人教版 (2019)选择性必修3二 微生物的选择培养和计数第2课时教学设计

第2课时　微生物的选择培养和计数

一、选择培养基

1．水生栖热菌的筛选：水生栖热菌能在70～80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。

2．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

二、微生物的选择培养

1．分解尿素的细菌的分离

分解尿素的细菌能合成脲酶，该酶能催化尿素分解产生NH3，以此作为细菌生长的氮源。要将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方设计思路是培养基中除含有细菌必需的碳源、水、无机盐外，只含有尿素一种氮源。

2．稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌

土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，操作过程如下：

采集土样→将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释→取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面→将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中→将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布→用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀→涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温箱中培养1～2 d。

三、微生物的数量测定

1．稀释涂布平板法

(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。

(2)注意问题：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

2．显微镜直接计数法

(1)方法：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数。

(2)注意问题：统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。

判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)

1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 (×)

提示：选择分解尿素的细菌的培养基为固体培养基，固体培养基具有分离、鉴定作用。

2．用平板划线法培养计数，应选择菌落数在10～100的平板。  (×)

提示：微生物计数采用稀释涂布平板法，为保证结果准确，应选择菌落数在30～300的平板。

3．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 (×)

提示：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。

4．统计菌落数目的理论依据是一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。  (√)

5．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。  (×)

提示：尿素分解菌将尿素转化为氨，使培养基的pH升高。

6．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。 (×)

提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开皿盖。

　选择培养基

1．目的：从众多的微生物中分离所需要的微生物。

2．三种筛选方法的特点及举例

合作探究：(1)如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物？

提示：从大豆田土壤取土样，利用缺乏氮源的培养基可分离出固氮微生物。

(2)要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？

提示：应从富含纤维素的培养基中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。

(3)根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？

提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。

1．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是(　　)

A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用

B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基

C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上

D．在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种

C　[为了筛选、获取能利用多环芳烃为碳源的菌种，首先是取材，应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用，A项正确；其次配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基，B项正确；然后进行接种，在无菌环境下，将土壤稀释液接种到选择培养基上，在适宜的条件下进行培养，若将土壤稀释液进行灭菌，就不能筛选出能高效降解原油的菌株，C项错误；在选择培养基上形成的菌落，若该菌落周围有分解圈，即为所需菌种，D项正确。]

2．从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。请回答下列问题：

(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从________(填“高盐”或“低盐”)环境采集，培养厌氧菌的菌样应从________(填“有氧”或“无氧”)环境采集。

(2)富集培养指创设仅适应于该条件的微生物旺盛生长的特定的环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然界中分离到所需的特定微生物目的的微生物培养方法。对嗜盐菌富集培养的培养基应是________培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择________的培养基，并在________条件下培养。

(3)实验室最常用的灭菌方法是高温处理。高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生__________。________灭菌法是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌法。

(4)下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。

获得图A效果的接种方法是______________________________________；获得图B效果的接种方法是____________________________________。

[解析]　(1)在长期自然选择的作用下，生物与其生活环境相适应，培养嗜盐菌的菌样应从高盐环境中采集，培养厌氧菌的菌样应从无氧环境中采集。(2)对嗜盐菌富集培养的培养基应是加盐培养基，对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基且在高温条件下培养。(3)高温能使蛋白质和核酸发生不可逆转的变性，高压蒸汽灭菌法是应用最广、效果最好的湿热灭菌法。(4)从培养基中菌落分布看，获得图A用的是稀释涂布平板法，获得图B用的是平板划线法。

[答案]　(1)高盐　无氧　(2)加盐　以淀粉为唯一碳源　高温　(3)变性　高压蒸汽　(4)稀释涂布平板法　平板划线法

　微生物计数的方法

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：

合作探究：1.在用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计菌落数目的理论依据是什么？

提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

2．在稀释涂布平板法中，为何需要涂布3个平板？

提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。

3．为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？

提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。

4．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。

5．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。

提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。

1．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是(　　)

A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230

B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238

C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163

D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234

D　[在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。]

2．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是(　　)

A．3号试管的稀释倍数为103倍

B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍

C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个

D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多

C　[3号试管的稀释倍数为104倍，A项错误；4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数不一定恰好为5号试管的10倍，B项错误；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167) ÷3÷0.1×106＝1.7×109（个），C项正确；在固体培养基上可能存在两个或多个菌体形成一个菌落的情况，得到的结果往往会比实际活菌数目少，D项错误。]

用稀释涂布平板法计数微生物的方法

(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。

(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。

(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30～300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。

(4)每克样品中的菌株数＝某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数。

[课堂小结]

1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(　　)

①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐　⑧不加硝酸盐

A．①③⑤⑦    　　 B．②④⑥⑧

C．①③⑤⑧     D．①④⑥⑦

C　[尿素和硝酸盐都能作为氮源，而培养尿素分解菌的培养基应是以尿素为唯一氮源的固体培养基。因此培养基中应不加硝酸盐，加入尿素和琼脂。葡萄糖作为碳源，也需要加入。]

2．高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是(　　)

A．将少许干酵母加入新鲜的葡萄汁中

B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上

C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上

D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上

C　[不进行严格的灭菌对葡萄酒制作的影响不大，因为多数微生物不能在缺氧、酸性和含糖较高的环境中生存，A不符合题意；不进行严格的灭菌对腐乳制作的影响不大，因为腐乳制作时还需在其中放入酒精、盐和香辛料等，这些物质都具有杀菌作用，B不符合题意；植物组织培养要求严格的无菌环境，如果不进行严格无菌操作，会造成培养的幼苗生长缓慢甚至培育失败，C符合题意；选择培养基是根据要培养的微生物的代谢特点制备的，一般的杂菌在其上面也很难生存，D不符合题意。]

3．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题：

(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。

(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是_______________。

(3)一般依据尿素分解菌菌落的________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为________个。上述过程采用的接种方法是______________。

(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是______________。

[解析]　(1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的含培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。

[答案]　(1)脲酶　(2)无机盐　只有以尿素为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长  　(3)形状、大小　4.2×108　稀释涂布平板法  　(4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含培养基)进行培养