高中生物解密25 生物技术在食品加工及其他方面的应用（讲义）-【高频考点解密】2021年高考生物二轮复习讲义+分层训练

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解密25 生物技术在食品加工及其他方面的应用

高考考点
考查内容
三年高考探源
考查频率
植物有效成分的提取
1．掌握植物有效成分的提取的方法；
2．DNA和蛋白质的提取技术；
3．掌握PCR技术的步骤及注意事项。
2020山东卷·24
2020江苏卷·33
2017江苏卷·33
2017新课标III·37
2015全国卷Ⅱ·39
★★★☆☆
DNA和蛋白质的提取技术
★★★☆☆
PCR技术
★★★☆☆


核心考点一 植物有效成分的提取
1．植物有效成分提取的三种方法比较
提取方法
水蒸气蒸馏法
压榨法
萃取法
实验原理
利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来
通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油
使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂后就可获得芳香油
方法步骤
（1）水蒸气蒸馏；
（2）分离油层；
（3）除水过滤
（1）石灰水浸泡、漂洗；
（2）压榨、过滤静置；
（3）再次过滤
（1）粉碎、干燥；
（2）萃取、过滤；
（3）浓缩
适用范围
适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油
适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取
适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中
优点
简单易行，便于分离
生产成本低，易保持原料原有的结构和功能
出油率高，易分离
局限性
水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题
分离较为困难，出油率相对较低
使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量
2．增加植物有效成分提取量的关键措施
（1）蒸馏法提取植物芳香油
①提取量主要取决于植物材料中芳香油的含量。
②由于植物芳香油易挥发，因此用水蒸气蒸馏法提取植物芳香油时应选择新鲜的植物材料（干燥后植物芳香油挥发）。
（2）压榨法提取植物芳香油：植物材料中的果胶、果蜡会影响压榨和出油率，压榨前通常采用石灰水浸泡的方法除去果胶、果蜡，以提高出油率。
（3）影响胡萝卜素萃取的因素及解决措施
影响因素
解决措施
萃取剂的性质
用水不溶性有机溶剂
原料的颗粒大小、紧密程度
粉碎
材料的含水量
干燥
萃取温度
探索最佳萃取温度，严格控制温度
萃取时间
适当延长萃取时间
【易混易错】
植物有效成分提取的2个易错点
（1）水蒸气蒸馏三种常用方法比较，基本原理相同，但原料位置不同。
①水中蒸馏：原料放于蒸馏容器的水中，水完全浸没原料。
②水上蒸馏：容器中水的上方有筛板，原料置于筛板上，水量以沸腾时不浸湿原料为宜。
③水气蒸馏：蒸馏容器下方有一排气孔，连接外源水蒸气，上方有筛板，上面放原料。
三种方法中，水中蒸馏设备简单，成本低，易操作，而水上蒸馏和水汽蒸馏时间短，出油率高。
（2）胡萝卜素粗品鉴定过程中的易错点
①层析时没有选择干净的滤纸，导致实验现象不明显。为了防止操作时对滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作。
②点样时点样圆点太大（直径大于2 mm），导致最终在滤纸上形成一条线，无法辨认被提取的色素。点样圆点的直径应为2 mm。
③将点好样的滤纸卷成筒状，卷纸时不能将滤纸两边相互接触，以避免由于毛细现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响结果。
④层析液没及样品原点，色素溶解于层析液中，造成实验失败。层析液不可没及样品原点，以免色素溶解于层析液中，使鉴定失败。
⑤没有设置标准样品作对照。层析液中是否提取到胡萝卜素，可通过与标准样品中的β­胡萝卜素作对比予以确认。


考法一
（2009·海南高考真题）请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题：
（1）植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、_____和_____。
（2）芳香油溶解性的特点是不溶于_____，易溶于_____，因此可用_____作为提取剂来提取芳香油。
（3）橘子果实含有芳香油，通常可用_____作为材料提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材料，理由是_____。
　　（4）对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物获得乳状液可采用的方法是_____。
　　（5）得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的_____层，原因是_____。加入氯化钠的作用是_____。
　　（6）从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，此剂的作用是_____。
【答案】（1）蒸馏法 萃取法 （2）水 有机溶剂 有机溶剂 橘（3）子皮 芳香油含量较高 （4）过滤 （5）上 油层的密度比水层小 增加水层密度，使油和水分层 （6）吸收芳香油中残留的水分
【分析】

本题解题的关键是理解和掌握提取植物芳香油的原理及方法。植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法，蒸馏法，萃取法；芳香油溶解性的特点是不溶于水，易溶于有机溶剂，芳香油乳浊液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的上层，因为其密度比水小，乳浊液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠作用吸水。
【详解】

（1）根据植物原料的特点，植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等。
（2）植物芳香油不溶于水，但是极易溶于有机溶剂，如石油醚、酒精、乙醚和戊烷等。芳香油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂，就可以获得较纯净的植物芳香油了。因此可以用有机溶剂作为提取剂来提取芳香油。
（3）橘皮精油主要储藏在橘皮部分，所以可从橘子皮中提取到芳香油．所用的橘子皮越新鲜，芳香油的含量也越高，所以提取橘皮精油时要选用新鲜的橘子皮。
（4）压榨材料后可得到糊状液体，此时需过滤除去其中的固体物，进而获得乳状液。
（5）乳状液是水和芳香油的混合物，要将水和芳香油分开，需加入氯化钠，这样可以增加水层的密度，使水和芳香油分开。由于芳香油的密度比水层小，所以芳香油分布于液体的上层，最后用分液漏斗将两层分开即可获得我们所需要的芳香油。
（6）分离的油层还会含有一定的水分，一般可以加入一些无水硫酸钠吸水，放置过夜，再过滤除去固体硫酸钠就即可得到芳香油。
考法二
（2019·海南高考真题）回答下列问题。
（1）玫瑰精油可用玫瑰花瓣为原料，采用水蒸气蒸馏法提取。水蒸气蒸馏法的原理是________________________。在进行蒸馏时，冷凝管的进水口比出水口___________（填“高”或“低”）。蒸馏收集到的乳浊液是玫瑰精油和水的混合物，要得到玫瑰精油，需要向乳浊液中加入NaCl，其目的是________________；得到的油层还需要加入无水Na2SO4，其目的是_______________。
（2）某同学在通过发酵制作果酒时，发现在制作原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度，原因是________________________。在家庭以葡萄为原料制作葡萄酒时，可以不添加酵母菌，原因是________________________；在制作葡萄酒的过程中，如果密封不严混入空气，发酵液会变酸，可能的原因是__________________。
【答案】（1）利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分离出油层和水层 低 促进油和水的分离 吸去芳香油中残留的水分 （2）糖类是主要的能源物质，可以为酵母菌的生长、繁殖提供能源物质，还可以作为酒精发酵的原料 葡萄皮上附着有野生的酵母菌 醋酸菌大量增殖，进行醋酸发酵
【解析】
【分析】
植物芳香油主要是萜类化合物及其衍生物，提取方法有蒸馏、压榨和萃取等。具体采用哪种方法要根据植物原料的特点来决定。
玫瑰精油的提取流程：鲜玫瑰红+清水→水蒸气蒸馏→油水混合物→分离油层→除水→玫瑰油。
果酒发酵的常用菌种是酵母菌，兼性厌氧型微生物，有氧条件下进行有氧呼吸增加数量，无氧条件下进行酒精发酵。
【详解】
（1）水蒸气蒸馏法是利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分离出油层和水层。在进行蒸馏时，为了避免防止冷凝管炸裂，进水口比出水口低。蒸馏收集到的乳浊液是玫瑰精油和水的混合物，要得到玫瑰精油，需要向乳浊液中加入NaCl可以促进油和水的分离；得到的油层还需要加入无水Na2SO4，可以吸去芳香油中残留的水分。
（2）糖类是主要的能源物质，可以为酵母菌的生长、繁殖提供能源物质，还可以作为酒精发酵的原料。故在通过发酵制作果酒时，在制作原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度。在家庭以葡萄为原料制作葡萄酒时，由于葡萄皮上附着有野生的酵母菌，故可以不添加酵母菌；在制作葡萄酒的过程中，如果密封不严混入空气，会造成醋酸菌大量增殖，进行醋酸发酵，发酵液会变酸。



1．图1是在发酵罐内利用三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素过程中，菌体生物量及β-胡萝卜素产量随时间变化的曲线图；图2是样品层析结果及与β-胡萝卜素标准样品的比对。回答下列问题：


（1）β-胡萝卜素常用的提取方法为_____________法，实验表明，石油醚的提取效果远好于丙酮和酒精，原因是____________。
（2）图1中，菌体的最快增长出现在第______________h左右，菌体的生物量到达最大值后下降，为保证连续的生产，应采取的措施是____________。
（3）纸层析法分离样品中色素的原理是_____________。将萃取的胡萝卜素样品与β-胡萝卜素标准样品进行比对，结果如图2。据图2分析可知，色带_____________为β-胡萝卜素。
【答案】（1）萃取 石油醚为水不溶性有机溶剂，沸点高，萃取效果好 （2）100 连续加入新的培养液，同时排出代谢产物 （3）不同色素在层析液中溶解度不同 I
【分析】
据图分析：图1中，在发酵罐内利用三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素过程中，β-胡萝卜素产量应该是三孢布拉氏霉处于稳定期时进行连续培养时获得的产量最高。图2表示用纸层析法鉴定胡萝卜素的实验过程。
【详解】
（1）β-胡萝卜素常用提取方法为萃取法溶解；实验表明，石油醚的提取效果远好于丙酮和酒精，原因是石油醚为水不溶性有机溶剂，萃取效果好。
（2）据图分析可知：图1中，菌体的最快增长出现在第100h左右；菌体的生物量到达最大值后下降，其原因是营养物质缺乏，有害代谢产物积累，故为保证连续的生产，应采取的措施是连续加入新的培养液，同时排出代谢产物。
（3）纸层析法分离色素的原理是不同色素在层析液中溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上的扩散速度快；从图中分析可知，色带Ⅰ为β一胡萝卜素。
2．藿香正气丸、藿香正气水的主要药用成分都是广藿香油，其中藿香正气水是深棕色的澄清液体。某研究者将成熟的广藿香草茎叶进行干燥、堆放处理后，粉碎过60目筛，以此为原料进行提取广藿香油的相关研究（如下图）。请回答下列问题：

（1）上述提取广藿香油的方法为_____。步骤①②中加入的物质分别是_____、_____。
（2）下表是实验结果记录表，据表可知最佳的提取条件为_____。
实验号
乙醇浓度（%vol）
浸泡温度（℃）
提取时间（h）
出油量[mg·（100g）]-1
1
60
40
8
1．38
2
60
50
9
1．75
3
60
60
10
1．50
4
70
40
8
1．47
5
70
50
9
1．95
6
70
60
10
1．35
7
80
40
8
1．37
8
80
50
9
1．30
9
80
60
10
1．86
（3）与藿香正气丸不同的是，藿香正气水中含40%～50%的醇，_____（填“能”或“不能”）用酸性重铬酸钾溶液鉴定其中的乙醇，原因是_____。
（4）用于研究广藿香油的抑菌活性的活菌可以用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行培养和分离，牛肉膏蛋白胨培养基中的蛋白胨提供的主要营养有_____（答三种）。
【答案】（1）水蒸气蒸馏法 NaCl 无水Na2SO4 （2）70%乙醇、50℃浸泡、提取9h （3）不能 藿香正气水自身的颜色会影响鉴定实验颜色的呈现 （4）碳源、氮源和维生素
【分析】
水蒸气蒸馏法是植物芳香油提取的常用方法，它的原理是将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分离出油层和水层。在油水混合物中加入NaCl可以使油水混合物分层明显，促进油水分离，然后用分液漏斗把油水分离。分离出来的精油中可以加无水硫酸钠吸收水分。粗分离后，可以采用其他方法继续纯化。
【详解】
（1）从题中可以看出，提取过程中首要是利用水蒸气将挥发性较强的广藿香油携带出来，形成油水混合物，冷却后又重新分离出油层，所以提取广藿香油的方法为水蒸气蒸馏法。步骤①为加入氯化钠，目的是让氯化钠溶于水，增加水的密度，使油水混合物分层明显。步骤②为加入无水硫酸钠，目的是出去精油中的水分。
（2）最大出油量时的提取条件为最佳条件，根据表中的实验结果可知，最大出油量时对应的提取条件为70%乙醇、50℃浸泡、提取9h。
（3）藿香正气水中含40%~50%的乙醇，理论上乙醇可以用酸性的重铬酸钾来鉴定，但是鉴定过程中要观察颜色的变化，而霍香正气水是深棕色的澄清液体，其自身的颜色会影响鉴定实验结果的观察。所以不能用酸性重铬酸钾溶液鉴定其中的乙醇。
（4）牛肉膏蛋白胨培养基中的蛋白胨内含多种有机物，可以提供的主要营养有碳源、氮源和维生素。
3．薰衣草为唇形科薰衣草属植物。熏衣草精油取自熏衣草茎、叶，化学性质稳定，挥发性较强，具有怡神、助睡眠、舒缓压力的作用，此外它还具有降压、止痛、促进细胞再生的功能，可以用于治疗烫伤和蚊虫叮咬、预防和改善脱发。
（1）从熏衣草茎、叶中提取熏衣草精油，宜采用____________法，该方法也是提取植物芳香油的常用方法，它的原理是 ____。
（2）与提取熏衣草精油不同，实验室中胡萝卜素的提取常采用 __________法，该过程要特别注意控制________________，以防止胡萝卜素分解，其提取效率主要取决于___，同时还受原料颗粒的大小、含水量等条件的影响。
（3）熏衣草精油中大肠杆菌的含量超标会严重影响精油的品质，可采用__________（填接种方法）检测熏衣草精油中大肠杆菌的活菌数量。将样品接种到含_______ 的固体培养基上，可以根据最终培养基上________的数目，计算出熏衣草精油中大肠杆菌的数量。
【答案】（1）水蒸气蒸馏 利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分出油层和水层 （2）萃取 温度和时间 萃取剂的性质和使用量 （3）稀释涂布平板法 伊红美蓝 黑色菌落
【分析】
1、植物有效成分的提取的主要方法有：蒸馏法、压榨法和萃取法。
2、玫瑰精油具有较强的挥发性，适用于蒸馏法提取；橘皮精油如果使用蒸馏法会导致原料焦糊和有效成分的部分水解，通常采用压榨法提取；胡萝卜素不溶于水，易溶于石油醚等有机溶剂，适用于萃取法提取。
【详解】
（1）熏衣草精油具有较强的挥发性，适用于水蒸气蒸馏法提取，它的原理是利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分出油层和水层。
（2）胡萝卜素不溶于水，易溶于石油醚等有机溶剂，适用于萃取法提取。该过程要特别注意控制温度和时间。萃取的温度高、时间长，需要提取的物质就能充分溶解，但温度过高，时间过长，胡萝卜素易分解。提取效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量等条件的影响。
（3）微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，检测熏衣草精油中大肠杆菌的活菌数量，应采用稀释涂布平板法接种。在含伊红美蓝的固体培养基上，大肠杆菌菌落呈现黑色，可以根据最终培养基上黑色菌落的数目，计算出熏衣草精油中大肠杆菌的数量。

核心考点二 DNA和蛋白质的提取技术
一、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
（1）DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，其在物质的量浓度为0.14 mo/L的NaCl溶液中的溶解度最低。
（2）DNA不溶于酒精，但是在细胞中的某些蛋白质可溶于酒精，因此可以用酒精提纯。
（3）DNA遇二苯胺（沸水浴）会被染成蓝色，因此，三苯胺试剂可用来鉴定DNA分子。
2．选取材料→破碎细胞，获取含DNA的滤液→去除滤液中的杂质→DNA的析出与鉴定。
【说明】①本实验用鸡血细胞作实验材料的原因：鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；鸡血细胞极易吸水涨破。②二苯胺试剂要现配现用。③获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液中加入足量的蒸馏水，以便使鸡血细胞膜和核膜破裂。
【通关秘籍】DNA的粗提取与鉴定中的“234”
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸收水破裂；
②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14mol/L，使DNA析出。
用纱布过滤3次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；
②滤取0.14mol/L的NaC1溶液中析出的DNA（黏稠物）；
③过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次
①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；
②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；
③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；
④用2mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
二、蛋白质的提取和分离
1．蛋白质分离的依据
蛋白质的理化性质（如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等）千差万别，可以用来分离不同种类的蛋白质。
2．蛋白质分离的方法
（1）凝胶色谱法：原理是当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢，后从层析柱中洗脱下来；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在外部移动，路程较短，移动速度较快，在层析柱中先洗脱下来。
（2）电泳法：原理是许多生物大分子具有可解离的基团，在一定pH下，这些基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使分子迁移速度不同，从而实现各种分子的分离。
3．血红蛋白的提取和分离过程
步骤
操作
样品处理
通过红细胞的洗涤（除去杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化）、血红蛋白的释放（在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，细胞膜被溶解，释放出血红蛋白）、分离血红蛋白溶液（经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来）等操作收集到血红蛋白溶液
粗分离
利用透析法去除血红蛋白溶液中相对分子质量较小的杂质
纯化
利用凝胶色谱法分离相对分子质量不同的蛋白质
纯度鉴定
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求
4．实验操作程序及注意事项
（1）样品处理
①红细胞的洗涤
a．离心时转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离效果；
b．洗涤三次，三次后如果上清液仍呈黄色，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白。
②血红蛋白的释放
红细胞中依次加入蒸馏水和甲苯的作用：加入蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破；甲苯溶解细胞膜，从而使血红蛋白释放出来。
③分离血红蛋白溶液
离心→分层→滤纸过滤→分液→红色透明液体。
（2）粗分离——透析
①透析时间是12小时；
②透析袋用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。

（3）纯化——凝胶色谱法
凝胶色谱操作包括凝胶色谱柱的制作、凝胶色谱柱的装填、样品的加入和洗脱。
①为了加快干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1~2h，这样还可除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。
②在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是在凝胶色谱柱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
③滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。
④根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。


考法一
（2020·海南高考真题）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
【答案】A
【分析】
1.DNA粗提取与鉴定的原理1.DNA的溶解性：
（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的；
（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离；
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响；
3.DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】
A、羊的成熟红细胞没有细胞核，因此不可作为提取DNA的材料，A错误；
B、提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，而食盐的作用是提高DNA的溶解度，B正确；
C、预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同时根据DNA蛋白质溶于酒精，而DNA不溶于酒精的特性将其析出，C正确；
D、由分析可知，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，据此鉴定DNA的存在，D正确。
故选A。
考法二
（2011·广东高考真题）以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
【答案】D
【分析】
血红蛋白的分离过程：
1、样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液；
2、样品的粗分离：利用透析法去除分子量较小的杂质蛋白；
3、样品的纯化：利用凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去；
4、纯度鉴定：利用聚丙烯凝胶电泳完成。
【详解】
A、洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白以利于后续步骤的分离纯化，加入的生理盐水能维持细胞稳定形态，防止红细胞破裂，A项正确；
B、猪的成熟红细胞中无细胞核，缺少细胞器，提纯时杂蛋白质较少，B项正确；
C、血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液（如果操作都正确），C 项正确；
D、在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白的分子量比杂蛋白大，质量越大的蛋白质，通过凝胶色谱柱的速度越快，D项错误。
故选D。


4．下图所示为“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作过程，有关分析不正确的是（ ）

A．图①④中加入蒸馏水的目的相同
B．图①中向鸡血细胞液内加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
C．图②操作的目的是纯化DNA，去除溶于体积分数为95%酒精中的杂质
D．图③中物质的量浓度为2 mol·L-1的NaCl溶液能溶解黏稠物中的DNA
【答案】A
【分析】
1、DNA的溶解性：
（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60−80∘C的高温，而DNA在80∘C以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3、DNA的鉴定在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】
A、①中加蒸馏水是为了使血细胞吸水涨破，④中加入蒸馏水是为了降低氯化钠溶液的浓度，使DNA析出，A错误；
B、嫩肉粉中含有蛋白酶，能够水解蛋白质，因此图①中向鸡血细胞液内加入少许嫩肉粉有助于去除杂质，B正确；
C、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，因此②操作的目的是纯化DNA，去除溶于95%酒精中的杂质，C正确；
D、图③中2 mol·L-1 NaCl溶液能溶解黏稠物中的DNA，D正确。
故选A。
5．纤维素是地球上最丰富的可再生碳源物质之一，科学合理地利用纤维素有助于解决能源危机和环境污染等重大问题。请回答下列问题：
（l）分离纤维素分解菌时，从富含有机质的土壤中取样，将土壤滤液加入以纤维素为唯一碳源的液体培养基中进行选择培养，选择培养的目的是____。如果将选择培养后的液体培养基离心，人们____（填“能”或“不能”）从上清液中获得纤维素酶。
（2）将纤维素酶粗提取液装入透析袋中，置于pH适宜的磷酸缓冲液中进行透析处理，可除去其中____的杂质。然后可采用________法进一步纯化纤维素酶。
（3）为使纤维素酶能够重复使用，可将冷却后的海藻酸钠溶液与纤维素酶液进行混合，通过注射器滴入CaCl2溶液中。这种固定酶的方法称为____。
（4）研究人员测定了不同温度对固定化酶酶活力的影响，结果如图所示。

根据以上数据可以看出，在温度为30℃- 80℃的变化范围内，随着温度的升高固定化酶和游离酶的酶活力均呈现出_______的变化趋势。该趋势是由以下两个方面共同作用的结果：反应体系温度升高时，底物和酶分子动能增大，使反应速率___；温度可改变酶的____，导致活性随着温度的升高而降低甚至失活。
【答案】（1）增加纤维素分解菌的浓度 能 （2）分子量较小 凝胶色谱法（或电泳） （3） 包埋法 （4）先增加后降低 加快 空间结构
【分析】
在分离纤维素分解菌时，常做选择培养，目的为增加纤维素分解菌的浓度，旨在从中可确保获得纤维素分解菌。固定化酶和细胞的方法主要有三种，包括化学结合法、物理吸附法和包埋法。包埋法常使用海藻酸钠这种不溶于水的多孔性载体中。
【详解】
（1）本实验中选择培养也可称为富集培养，目的是增加纤维素分解菌的浓度。纤维素分解菌能够分解周围环境中的纤维素，说明该酶合成后能够释放到周围环境中，因此，将液体培养的目标菌离心，人们可以从上清液中获得纤维素酶。
（2）对蛋白质进行粗分离时常使用透析，目的是除去样品中分子质量较小的杂质，为进一步纯化分离纤维素酶，会将样品放在凝胶色谱柱中进行洗脱、收集。
（3）海藻酸钠常做包埋的载体，将冷却后的海藻酸钠溶液与纤维素酶液进行混合，通过注射器滴入CaCl2溶液中，形成凝胶珠，这种酶固定化的方法是包埋法。
（4）分析实验数据可知，在温度为30℃~80℃的变化范围内，随着温度的升高，固定化酶和游离酶的酶活力均呈现出先增加后降低的变化趋势。该趋势是由以下两个方面共同作用的结果：反应体系温度升高时，底物和酶分子动能增大，使反应速率加快；温度可改变酶的空间结构，导致活性随着温度的升高而降低甚至失活。


核心考点三 PCR技术
一、PCR技术的原理
DNA复制原理，即
双链DNA单链DNA
二、PCR的反应过程
1．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，如图所示。

2．复性：温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如图所示。

3．延伸：当温度上升至72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图所示。

三、PCR的结果
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了2个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

考法一
（2020·北京高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。

为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④
【答案】B
【分析】
根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。
【详解】
图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。
故选B。
考法二
（2020·江苏高考真题）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）：

请据图回答问题：
（1）步骤I用的EcoR I是一种__________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。
（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。
（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（从引物①②③④中选择，填编号）。

DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列

PCR引物
①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′
②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′
④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′

（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。
A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′
B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′
C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′
D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′
【答案】（1）限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 （2）磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 （3）②④ （4）B
【分析】
采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸、终止，PCR技术扩增目的基因的原理：DNA双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。
【详解】
（1）EcoR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。
（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。
（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。


6．小麦是我国重要的粮食作物，但蚜虫经常给小麦生产带来严重威胁，研究人员将掌叶半夏中含有的凝集素基因PPA转入到普通小麦品种中，获得抗蚜效果较好的转基因小麦。
（1）为探究外源PPA基因在转基因小麦细胞中的存在位置和遗传方式，以纯合的转PPA基因小麦和野生型小麦进行正反交，根据_______序列设计引物，通过PCR鉴定得到的F1代。若正交和反交后代均能扩增出目的基因条带，则证明PPA基因在转基因小麦中存在细胞核遗传。继续对F2代进行PCR鉴定，若亲代中母本为转基因植株时，F2代扩增结果为_______；而亲代中父本为转基因植株时，F2代扩增结果为_______，则证明该基因同时存在细胞质遗传。
（2）实验结果表明，细胞核和细胞质中都含有PPA基因。细胞核中的PPA基因用R表示，未导入PPA基因用r表示；细胞质中含PPA基因用S表示，未导入PPA基因用N表示（见下图）。


以纯合的转基因植株做父本（基因型用S(RR)表示），野生型植株做母本进行杂交实验，请写出F1、F2的基因型_______。
（3）回交是指子代与亲本之一进行杂交的过程。通过多代的连续回交，可以逐步将转基因小麦的细胞核，置换成野生型小麦不携带PPA基因的细胞核，从而仅保持细胞质中的PPA基因，以防止该基因通过花粉扩散到其他近亲作物中。
请写出利用纯合转基因植株和野生型植株为亲本，培育仅含细胞质遗传的转基因抗虫小麦的流程_______。（用文字或者图示作答均可）
【答案】（1）PPA基因 所有个体均能扩增出条带 能扩增和不能扩增的个体比例为3∶1 （2）F1： N(Rr) F2： N(RR)、 N(Rr)、 N(rr) （3）用纯合转基因植株做母本、野生型植株做父本，杂交获得F1，F1作母本与野生型植株回交，筛选基因型为S(rr)的植株作母本，再与野生型植株连续多代回交，最终获得仅含细胞质遗传的转基因抗虫小麦S(rr) ；


【分析】
基因是具有遗传效应的DNA片段，是决定生物性状的基本单位。体细胞的细胞核中的基因通常是成对存在的，而细胞质中的基因通常不是成对存在的。细胞核和细胞质中的基因都能进行复制、转录和翻译，细胞质基因由母本传给子代。
【详解】
（1）PCR扩增基因，需要根据待测定的基因序列设计引物，本实验目的是探究外源PPA基因在转基因小麦细胞中的存在位置和遗传方式，所以以PPA基因序列设计引物；正反交结果相同，则说明存在细胞核遗传，若用Aa这对基因表示，F1基因型是Aa；对F2进行扩增，由于细胞质基因只能由母本传递给子代，所以如果母本为转基因植株时，F2中所有个体均能扩增出条带，而如果父本父本为转基因植株时，只存在细胞核遗传，所以扩增结果是能扩增和不能扩增的个体比例为3∶1。
（2）野生型为未导入基因，所以母本基因型是N（rr），父本是S(RR)，由于细胞质基因随着母本传递，所以F1基因型是N（Rr），自交出现性状分离，F2基因型是N（RR）,N（Rr），N（rr）。
（3）需要培养仅含细胞质遗传的转基因抗虫小麦S（rr），结合题干回交过程，不断进行选择，所以具体过程：用纯合转基因植株做母本、野生型植株做父本，杂交获得F1，F1作母本与野生型植株回交，筛选基因型为S(rr)的植株作母本，再与野生型植株连续多代回交，最终获得仅含细胞质遗传的转基因抗虫小麦S(rr)；遗传图解如下：


7．注意缺陷多动障碍（ADHD）是临床上常见的一种神经发育障碍性疾病，主要表现为与年龄不相符的注意力不集中、多动、冲动。推测cntnap2基因与ADHD相关，研究人员尝试通过降低斑马鱼中该基因的表达建立ADHD动物模型。
（1）cntnap2基因主要在_________中进行转录时，_________酶与基因中的启动子结合催化形成RNA前体。随后RNA前体中内含子对应部分被切掉，外显子对应部分拼接起来，形成成熟mRNA。
（2）为降低cntnap2基因的表达，研究人员将吗啉反义寡核苷酸导入斑马鱼的受精卵中，吗啉反义寡核苷酸是一种RNA剪接抑制剂，针对它的具体作用，科研人员提出以下假说：
假说1：导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去
假说2：导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切下去

为了验证上述假说，分别从受精后3天的实验组和对照组斑马鱼的脑中提取________，逆转录形成cDNA。若假说1成立，使用上图所示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为________（从下列选项中选择）。
A．实验组有目的条带 B．实验组无目的条带
C．对照组有目的条带 D．对照组无目的条带
若要证明假说2成立，还需要选择上图所示引物_________进行PCR。
（3）用上述方法获得的实验组斑马鱼的运动距离和速度都大于对照组。科研人员向实验组斑马鱼的培养液中加入托莫西汀（一种常用于治疗ADHD的临床药物），若_________则证明利用吗啉反义寡核苷酸获得了ADHD斑马鱼模型。
【答案】（1）细胞核 RNA聚合 （2）RNA A D 3和4 （3）斑马鱼的运动距离和速度降低
【分析】
1、中心法则：遗传信息可以从DNA流向DNA，即DNA的复制；遗传信息可以从DNA流向RNA，进而流向蛋白质，即遗传信息的转录和翻译；后来中心法则又补充了遗传信息从RNA流向RNA以及从RNA流向DNA两条途径。
2、PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；（2）原理：DNA复制；（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物；（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】
（1）转录过程以四种核糖核苷酸为原料，以DNA分子的一条链为模板，在RNA聚合酶的作用下消耗能量，合成RNA，斑马鱼属于真核生物，即cntnap2基因在细胞核中进行转录时，在RNA聚合酶与基因中的启动子结合催化形成RNA前体。随后RNA前体中内含子对应部分被切掉，外显子对应部分拼接起来，形成成熟mRNA。
（2）针对吗啉反义寡核苷酸是一种RNA剪接抑制剂，提出假说1和假说2，为验证上述假说，可分别从受精后3天的实验组和对照组斑马鱼的脑中提取RNA，逆转录形成cDNA。若假说1成立，即实验组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去，对照组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去，使用上图所示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为实验组有目的条带，对照组无目的条带，即AD正确。若要证明假说2成立，即RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切下去，即选择图示引物3和4进行PCR可得到电泳条带。
（3）用上述方法获得的实验组斑马鱼的运动距离和速度都大于对照组，科研人员向实验组斑马鱼的培养液中加入托莫西汀（一种常用于治疗ADHD的临床药物），若斑马鱼的运动距离和速度降低则证明利用吗啉反义寡核苷酸获得了ADHD斑马鱼模型。
8．PCR 技术应用非常广泛，可用于扩增目的基因，制作探针，引入定点突变，定量检测 DNA 等。完成下列有关 PCR 技术和相关应用的问题：
（1）PCR 技术可用于基因工程四个基本步骤中的__________步骤，
（2）在影响扩增反应的各种因素中，引物的设计最为重要，引物的3'端应采用简并密码较少的氨基酸的对应核苷酸序列，否则会导致扩增的非特异性序列数量__________。
（3）在正常变性和退火之后研究某 Taq DNA 聚合酶的催化效率，得到了下列表格

22℃
37℃
S5℃
70℃
78℃
83℃
子链延伸速率(个核苷酸．秒-1．酶分子-1)
0．25
1．5
22
60
250
0
83℃下没有产物的原因是_________。
（4）PCR 反应后期，由于_________等原因，反应速率会降低。
（5）PCR 过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会因为_________，最终都会导致反应效率降低。退火温度过高则会因_________导致目标产物的量_______。
（6）不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单链 DNA 的方法。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50～1： 100，在 PCR 反应的最初 10-15 个循环中，其扩增产物最初主要是双链 DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的 PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板 DNA，最初 10 个循环扩增产生双链DNA，后 20 个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物_________个，需要非限制性引物__________个。因为双链DNA 和单链DNA的__________不同，可通过电泳方法将其分离。
【答案】（1）获取目的基因和目的基因的检测与鉴定 （2）增多 （3）引物与模板结合的稳定性遭到破坏(引物不能稳定的与模板结合) （4）酶活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多 （5）双链不能充分解开 引物不能与模板充分配对 减少 （6）（211－2）a
(211-2) ×21a
相对分子质量(碱基数量)
【分析】
多聚酶链式反应扩增DNA片段：
1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
【详解】
（1）基因工程的四个基本操作步骤是目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。结合PCR技术的原理可知：该技术可用于基因工程中目的基因的获取（扩增）和目的基因的检测与鉴定两个步骤。
（2）用简并密码较少的氨基酸的对应核苷酸序列，则氨基酸的种类会增多，非特异性减少，反之由于密码子的简并性，会导致特异性序列增多。
（3）据表格信息可知：在22-78℃之间，随着温度升高，子链延伸速率增大，但当温度达到83℃时没有产物，原因可能是因为温度过高，引物与模板结合的稳定性遭到破坏(引物不能稳定的与模板结合)所致。
（4）PCR扩增需要dNTP等物质，但在反应后期，随着反应进行，由于反应物的物质浓度降低（酶活性降低、反应物增多等），故反应变慢。
（5）若变性温度过低，则DNA双链不能充分解开，导致模板减少；若变性温度过高，则会导致引物不能与模板充分配对（模板与引物结合效率低），导致目标产物的量减少。
（6）若只有一条模板链，则10次循环后，产生DNA数量为210，每条DNA为两条链，故10次循环后的数量为210＋1，所用引物需减去模板链的数量，则a个模板DNA扩增个循环后引物数量=（211－2）a个；非限制性引物从n=11开始计算，需要非限制性引物数量为(211-2) ×21a个；由于双链DNA和单链DNA的相对分子质量(碱基数量)，故可用电泳法将其分离。