2023届高考生物二轮复习破译新情境——通过“PCR技术应用”构建PCR类试题解题思维模型学案

破译新情境——通过“PCR技术应用”构建PCR类试题解题思维模型

探究路径(一)　PCR技术与病毒检测

[见识新情境]

新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。实时荧光 PCR 扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链 DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR 过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR 检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。

[追根于教材]

1．与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，可能的原因是什么？

提示：Taq DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降。

2．Ct值是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。请推测样本中初始模板数与Ct值的关系。

提示：当样本中初始模板数越多时，Ct值就越小。

3．某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct值≤37判定为阳性，Ct值＞40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定结果是________(填“阴性”或“阳性”)。

提示：阳性。

4．阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有________(填字母)。

a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR 检测阈值

b．样本被污染，RNA 酶将病毒 RNA 降解

c．病毒发生变异

提示：abc

探究路径(二)　基因定点突变与基因改造

　　[见识新情境]

重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。

[追根于教材]

1．若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为______才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______(假设引物为单链DNA)。

提示：C—G或T—A　G或A

2．在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生______种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，其原因是什么？_____________________________。

提示：3　引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用。

3．利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是什么？

提示：M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。

归纳建模

串联PCR技术，构建解答PCR类试题思维模型

类题训练

1．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。

(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是____________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。

(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的__________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。

(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明____________________________。

(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是____________________________________________

________________________________________________________________________。

解析：(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA合成cDNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(温度超过90 ℃)、复性(50 ℃左右)、延伸(72 ℃左右)，故其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。(4)基因工程的基本操作流程是：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)。

答案：(1)逆转录酶　(2)特异性核苷酸序列　复性　(3)曾感染新冠病毒，已康复　已感染新冠病毒，是患者　(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (检测受体能否产生S蛋白)

2．(2018·江苏高考，改编)为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。

(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)

①变性温度　②复性温度　③延伸温度　④变性时间　⑤复性时间　⑥延伸时间

(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：

5′－U……－3′

图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。

解析：(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α-淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR技术包括变性、复性和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；复性时引物结合到互补的DNA单链上，复性温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制α-淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第1个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第1个密码子实际最多可能性有16－3＝13(种)。

答案：(1)基因组DNA　(2)5′　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连　(3)②　⑥　(4)8　13

[应用、创新考法增分训练]

题组一　关注生产生活，分析解决问解

1．黑胫病对甘蓝型油菜的危害十分严重，黑芥能抗黑胫病，两者不能直接杂交。为解决该问题，科研人员通过如图所示过程获得抗病品系。据图分析，下列相关叙述不正确的是(　 )

A．最终获得的抗病植株具有完整的甘蓝型油菜和黑芥的遗传信息

B．过程①可使用纤维素酶，过程②可利用PEG进行诱导

C．过程③发生脱分化，过程④体现出植物细胞具有全能性

D．黑芥与甘蓝型油菜存在生殖隔离

解析：选A　在培养过程中用紫外线照射黑芥，使其染色体断裂，最终获得的抗病植株可能并不具有黑芥的完整遗传信息，A错误；植物细胞壁的主要成分是纤维素，过程①去除植物细胞壁，可使用纤维素酶，过程②诱导原生质体融合，可利用PEG进行诱导，B正确；过程③发生脱分化，形成愈伤组织，过程④筛选出的融合细胞长成植物体，体现出植物细胞具有全能性，C正确；黑芥与甘蓝型油菜是两个物种，存在生殖隔离，D正确。

2．为响应生态乡村、美丽乡村建设，某村构建“种植业－养殖业－旅游业”三位一体发展模式(如图所示)，其中种植业和养殖业均分为经济类、观赏类两类，村中依势构建出山林枝展果坠、斜坡花繁蝶醉、荷塘莲满鱼肥、菜园蔬鲜瓜脆四大特色区，各特色区中种植的作物和养殖的动物不尽相同。

(1)该村养殖的各种动植物与其他生物________(填“能”或“不能”)构成一个群落。各特色区动植物种类的选择体现了生态工程的______________等原理。

(2)下图表示某特色区中能量流动的部分过程。

第一、二营养级间的传递效率可用③÷(①＋⑤＋X)×100%表示，其中X代表的含义是________________，图中____________(填序号)的能量未流人第二营养级，导致从第一营养级到第二营养级的能量流动是递减的。以牧草→羊为例，欲提高经济效益，应设法提高③/②和④/③值，请分别说出一条措施：____________________________________、__________________________________________。

(3)某兴趣小组在劳动体验区租种了一块长势良好的菜地，并将其均分为甲、乙两部分，其中甲组继续人工管理，乙组不再进行管理，一个月后，甲组蔬菜长势良好而乙组杂草丛生、面目全非。这一方面说明了该菜地稳定性很低，原因是_______________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________；

另一方面也说明了______________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)旅游业的发展导致厨余垃圾和各色垃圾显著增多，请据此提出合理化的解决措施：________________________________________________________________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________(答出两条即可)。

解析：(1)该村养殖的各种动植物与其他生物不能构成一个群落，因为群落指的是某一区域内所有生物的总称。各特色区动植物种类的选择是生态工程的整体性、协调与平衡、物种循环再生、物种多样性原理的体现。(2)能量传递效率指的是相邻营养级同化量之间的比值，第一营养级的同化量等于植物光合作用合成有机物的总量＝植物光合作用积累的有机物＋植物呼吸作用消耗的能量＝①＋⑤＋植物呼吸作用消耗的能量，即X表示的是植物呼吸作用消耗的有机物的量，因此，第一、二营养级间的传递效率可用③÷(①＋⑤＋X)×100%表示，图中⑤⑥⑦均是未流入第二营养级的能量，进而导致从第一营养级到第二营养级的能量流动表现为逐级递减。以牧草→羊为例，欲提高经济效益，应设法提高③/②和④/③值，③/②表示的是食物的利用率，为了提高食物的利用率可设法对食物进行加工，如可将牧草加工粉碎成精饲料(或将牧草经过纤维素分解菌初步发酵)，这样可提高摄入食物的利用率；④/③表示同化量的积累率，为此需要设法减少羊的呼吸消耗，可将放牧改为圈养，减少羊的活动空间，从而减少羊的呼吸消耗量。(3)甲组蔬菜长势良好而乙组杂草丛生、面目全非。这一方面说明了该菜地稳定性很低，需要人工不断维护才能保持良好的长势，其稳定性低的原因是菜地中物种少，营养结构简单，自我调节能力弱，因而抵抗力稳定性低；另一方面也说明了人类活动可以改变群落演替的速度和方向，即通过人的作用可以保证菜地中蔬菜的优势地位。(4)旅游业的发展导致厨余垃圾和各色垃圾显著增多，因此需要设法利用垃圾资源变废为宝，可采取的措施有利用厨余垃圾制造沼气(或将厨余垃圾制成有机肥 )、将各色垃圾分类回收。

答案：(1)不能　整体性、协调与平衡、物种循环再生、物种多样性　(2)植物呼吸作用消耗量　⑤⑥⑦　将牧草加工粉碎成精饲料(或将牧草经过纤维素分解菌初步发酵)　将放牧改为圈养，减少羊的活动空间　(3)物种少，营养结构简单，自我调节能力低，抵抗力稳定性低　人类活动可以改变群落演替的速度和方向　(4)利用厨余垃圾制造沼气(或将厨余垃圾制成有机肥 )、将各色垃圾分类回收

题组二　关注人体健康，体现责任担当

3．研究人员将人的多能干细胞通过体细胞诱导培养出全能干细胞(相当于受精卵发育3天的状态)，使得“成年”版本的细胞逆向转化为具有更多可能性的“婴儿期”版本的细胞。该全能干细胞比囊胚期细胞(相当于受精卵发育5～6天的状态)具有更强的发育潜力。下列说法错误的是(　 )

A．培养全能干细胞时需将其置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中

B．多能干细胞具有分化成多种细胞组织的潜能，但不具有发育成完整个体的能力

C．囊胚期细胞的内细胞团将发育成胎盘和胎膜

D．患者利用自身全能干细胞诱导得到的器官进行移植可以更好地避免免疫排斥反应

解析：选C　动物细胞培养，需将其置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2恒温培养箱中培养，A正确；多能干细胞具有分化成多种细胞组织的潜能，但不具有发育成完整个体的能力，B正确；囊胚期细胞的滋养层将发育成胎盘和胎膜，C错误；利用自身全能干细胞诱导得到的器官进行移植可以更好地避免免疫排斥反应，D正确。

4．我国科学家从新冠肺炎康复患者外周血单个核细胞(PBMC)中获取新冠病毒的抗体DNA，插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，通过侵染宿主菌构建基因文库后，最终获得全人源抗新冠病毒单克隆抗体。下列说法错误的是(　 )

A．该种单克隆抗体可作为药物用于新冠肺炎的治疗

B．研制获得该种单克隆抗体的过程，需要对B淋巴细胞进行大规模体外培养

C．研制获得该种单克隆抗体的过程，应用了基因工程和发酵工程技术

D．该种单克隆抗体并非在人体中表达，可能因空间结构改变而失去特异性

解析：选B　该种单克隆抗体可作为药物用于新冠肺炎的治疗，A正确；B淋巴细胞不能无限增殖，所以不能进行大规模体外培养，B错误；该过程获取新冠病毒的抗体DNA，插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，应用了基因工程技术，侵染宿主菌表达单克隆抗体应用了发酵工程技术，C正确；该种单克隆抗体在宿主菌中表达，因为宿主菌没有高尔基体和内质网，不能对抗体进行加工，可能会因特定的空间结构不能形成而失去特异性，D正确。

5．(2022·广州模拟)新冠病毒(RNA病毒)表面S刺突蛋白上的受体结合结构域(S-RBD)能够与人细胞表面受体ACE2结合，介导病毒侵入宿主细胞。科研人员进行了抗S-RBD蛋白单克隆抗体的制备及研究。

(1)从新冠患者体内提取到S蛋白的RBD片段，多次注射到小鼠体内，目的是

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

一段时间后将获取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，利用____________筛选出杂交瘤细胞。

(2)将得到的4种杂交瘤细胞分别进行动物细胞培养，分别取其上清液进行抗体阳性检测，从中选出产生“最优抗体”的杂交瘤细胞。检测的流程如图1，检测的结果如图2。

图1实验过程中，将S-RBD固定，将上述4种杂交瘤细胞的上清液和未免疫小鼠的血清加入到反应体系，然后加入酶标抗体。由图可知酶标抗体与待测抗体结合，将待测抗体作为____________，酶标抗体携带的酶再使底物显色，底物显色越深吸光值越大。据图2结果分析，研究人员认为杂交瘤细胞______(填“序号”)产生的抗体为“最优抗体”，依据是_____________________________________________________________________________。

(3)研究人员将选出的“最优抗体”用于制备成新冠病毒抗原检测试剂盒，利用该试剂盒可以快速初筛是否感染新冠病毒，反映出单克隆抗体广泛的用途是__________________。

解析：(1)单克隆抗体制备过程中的第一步是获取已免疫的B淋巴细胞，所以从新冠患者体内提取到S蛋白的RBD片段，多次注射到小鼠体内，目的是刺激小鼠产生更多已免疫的B淋巴细胞，一段时间后将获取的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，融合后进行筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞用的是选择培养基，未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(2)第二次筛选的目的是筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞，方法原理是抗原—抗体杂交，因此用酶标抗体与待测抗体结合，将待测抗体作为抗原，酶标抗体携带的酶再使底物显色，底物显色越深吸光值越大。据图2结果分析，①产生的抗体为“最优抗体”，依据是不同稀释倍数下，①的吸光值最大，说明酶标抗体与①产生的抗体结合最多，①产生的抗体与抗原结合能力最强。(3)单克隆抗体被广泛用作体外诊断试剂。

答案：(1)刺激小鼠产生更多已免疫的B淋巴细胞　选择培养基　(2)抗原　①　不同稀释倍数下，①的吸光值最大，说明酶标抗体与①产生的抗体结合最多，①产生的抗体与抗原结合能力最强　(3)作为体外诊断试剂

题组三　引入科普情境，增长知识见识

6．如图是我国科学家制备小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞的相关研究流程，其中Oct4基因在维持胚胎干细胞全能性和自我更新中发挥重要作用。下列叙述正确的是(　 )

A．从小鼠卵巢中获取的卵母细胞可以直接用于过程①

B．推测Oct4基因的表达有利于延缓衰老

C．单倍体胚胎干细胞与成体干细胞类似，可诱导分化成各种功能的组织和器官

D．孤雄单倍体胚胎干细胞由重组细胞减数分裂而来，其核遗传物质由精子提供

解析：选B　卵母细胞要培养到减数分裂Ⅱ的中期才具备受精的能力，在受精作用过程中完成减数分裂Ⅱ，所以过程①选取的卵子应该是处于减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞，A错误；Oct4基因在维持胚胎干细胞全能性和自我更新中发挥重要作用，据此可推测，Oct4基因的表达有利于延缓衰老，B正确；单倍体胚胎干细胞类似于正常胚胎干细胞，具有发育的全能性，可诱导分化成各种功能的细胞、组织和器官，而成体干细胞来源于已经分化组织中的未分化细胞，如造血干细胞，其只能分化为特定的组织和器官的细胞，C错误；孤雄单倍体胚胎干细胞由重组细胞经过有丝分裂而来，其核遗传物质由注入Oct4转基因的精子提供，D错误。

7．In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20bp)，然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为：①质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。

(1)过程①中需要用到的酶有_______________。另外，利用_____________处理也可以直接得到线性化质粒。

(2)据图分析，为保证扩增出所需的目的基因，引物A或引物B要依据___________________序列进行设计。过程②经过_________轮循环即可初步得到符合要求的目的基因片段。

(3)过程③中，同源序列1、2中的碱基排序不同，这样设计的好处是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

图示In-Fusion技术可作为模型使用，一般来说只需要改变图中的________，即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。

(4)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞时，过程④需要用_________处理大肠杆菌。

解析：(1)据图可知，过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR技术的应用，故需要耐高温的DNA聚合酶；此外，也可利用限制酶切割相应的磷酸二酯键直接得到线性化质粒。(2)据图分析，目的基因经引物A或引物B扩增后需要与线性化质粒连接，故为保证扩增出所需的目的基因，引物A或引物B要依据目的基因和质粒序列进行设计；根据DNA半保留复制的特点，可知PCR第3轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，至少经过3轮循环可得到符合要求的目的基因片段。(3)过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基排序不同，这样设计的好处是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达；引物是一段已知目的基因的脱氧核苷酸片段，故一般来说只需要改变图中的引物A和引物B，即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。(4)将目的基因导入微生物细胞时，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于易吸收环境中DNA分子的感受态。

答案：(1)耐高温的DNA聚合酶　限制酶　(2)目的基因和质粒　3　(3)防止目的基因反向连接；防止线性化质粒或目的基因的自身环化　引物A和引物B　(4)Ca2＋