2021学年第1节 重组DNA技术的基本工具导学案

第1节　重组DNA技术的基本工具

一、基因工程及其诞生与发展

1．基因工程的概念

(1)操作场所：生物体外。

(2)操作技术：转基因等技术。

(3)操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

(4)操作水平：DNA分子水平。

2．基因工程的诞生和发展

(1)基因工程的诞生

①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。

②1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。

③1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。

④20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。

⑤1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。

(2)基因工程的发展

①1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。

②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。

③1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。

④1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。

⑤21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。

⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。

二、DNA重组技术的基本工具

1．限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”

(1)来源：主要来自原核生物。

(2)功能：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

(3)结果：产生黏性末端或平末端。

(4)应用：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。

EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。

2．DNA连接酶——“分子缝合针”

(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

(2)种类[填表]

3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

(1)质粒

①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。

②质粒适于作基因运载体的特点

a．质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。

b．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。

c．人工改造的质粒常带有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。

(2)噬菌体、动植物病毒等。

三、DNA的粗提取与鉴定

1．实验原理

(1)DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面有差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。

①DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，分离DNA和蛋白质。

②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。

(2)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。

2．方法步骤

(1)研磨：取30 g洋葱切碎，倒入10 mL研磨液研磨。

(2)除杂：漏斗中垫上纱布过滤后，在4 ℃冰箱中静置后取上清液，也可以1 500 r/min的转速下离心后取上清液。

(3)提取：加入体积相等、体积分数95%酒精，溶液出现白色的丝状物是DNA。

方法一：用玻璃杯按一个(填“一个”或“两个”)方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸去上面的水分。

方法二：10 000 r/min的转速下离心5 min，取沉淀物晾干。

(4)鉴定：

判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)

1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。 (√)

2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。 (×)

提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。

3．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。 (×)

提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。

4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。 (√)

5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 (×)

提示：E.coli DNA连接酶不能连接平末端。

6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。                            (√)

　基因工程的工具酶

1．限制性内切核酸酶

(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面

①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。

②能够切割特定序列中的特定位点。

(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。

(3)作用产物：黏性末端或平末端。

①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：

②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：

2．DNA连接酶

(1)作用：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。

(2)连接方式：DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来，形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间的氢键形成无关。

3．与DNA相关的五种酶的比较

1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？

提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。

2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？

提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。

1．(2020·河北沧州一中高二月考)限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是(　　)

A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键

B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸

C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端

D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA

B　[DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A项错误；限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，烟草花叶病毒的核酸为RNA，B项正确；E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C项错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D项错误。]

2．(2020·北京密云区期末改编)下列各种酶及其作用对应关系不正确的是(　　)

A.限制酶——识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开

B.RNA聚合酶——与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译

C.DNA连接酶——将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起

D.DNA聚合酶——将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上

B　[限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，A正确；RNA聚合酶与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录，B错误；DNA连接酶将两个DNA片段连接在一起，在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，C正确；DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键，D正确。]

　几种酶的作用部位图解

(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶：限制酶(断开)、DNA连接酶(形成)和DNA聚合酶(形成)。

(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶(断开)。

　基因工程中常用的载体

1．特点：质粒是一种裸露的、结构简单、具有自我复制能力的环状双链DNA分子。

2．本质：质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的小型DNA分子，不是细胞器。

3．质粒作为载体所具备的条件

4．标记基因的筛选原理

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。

将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如图所示：

细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？

提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。

(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。

1．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是(　　)

A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因

B.具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达

C.具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合

D.对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择

A　[作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。]

2．某细菌质粒如图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图示中的a、b、c是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)

A.①是c；②是b；③是a

B.①是a和b；②是a；③是b

C.①是a和b；②是b；③是a

D.①是c；②是a；③是b

A　[①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，所以插入点是c；②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏，故插入点为b；③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为a。]

某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。

本案例考查演绎与推理的科学思维。

(1)该DNA分子上有几个a酶识别和切割的位点？有几个b酶识别和切割的位点？(科学思维)

(2)a酶和b酶切出的黏性末端能相互连接吗？(科学思维)

提示：(1)该DNA分子上有3个a酶识别和切割的位点；有2个b酶识别和切割的位点。

(2)a酶和b酶切出的黏性末端相同，因此能相连。

[课堂小结]

1．(2020·黑龙江哈师大附中月考改编)下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是(　　)

A.同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性

B.限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA

C.限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同

D.限制酶只能从原核生物中提取

B　[一种限制酶能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。]

2．下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是(　　)

A.DNA连接酶连接的是两个DNA片段碱基对之间的氢键

B.DNA连接酶连接的是DNA单链上的磷酸和脱氧核糖

C.DNA连接酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端

D.E.coil DNA连接酶能将双链DNA片段互补的平末端连接起来

B　[DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键，A错误；DNA连接酶连接的是DNA双链片段两个脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖，B正确、C错误；E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，D错误。]

3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是(　　)

A.质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有

B.质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点

C.质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(区)外的细胞质基质中

D.质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制

A　[质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。]

4．(2019·江苏扬州中学高三月考改编)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　)

A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近

B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂

C.预冷的酒精溶液可用来粗提取DNA

D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热

A　[兔属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，A项错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白质后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破坏，因此沿一个方向轻柔搅拌的目的是获得较完整的DNA分子，B项正确；在预冷的体积分数为95%的酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大，C项正确；将析出的DNA溶解在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要沸水浴加热才会呈现蓝色，D项正确。]

5．如表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题：

(1)从表中4种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是________。

(2)限制酶切割的DNA片段的缝合依靠的是________酶，它的作用是形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过________连接起来。

(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶________切割。

图1

图2

(4)在相关酶的作用下，图1中的甲与图2中的乙____________(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由：____________________________________

_______________________________________________________________

_______________________________________________________________。

[解析]　(1)由表中4种限制酶的切割位点可知，Sma Ⅰ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键；两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被限制酶EcoR Ⅰ切割，切割后形成链状DNA。(4)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。

[答案]　(1)Sma Ⅰ　(2)DNA连接　氢键　(3)EcoR Ⅰ　(4)能　二者具有相同的黏性末端