五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编93-生物技术工程-蛋白质工程、基因工程综合（含解析）

这是一份五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编93-生物技术工程-蛋白质工程、基因工程综合（含解析），共22页。试卷主要包含了单选题，综合题，实验题等内容，欢迎下载使用。

五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编93-生物技术工程-蛋白质工程、基因工程综合（含解析）

一、单选题
1．（2022·重庆·统考高考真题）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ）
A．进入人体后需经高尔基体加工 B．比人胰岛素多了2个肽键
C．与人胰岛素有相同的靶细胞 D．可通过基因工程方法生产
2．（2021·辽宁·统考高考真题）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（　　）
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
3．（2018·北京·统考高考真题）用XhoI和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（　　）

A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalI处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA

二、综合题
4．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________。

(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________、__________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是____________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是______________________________。

(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路________________________________________。
5．（2021·广东·统考高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。

回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
6．（2019·海南·统考高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。
（3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。
7．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：

(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致______。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有______
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进______，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及______酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在______。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是______。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明______，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
8．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。

回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
(3)过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是____________，基因敲除成功的判断依据是____________。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。
9．（2020·天津·统考高考真题）Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。

据图回答：
（1）为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有________个。

（2）在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。
（4）检测转化的乳酸菌发现，信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是________________________________。
（5）用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有________。
A．B细胞             B．T细胞                C．吞噬细胞           D．浆细胞
10．（2019·浙江·统考高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与果胶和果胶酶有关的问题：
（1）通常从腐烂的水果上分离产果胶酶的微生物，其原因除水果中果胶含量较高外，还因为______。
（2）为了获得高产果胶酶微生物的单菌落，通常对分离或诱变后的微生物悬液进行______。
（3）在某种果汁生产中，用果胶酶处理显著增加了产量，其主要原因是果胶酶水解果胶使______。果汁生产中的残渣果皮等用于果胶生产，通常将其提取液浓缩后再加入______。使之形成絮状物，然后通过离心、真空干燥等步骤获得果胶制品。
（4）常用固定化果胶酶处理含果胶的污水，其主要优点有______和可连续处理等。在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的主要有______和______。
（二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
（1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______技术获得特异性探针，并将______中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。
（2）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测______（A．质粒载体  B．转录产物  C．抗性基因  D．病原微生物）。
（3）植物细胞在培养过程中往往会发生______，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
（4）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是______。
11．（2018·海南·统考高考真题）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜_______（填“受伤的”或“完好的”）叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是______________。 
（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中_____已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1:1，则说明甜蛋白基因已经整合到_______（填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”）中。
（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用_______作为外植体进行组织培养。
（4）通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为______。
（2019·上海·高考真题）接种疫苗是预防疾病的措施之一。图显示了某种DNA疫苗的制备与使用过程，人体内将产生抗r的抗体。

12．图所示抗原蛋白基因最可能是致病菌M的 。
A．特有致病基因 B．特有不致病基因 C．全部致病基因 D．全部不致病基因
13．图所示的1-IV阶段中，需要使用DNA连接酶的是 ______阶段。筛选含有目的基因的受体细胞，发生在______阶段。
14．图所示的第V阶段，抗原蛋白r和抗r抗体的不同 。
A．基因来源的物种 B．转录mRNA序列
C．表达两种蛋白的细胞 D．翻译时tRNA所来源的物种
15．结合图及所学的知识，比较DNA疫苗和致病菌M，用“是”或“否”填写表相关内容。

核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗




致病菌M





___________________


三、实验题
16．（2018·江苏·统考高考真题）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备琢α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：

（1）利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的_________。
（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的____端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________。
（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_______的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）
①变性温度②退火温度③延伸温度④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间
（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含___个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有__种。
（5）获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液
50mmol/LNa2HPO4-KH2PO4
50mmol/LTris-HCl
50mmol/LGly-NaOH
pH
6．0
6．5
7．0
7．5
7．5
8．0
8．5
9．0
9．0
9．5
10．0
10．5
酶相对活性%
25．4
40．2
49．8
63．2
70．1
95．5
99．5
85．3
68．1
63．7
41．5
20．8

根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为______。

参考答案：
1．A
【分析】基因工程只能生产已有的蛋白质，人工长胰岛素A链有氨基酸的替换，B链增加了两个氨基酸，需要通过蛋白质工程生产。
【详解】A、胰岛素作用于细胞表面的受体，不需要经高尔基体的加工，A错误；
B、人工长效胰岛素比人胰岛素的B链上多了两个精氨酸，氨基酸与氨基酸之间通过肽键连接，故多2个肽键，B正确；
C、人工胰岛素和人胰岛素作用相同，都是降血糖的作用，故靶细胞相同，C正确；
D、人工长胰岛素是对天然蛋白质的改造，需要通过基因工程生产，D正确。
故选A。
2．D
【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。
2、蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。
3、蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
【详解】A、在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；
B、蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；
C、N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；
D、酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。
故选D。
【点睛】
3．D
【详解】【分析】该题考查DNA的结构、限制酶的特点和功能等。DNA一般是双螺旋结构；限制酶可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割。
【详解】限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoI和SalI两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；Sal I将DNA片段切成4段，Xho I将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为Sal I，泳道②为Xho I，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA，D错误，所以选D。
【点睛】注意图1两种限制酶的识别位点数量，Sal I有3个识别位点，能将DNA片段切成4段，Xho I有2个识别位点，能将DNA片段切成3段。
4．(1)     氨基酸序列多肽链     mRNA      密码子的简并性
(2)     从基因文库中获取目的基因     通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成      DNA双链复制
(3)     种类      提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间

【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列；
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
（1）
据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。
（2）
蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。
（3）
将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
（4）
若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。

5．     基因文库中获取、人工合成法     盐析法、酶解法或高温变性     感受态     抗原-抗体杂交技术     有的酶失活而使反应中断     基因的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
6．     mRNA     逆转录酶     PCR     T-DNA     整合到叶肉细胞染色体DNA上     找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
【分析】基因工程的操作步骤：获取目的基因（基因文库获取、PCR、人工合成等）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（动物—显微注射法；植物—农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；微生物—钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平和个体水平）。
【详解】（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
【点睛】天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，即基因通过表达产生具有氨基酸序列的多肽链，加工后形成具有高级结构的蛋白质，进而行使生物功能。蛋白质工程与之相反，它是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列来进行改造。
7．(1)     mRNA     蛋白M上不含tag标签     BC
(2)     黏性末端碱基配对     DNA连接     基因m的连接处、基因m的内部
(3)     受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落     融合基因表达（或融合基因正确解码）

【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
(1)
①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。
②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。
③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范围为94℃左右，A错误；
B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；
C、DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；
D、Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。
故选BC。
(2)
①从图上看，载体A只有一个Sma I的酶切位点，故被Sma I切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。
②重组质粒中，载体A被Sma I切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。
(3)
①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，位于lag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行知识迁移，准确答题。
8．(1)DNA连接酶
(2)感受态细胞法/Ca2+处理法
(3)     碱基互补配对     目标（目的）DNA（基因）
(4)     DNA分子杂交技术     经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功
(5)表达Cas9蛋白和sgRNA，两者形成复合体；sgRNA识别并结合目标DNA序列；引导Cas9蛋白切割目标DNA序列


【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
（1）
基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
（2）
大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（3）
根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
（4）
可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，即利用经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功。
（5）
根据图示可知：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列。
【点睛】本题以基因编辑技术为情境，考查DNA分子的结构、碱基互补配对、基因工程等相关知识，考查学生综合应用能力及科学思维的核心素养。
9．     6     ABCD     3     核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁     AB
【分析】本题以自身免疫病和Ⅰ型糖尿病为背景，考查了基因工程的相关知识，乳酸菌是原核细菌，要表达人体的人胰岛素抗原，必须通过基因工程技术才能实现。图示中将人胰岛素编码序列进行了改造，再与一小段短肽编码序列结合形成重组人胰岛素编码序列，进而构成重组表达载体。
【详解】（1）从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。
（2）要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，答案选ABCD。
（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。
（4）乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。
（5）人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能识别抗原。
【点睛】本题综合考查细胞的结构和功能、免疫调节和基因工程等相关的知识点，考向灵活，各知识点联系紧密，需认真审题。
10．     腐烂的水果中含产果胶酶的微生物较多     涂布分离（或划线分离）     水果组织软化疏松及细胞受损     95%乙醇     提高果胶酶的稳定性     固定化的方法     固定化所用的介质     单克隆抗体     基因文库     B     变异     高浓度致病真菌     花粉离体     胚的离体培养
【分析】（一）果胶是植物细胞壁的主要成分，果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散；果胶不溶于乙醇，是鉴别果胶的一种简易方法。
（二）目的基因表达产物在分子水平的检测包括DNA分子杂交、DNA-RNA分子杂交和抗原抗体杂交；生物变异在生产上应用时，可通过杂交育种、单倍体育种的方式获得稳定遗传的植株，单倍体育种的速度更快，相对的操作更加复杂。
【详解】（一）
（1）腐烂的水果通常细胞壁被分解较多，所以含有能产生果胶酶的微生物较多；
（2）获取单菌落的方式有划线分离法和涂布分离法两种，本题中两种方式均可；
（3）果胶酶的作用是水解果胶，果胶位于植物细胞壁中，故水解果胶会使得水果组织软化疏松及使细胞受损；果胶不溶于酒精，故提取回收果胶需要使用95%乙醇，使果胶形成絮状物回收；
（4）固定化的果胶酶在处理含果胶的污水时，可提高果胶酶的稳定性并可连续处理；在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的因素有固定化的方法和固定化所用的介质。
（二）
（1）抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因；
（2）质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A选项错误；转录产物为RNA，可以通过DNA-RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B选项正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C选项错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D选项错误；故正确的选项选择B；
（3）抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选；
（4）要利用胚的发育获得植株，可利用胚细胞的全能性，采用胚的离体培养获得植株。
【点睛】本题考察①果胶和果胶酶的性质以及果胶酶的固定；②基因工程以及变异品种的筛选，考察学生对课本知识的理解和题干的阅读能力，考查理解能力和科学思维能力。在变异品种的筛选中，要求获得的是抗致病真菌能力强的细胞，则只加入致病真菌只能筛选具有抗致病真菌能力的细胞，需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，则需要添加高浓度的致病真菌，这对考查学生对筛选培养基的理解有一定的要求。
11．     受伤的              叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞        甜蛋白基因     核基因组     茎尖     按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型
【分析】本题主要考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念及操作步骤，能根据基因工程的操作步骤归纳基因工程的概念。
【详解】（1）如果叶片受伤，伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞，故用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养。 
（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，其子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1:1，根据基因分离定律，得知转基因黄瓜植株为杂合子，非转基因植株为隐性个体，为测交，故说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。
（3）要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，由于茎尖生长点的细胞分裂生长最为活跃，且容易分化成其他器官，这是其他分生区细胞所不具备的优点，另外取材方便，故应选用茎尖作为外植体进行组织培养。
（4）基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。
【点睛】本题的难点在基因工程的概念，有助于考查考生使用生物学语言表达观点的能力，识记类考点，往往由于复习时的忽视，而成为考试的难点和失分点。
12．B    13．     Ⅰ     Ⅳ    14．ABC    15．

核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗
是
是
是
否
致病菌M
否
是
是
否


【分析】1.基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。
2.识图分析可知：某种DNA疫苗的制备与使用过程，其中Ⅰ表示从病菌或病毒中获取目的基因和质粒构建基因表达载体，Ⅱ表示将目的基因导入受体菌细胞，Ⅲ表示受体菌的扩增过程，Ⅳ表示筛选含有目的基因的受体菌，Ⅴ为基因疫苗的注射使用以及在人体细胞内表达出抗原蛋白的过程。
12．由于制备的疫苗往往是减毒或者灭活的，使其使其致病性但是具有抗原性的特点，因此推测图所示抗原蛋白基因最可能是致病菌M的特有不致病基因，制备成基因疫苗后表达的蛋白质具有抗原性，但是不具有致病性。综上所述，B符合题意，A、C、D不符合题意。故选B。
13．在如图所示的疫苗制备过程中，通常需要用到DNA连接酶的过程是Ⅰ表示从病菌或病毒中获取目的基因和质粒构建基因表达载体。根据以上分析可知，筛选含有目的基因的受体细胞，发生在Ⅳ阶段。
14．基因表达包含了转录和翻译，抗原蛋白r和抗r抗体属于两种不同的蛋白质，由不同的基因转录，故基因所来源的物种、转录出的mRNA碱基序列、翻译出的氨基酸序列都不同，翻译时tRNA所来源的物种相同。综上所述， A、B、C正确，D错误。故选ABC。
15．根据题意和识图分析可知，DNA疫苗是以致病菌M的特有不治病性基因为目的基因制成的，因此没有致病性。DNA疫苗以核苷酸式进入人体，在人体细胞内表达出相应的抗原蛋白，刺激机体发生特异性免疫。包括体液免疫和细胞免疫的过程，引起机体产生抗体和相应的记忆细胞，为二次免疫做好准备。致病菌M以病原体的形式进入人体，作为抗原被识别后引起机体发生体液免疫和细胞免疫，由于激发特异性免疫需要时间较长，因此初次免疫过程中会表现出明显的致病性。综上所述，表格内容如下：

核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗
是
是
是
否
致病菌M
否
是
是
否

【点睛】本题以DNA疫苗的制作为背景考查基因工程和免疫的知识点，要求学生掌握基因工程的操作步骤和操作工具酶的使用，能够正确识图判断图中的发生的生理过程，把握免疫学的应用中被动免疫的应用，理解疫苗的作用和疫苗的种类，通过题意和图示把握DNA疫苗与传统疫苗的区别和类型，利用所学的免疫学的知识点分析解决问题。
16．     基因组DNA     5’     使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连     ②     ⑥     8     13     pH为8．5，缓冲液为50mmol/LTris-HCl
【分析】据图分析，图示为利用基因工程大量制备α-淀粉酶的过程，目的基因是α-淀粉酶基因，与体构建基因表达载体，然后将目的基因导入大肠杆菌，接着对目的基因进行检测与鉴定，最后利用工程菌培养获得大量的α-淀粉酶产品。
【详解】（1）α-淀粉酶基因来自于海洋细菌，因此为了利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因，必须先获得细菌的基因组DNA。
（2）目的基因与运载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3’端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5’端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。
（3）进行扩增时，退火温度的设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。
（4）根据题意分析，虚线框内mRNA片段内含有24个碱基，每3个碱基构成一个密码子，因此包含24÷3=8个密码子；构成mRNA的碱基有4种，若虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有4×4-3=13种。
（5）根据表格数据分析可知，在pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条件下，α-淀粉酶相对活性为99.5%，活性最高。
【点睛】解答本题的关键是基因工程的四个基本步骤以及PCR技术的过程、条件，回忆相关知识点和注意事项，结合提示分析答题。