，为使酵母菌迅速发生作用，取适量的干酵母，加入温水和 。一段时间后，酵母悬液中会出现气泡，该气泡内的气体主要是  。将酵母菌接种到待发酵液后，随发酵的进行，酵母菌在  条件下产生了酒精和二氧化碳。
（5）下图表示发酵液pH对酒精浓度的影响。据图判断，最佳pH值是 。
 
答案：（1）黑曲霉（或苹果表霉）    固定化酶    （2）D     （3）B     （4）蔗糖     CO2      无氧    （5）4.7

5．下面是关于固定化酶和细菌培养实验的问题。请回答：
（1）某兴趣小组欲利用固定化酶进行酶解淀粉的实验，分组见下表。
组别
固定化酶柱长度 (cm)
淀粉溶液的流速(mL · min -1 )
甲
10
0.3
乙
10
0.5
丙
15
0.3
丁
15
0.5

将吸附了α-淀粉酶的石英砂装入柱中后，需用蒸馏水充分洗涤固定化酶柱，以除去　　　　　 　　 。按上表分组，将配制好的淀粉溶液加入到固定化酶柱中，然后取一定量的流出液进行KI-I2 检测。若流出液呈红色，表明有 　　　生成；若各组呈现的颜色有显著差异，则流出液中淀粉水解产物浓度最高的是 　　组。
（2）下列关于上述固定化酶实验的叙述错误的是 　　　 。
A. 固定化酶柱长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量
B. 淀粉溶液流速过快会导致流出液中含有淀粉
C. 各组实验所用的淀粉溶液浓度应相同
D. 淀粉溶液的 pH 对实验结果有影响
（3）现有一份污水样品，某兴趣小组欲检测其中的细菌数，进行以下实验。将一定量的污水样品进行浓度梯度稀释。取适量不同稀释度的稀释液，用  法分别接种于固体平面培养基上，经培养后进行计数。该实验应注意，接种前，从盛有 的容器中将玻璃刮刀取出，放在酒精灯火焰上灼烧，冷却后待用；分组时，需用 作为对照。
（4）在上述细菌培养实验中进行计数时应计数的是接种了 　　　。
A. 各个稀释度样品的培养基上的细菌数 B. 合理稀释度样品的培养基上的细菌数
C. 各个稀释度样品的培养基上的菌落数 D. 合理稀释度样品的培养基上的菌落数
答案 (1) 未吸附的α-淀粉酶　糊精　丙　 (2)A  (3) 涂布分离　 70% 乙醇　未接种的培养基　(4)D 
6．果胶酶是催化果胶分解的一类酶，在果汁和果酒加工、造纸业中的生物制浆、医药及纺织工业等方面得到广泛应用，是世界四大酶制剂之一。目前果胶酶的需求量较大，但多为一次性使用，为了提高果胶酶的利用率，科学家进行了固定化果胶酶的相关研究。

（1）果胶酶的固定化：取磁性壳聚糖微球固体颗粒，加入果胶酶溶液，30℃条件下震荡1h，装入图所示的反应柱中，用蒸馏水洗去  ，放置在4℃冰箱中保存。上述固定化果胶酶的方法属于 。
A．包埋法 B．吸附法 C．共价偶联法 D．交联法
（2）果胶酶活力测定方法：以1g果胶酶单位时间内催化产生的主要产物 的量计算酶的活力。已知3，5-二硝基水杨酸与果胶水解的主要产物共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内，产物的量和反应液颜色深浅成正比，可用 法测定产物的量。此方法需要制作标准曲线，如图所示，其中纵坐标一般为 。
（3）下图是固定化果胶酶的部分研究结果，据图可知，用上述方法制备的固定化果胶酶与游离酶相比最适温度 （升高/降低），最适pH （升高/降低）。

（4）在果汁生产中使用固定化果胶酶具有很多优点，以下说法中不属于其优点的是 。
A． 固定化果胶酶可以重复回收，多次利用
B． 固定化果胶酶可以提高酶的稳定性和果汁的质量
C． 便于果汁加工工艺操作的连续化、自动化
D．用于处理溃碎果实，可以提高出汁率，促进澄清
分折 1、果胶物质主要存在于植物初生壁和细胞中间，果胶物质是细胞壁的基质多糖。果胶包括两种酸性多糖(聚半乳糖醛酸、聚鼠李半乳糖醛酸)和三种中性多糖(阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖)。果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶，果胶酶水解果胶主要生成β-半乳糖醛酸，可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量，从而测定果胶酶活力。2、制备固定化酶：目前，制备固定化酶的方法主要有吸附法、交联法、包埋法等。吸附法的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛；交联法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构；包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。
解答：(1)磁性壳聚糖微球表面的氨基可以与蛋白质分子的羧基反应，从而将蛋白质分子吸附固定，因此该方法固定化果胶酶利用的是吸附法。实验装置中，30℃条件下震荡1h，装入图所示的反应柱中，需要用蒸馏水洗去未固定的游离果胶酶，然后放置在4℃冰箱中保存。(2)果胶酶水解果胶主要生成β-半乳糖醛酸，以1g果胶酶单位时间内催化产生的半乳糖醛酸的量计算酶的活力。此方法需要制作标准曲线，该标准曲线的横坐标应该是半乳糖醛酸的含量，纵坐标一般为光密度值(OD值)。(3)分析曲线可知，游离酶的最适温度在40℃左右，而固定化酶的最适温度在50℃左右，即用上述方法制备的固定化果胶酶与游离酶相比最适温度升高。(4)在果汁生产中使用固定化果胶酶具有很多优点，如：固定化果胶酶可以重复回收，多次利用；固定化果胶酶可以提高酶的稳定性和果汁的质量；便于果汁加工工艺操作的连续化、自动化；用于处理溃碎果实，属于不道德行为，不是使用固定化果胶酶的优点。
答案：(1)未固定的游离果胶酶 B (2)半乳糖醛酸 光电比色法 光密度值(OD值) (3)升高 降低 (4)D














知识拓展：
1、酵母细胞的固定化
果酒和果醋的制作过程，都是利用活细胞可以产生酶，催化一些化学反应产生我们需要的产物，但对微生物的利用我们都是一次性的，这样生产成本升高，因此“酵母细胞的固定化”这节内容可以看作是传统发酵技术的延伸，主要是为了解决实际生产中的问题。
酵母细胞固定化实验
实验原理
细胞个体大，而酶分子很小；个体大的细胞难以被吸附或结合，而个体小的酶容易从包埋材料中漏出，所以酶更适合采用化学结合法和物理吸附固定化，而细胞多采用包埋法固定化。包埋法固定化酵母细胞是将酵母细胞均匀包埋在不溶于水的多孔性载体中，本实验选用的载体是海藻酸钠。
材料用具
烧杯、玻璃棒、天平、滴管、容量瓶、酒精灯、注射器；干酵母、固态CaCl2、固态海藻酸钠、蒸馏水
实验操作


结果与评价
①观察凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
②观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。
2、直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的特点比较
项目
直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
酶的种类
一种或几种
一种
一系列酶
常用载体
————
高岭土、皂土、硅胶凝胶
明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺
制作方法
————
化学结合法、物理吸附法
包埋法
是否需要营养物质
否
否
是
催化反应
单一或多种
单一
一系列
反应底物
各种物质(大分子、小分子)
各种物质(大分子、小分子)
小分子
优点
催化效率高、
低耗能、低污染等
既能与反应物接触，又能与产物分离，可以被反复利用，节约成本。
成本低，操作更容易
缺点
对环境条件非常敏感，易失活；难回收，成本高，影响产品质量。
不利于催化一系列的酶促反应
反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应效率下降

①固定化细胞使用的都是活细胞，因而为了保证其生活的需要，应该为其提供一定的营养物质。
②固定化细胞保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变小，所以对酶的活性影响小，酶的活性也就更稳定。
蒸馏水：①溶解、定容：防止离子影响，不用自来水；②冲洗：除去凝胶珠表面多余的CaCl2溶液。
CaCl2：使电荷相互吸引，形成更大的胶体颗粒，用于海藻酸钠的聚沉。
溶解海藻酸钠：①小火间断加热，防止焦糊，冷却后加入酵母菌。②浓度适中：过高，很难形成凝胶珠；过低，凝胶珠包埋酵母菌少，影响实验效果。③对照组：利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠作为对照组。
无菌操作：在制备固定化酵母细胞的过程要求严格无菌操作，防止微生物污染。










何为光电比色法？何为光密度值(OD值)？
光电比色法分为刺激值读法和分光测色法两种。首先用仪器测量然后比较测量结果。
1）刺激值直读法
刺激值直读法是使用光电色彩计（或称为色差计）进行比色、测色。用光电色彩计能直接读出样本和试样的X、Y、Z值，可简便地进行比色、测色。光电色彩计由反射用和透射用光源、试样测试台、反射镜、受光器等组成。样本或试样放置在试样测试台上就可直接读出其X、Y、Z值。
2.分光测色法
当光线遇到物体时，物体的表面吸收一些光线并反射剩余的光线。物体的颜色是由反射和吸收光的波长比例决定的，如图2-8所示。
分光测色法是用分光光度计（光谱比色计）以图形方式显示分光比及反射率曲线，然后按规定计算，得到测定值。自动记录的分光光度计测得各项数据后，可以自动进行计算得到测定结果。分光光度计如图2-9所示。
通过光谱比色计是一种可以测定每个波长光的数量，从而提供一种确定光线的工具。比如用光谱比色计测量苹果，得到图2-10所示的光谱反射比图。可以理解为：
（1）苹果的影像含有所有的波长和频率，包含的色种广泛。
（2）图形显示红色组波长光分量的反射比高（量大），而其他波长光分量的反射比低（量小）。
也就是说，苹果反射橘色和红色波长光分量，吸收紫、黄、蓝和绿波长光分量。
可见，光谱反射比图清楚地显示了不同波长光分量的量，能够确定地给出物体的颜色。分光光度计比光电色彩计精度高得多但价格贵。为了创造标准的比色条件可采用比色箱。比色箱应不受外来光线的干扰，它所用的光源照在试样上具有的光谱能量分布应与CIE标准光源D65相近似。
一般比色箱内涂以亮度系数为15%（如孟塞尔系统的N4—N）的中性灰色平光漆。对于浅色和接近白色的比色，其内部涂漆的亮度系数等于或高于30%（如孟塞尔系统的N6）。
如果主要用于暗色的比色，内部则可涂以黑色平光漆。比色箱外部的桌面应当盖一层中性灰板，其亮度系统应与被比色的试样相似。为了避免在试样上产生灯像反射，一般要求用漫反射屏，光的光谱分布性质应包括漫射屏的光谱透过率。