五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编91-生物技术与工程-基因工程-目的基因的检测与鉴定（含解析）

这是一份五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编91-生物技术与工程-基因工程-目的基因的检测与鉴定（含解析），共21页。试卷主要包含了综合题，非选择题组等内容，欢迎下载使用。

五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编91-生物技术与工程-基因工程-目的基因的检测与鉴定（含解析）

一、综合题
1．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。

(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。

(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。
2．（2022·河北·统考高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是________。
(2)________是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的________上，此方法的不足之处是________。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有________（写出两点即可）。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的________以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析________（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是________。

(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生________。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是________（写出两点即可）。
3．（2021·全国·高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
4．（2021·全国·统考高考真题）用一段由放射性同位素标记的DNA片段可以确定基因在染色体上的位置。某研究人员使用放射性同位素32P标记的脱氧腺苷三磷酸(dATP，dA-Pα~Pβ~Pγ)等材料制备了DNA片段甲（单链），对W基因在染色体上的位置进行了研究，实验流程的示意图如下。

回答下列问题：
（1）该研究人员在制备32p标记的DNA片段甲时，所用dATP的α位磷酸基团中的磷必须是32P，原因是_______。
（2）该研究人员以细胞为材料制备了染色体样品，在混合操作之前去除了样品中的RNA分子，去除RNA分子的目的是_______。
（3）为了使片段甲能够通过碱基互补配对与染色体样品中的W基因结合，需要通过某种处理使样品中的染色体DNA_______。
（4）该研究人员在完成上述实验的基础上，又对动物细胞内某基因的mRNA进行了检测，在实验过程中用某种酶去除了样品中的DNA，这种酶是_______。
5．（2021·辽宁·统考高考真题）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。

相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTTTTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTGGTC↑GAC
PstI
CTGC↓AGGA↑CGTC
KpnI
G↓GTACCCCATG↑G
BamHI
G↓GATCCCCTAG↑G

注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。

6．（2020·海南·统考高考真题）某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。

回答下列问题。
（1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是_______________。
（2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计__________，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为_________；出现阴性反应者，胚胎为_________。
（3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是______________，检测的基本思路是_________________。
7．（2019·江苏·统考高考真题）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。
（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。
8．（2019·海南·统考高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。
（3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。
9．（2018·天津·统考高考真题）甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
（1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用___________技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的___________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
（2）构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa）。将该基因与___________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的__________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
（3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。将（1）中的重组质粒导入（2）中的转基因宿主细胞，并在补加__________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是_________。
A．病毒的DNA聚合酶
B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶
D．宿主的RNA聚合酶
（4）上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起_________免疫，增强免疫保护效果。
10．（2018·上海·高考真题）以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题。
(1)获得目的基因的方法通常包括____和___。
(2)切割和连接DNA分子所使用的酶分别是_________。
(3)运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或_____，后者的形状呈_____。
(4)由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率________，所以在转化后通常需要进行___操作。
(5)将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和__序列上是相同的。

二、非选择题组
11．（2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。
(2)为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。
（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
(4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。
(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。
(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。
12．（2022·辽宁·统考高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1

(1)构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是___________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体___________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
(2)质粒在包装细胞内组装出由___________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。
Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2

(3)用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用___________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的___________中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
(4)用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行___________培养。用___________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集___________，提取单克隆抗体。
(5)利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成___________，实现特异性治疗。

参考答案：
1．(1)     能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸
     5'端
(2)     P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。
     在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基
(3)     增强FLAG-P与UBC的结合     参与P与UBC的结合
(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。

【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
（1）
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。
（2）
融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
（3）
①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
（4）
根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。
2．(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的
(2)#基因表达载体的构建##表达载体的构建#
(3)     T-DNA     该方法不适用与单子叶植物
(4)基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术
(5)     效果     NaPI
     饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃数较对照组少
(6)     定向改变     由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂

【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的。
（2）基因工程的核心是基因表达载体的构建。
（3）农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。其不足之处是该方法不适用与单子叶植物。
（4）目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因、是否能转录处目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗虫性、抗病性、活性等。即可利用基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术等。
（5）抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的效果以鉴定其抗性程度。由图可知，NaPI转基因棉花的抗虫效果最佳，因为饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃数较对照组少。
（6）在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂。
3．     EcoRI、PstI      EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV     磷酸二酯键     自我复制     一至多个限制酶切位点     用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞     位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【分析】基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
【详解】（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
4．     dATP脱去β、γ位上的两个磷酸基团后，则为腺嘌呤脱氧核苷酸，是合成DNA的原料之一     防止RNA分子与染色体DNA的W基因片段发生杂交     解旋     DNA酶
【分析】根据题意，通过带32p标记的DNA分子与被测样本中的W基因进行碱基互补配对，形成杂交带，可以推测出W基因在染色体上的位置。
【详解】（1）dA-Pα~Pβ~Pγ脱去β、γ位上的两个磷酸基团后，则为腺嘌呤脱氧核苷酸，是合成DNA的原料之一。因此研究人员在制备32p标记的DNA片段甲时，所用dATP的α位磷酸基团中的磷必须是32p。
（2）RNA分子也可以与染色体DNA进行碱基互补配对，产生杂交带，从而干扰32p标记的DNA片段甲与染色体DNA的杂交，故去除RNA分子，可以防止RNA分子与染色体DNA的W基因片段发生杂交。
（3）DNA分子解旋后的单链片段才能与32p标记的DNA片段甲进行碱基互补配对，故需要使样品中的染色体DNA解旋。
（4）DNA酶可以水解DNA分子从而去除了样品中的DNA。
【点睛】本题考查知识点中对DNA探针法的应用，考生需要掌握DNA探针的原理，操作的基本过程才能解题。
5．(1)逆转录
(2)     EcoRI     PvitⅡ     T4DNA连接酶
(3)感受态
(4)3
(5)G2/M

【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI在质粒上有两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。
图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。
（1）
利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。
（2）
根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。
（3）
转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
（4）
由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。
（5）
比较图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。
【点睛】本题考察基因工程的知识，需要考生分析质粒的酶切位点，结合目的基因转入的位置进行分析，结合题干中目的基因的大小分析电泳图。
6．     雄性原核较大，更容易容纳外源DNA     引物     雄性小鼠     雌性小鼠     抗原-抗体杂交技术     从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功
【分析】根据题意和图示分析可知：图示首先通过转基因技术将目的基因导入到成熟精子的染色体中，再通过体外受精作用将目的基因移入到受精卵中，再通过早期胚胎培养和胚胎移植，最终获得转基因鼠。
【详解】（1）通常来自精子的雄性原核较大，更容易容纳外源DNA，，因此外源基因能够容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。
（2）目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY -PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。
（3）检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是利用抗原抗体杂交技术，基本步骤：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
【点睛】本题结合胚胎工程考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节；识记体外受精技术的过程，掌握早期胚胎培养的条件及胚胎移植的生理学基础，能结合图中信息准确答题。
7．     平     胸腺嘧啶（T）     DNA连接     B     A类菌落含有P0     C类菌落未转入质粒     乙丙     目的基因反向连接
【分析】基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后会破坏四环素抗性基因（tetr）。
【详解】（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）依题意并据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶（EcoRV酶）切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
【点睛】解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤，尤其是对核心步骤——构建基因表达载体步骤的理解，明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用，进而结合题干要求分析答题。
8．     mRNA     逆转录酶     PCR     T-DNA     整合到叶肉细胞染色体DNA上     找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
【分析】基因工程的操作步骤：获取目的基因（基因文库获取、PCR、人工合成等）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（动物—显微注射法；植物—农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；微生物—钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平和个体水平）。
【详解】（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
【点睛】天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，即基因通过表达产生具有氨基酸序列的多肽链，加工后形成具有高级结构的蛋白质，进而行使生物功能。蛋白质工程与之相反，它是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列来进行改造。
9．     PCR     多肽（或蛋白质）     载体     总RNA     非天然氨基酸（Uaa）     D     细胞
【分析】本题以甲型流感病毒为素材，考查了基因工程、基因的表达、免疫调节的相关知识，意在考查学生的理解能力，综合运用所学知识解决问题的能力。可以改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力，此过程中需要用到PCR技术，然后通过基因工程构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。最后利用转基因宿主细胞制备疫苗，以预防该病毒再次侵染。
【详解】（1）PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。因此以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用PCR技术扩增，由于将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列，因此肽链合成提前终止，这样与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽（或蛋白质），因此不能产生子代病毒。
（2）基因工程的核心步骤为基因表达载体的构建，将该基因与载体连接后才能导入宿主细胞，检测目的基因是否成功表达上述tRNA时，利用核酸分子杂交技术，即用相应的DNA探针与宿主细胞的总RNA分子进行杂交鉴定，进而筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
（3）因为设计的宿主细胞具有能合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa），因此可在补加非天然氨基酸（Uaa）的培养基中进行培养，筛选出宿主细胞。进而利用该宿主细胞，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。因为转录在宿主细胞内进行，且启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，因此需要使用宿主细胞的RNA聚合酶。故选D。
（4）不具侵染性的流感病毒灭活疫苗，不能侵入细胞内部，只能引起体液免疫，产生相应的抗体与记忆细胞，而该疫苗能够侵入细胞，引起的免疫属于细胞免疫。
【点睛】解答本题需要考生掌握基因工程的原理、操作步骤及其一些细节问题，同时还要熟练掌握有关基因的表达及免疫调节方面的问题。
10．     化学合成(人工合成)     从含目的基因的生物细胞分离     限制性核酸内切酶(限制酶)  DNA连接酶(连接酶)     质粒     小型环状(双链环状、环状)     低     筛选     氨基酸
【详解】(1)获得目的基因，可以从含有目的基因的细胞中分离，在基因的碱基序列已知的前提下，也可以用化学合成的方法合成目的基因。
(2)切割DNA分子需要用限制性内切酶，连接DNA分子需要用DNA连接酶。
(3)运送目的基因进入受体细胞的载体包括动植物病毒、λ噬菌体的衍生物或质粒，质粒是小型的环状DNA分子。
(4)重组DNA分子成功导入受体细胞的频率较低，所以在转化后通常需要进行筛选操作，以选出含有重组DNA的受体细胞。
(5)将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，由于不同生物共用同一套密码子，从两者中生产的胰岛素在功能和氨基酸序列上是相同的。
11．(1)     无菌水     水浴     杀死不耐热微生物
(2)     分离     KI-I2
(3)     人工诱变     原生质体融合
(4)     农杆菌     过低     敏感性
(5)     再生     细胞核     形态特征和数量
(6)     培养时间     受精卵

【分析】（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
（二）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
（1）
产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。
（2）
将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。
（3）
要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。
（4）
野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T—DNA中插入一种抗生素抗性基因。抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农杆菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T-DNA中抗性基因的细胞能在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，因此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。
（5）
转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性较强的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。
（6）
植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时间长短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表达能力最高。

12．(1)     检测目的基因是否成功导入受体细胞     双分子层中
(2)蛋白质外壳和含N蛋白胞外段基因的核酸
(3)     胰蛋白酶或胶原蛋白     CO2培养箱
(4)     克隆化     抗原抗体杂交     细胞培养液
(5)抗体-药物偶联物##ADC

【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
（1）
构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即磷脂双分子层）。
（2）
由于目的基因为N蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N蛋白胞外段基因的核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。
（3）
进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有95%空气和5%的CO2混合气体的CO2培养箱中培养。
（4）
用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行克隆化培养和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。
（5）
利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治疗。