2023届高考生物二轮复习热点6基因工程中PCR的原理及应用学案

热点6　基因工程中PCR的原理及应用

[知识关联]

 [针对训练]

1.(2022·山东威海二模)《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》对于解除隔离管理标准做了新规定:轻型病例连续两次新型冠状病毒核酸检测(采样时间至少间隔24小时)N基因和ORF基因Ct值均≥35,可解除隔离管理。利用荧光定量PCR方法测某基因的Ct值是指将某目的基因与过量的荧光素混合后放入PCR反应体系中,随PCR产物的积累荧光信号逐渐增强,将荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次数称为Ct值。下列说法错误的是(　B　)

A.利用荧光定量PCR方法测N基因和ORF基因的Ct值时,应先通过逆转录得到N基因和ORF基因对应的DNA序列

B.采样标本中的N基因和ORF基因数量越多,Ct值越大

C.PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温和一次降温

D.基因工程中PCR技术可用于获取和扩增目的基因以及检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上

解析:分析题意,将荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次数称为Ct值,故样本中初始模板越多时,达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越小,Ct值就越低。

2.(2022·全国高三专题练习)如图是快速RT-PCR过程示意图,①和②为逆转录酶催化的逆转录过程,③是PCR过程。据图分析下列说法错误的是(　B　)

A.逆转录酶具有DNA聚合酶能力

B.③过程只需要引物b

C.RT-PCR可检测基因是否转录

D.RT-PCR可检测新型冠状病毒等RNA病毒

解析:③PCR过程需要引物a、b。

3.(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例):

请据图回答问题。

(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种　　　　　　　　酶,它通过识别特定的　　　　　　　切割特定位点。 

(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成　　　　　　　;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得　　　　　　;Taq DNA聚合酶的作用是催化　                  。 

(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　　　　(从引物①②③④中选择,填编号)。 

(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是　　　　。 

A.5′-AACTATGCG┄┄AGCCCTT-3′

B.5′-AATTCCATG┄┄CTGAATT-3′

C.5′-GCAATGCGT┄┄TCGGGAA-3′

D.5′-TTGATACGC┄┄CGAGTAC-3′

解析:(1)根据题图可知,步骤 Ⅰ 是为了获取目的DNA片段,所用的酶EcoR Ⅰ 是一种限制酶,其能识别特定的核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤 Ⅱ 是将目的DNA片段连接成环状,其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′-羟基和5′-磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中,升高温度到超过 90 ℃是为了打开氢键使双链解旋,获得DNA单链,Taq DNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板延伸成子链的过程。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链,因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸,故为扩增未知序列,选择的与模板链相结合的引物应为5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′(引物④)和 5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ (引物②)。(4)分析题意可知,片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ 切割后产生的黏性末端,因此其5′端序列应含有AATTC,3′端序列应含有TTAAG,B正确。

答案:(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列

(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸

(3)②④　

(4)B

热点提升练

一、选择题

1.(2022·全国高三专题练习)Kisspeptin(Kp)是脊椎动物的一种肽类激素,对下丘脑分泌促性腺激素释放激素(GnRH)的神经元有活化作用。研究者为探究Kp、GnRH以及GnRH受体的相关基因在下丘脑和垂体中的表达情况,提取下丘脑和垂体中的RNA,采用RTPCR扩增DNA(RT是反转录)进行检测。下列有关叙述不正确的是(　D　)

A.RTPCR过程需要的酶有逆转录酶、TaqDNA聚合酶

B.PCR扩增时可以相关基因的mRNA的核苷酸序列为依据设计引物

C.检测RTPCR的产物可采用DNA分子杂交和荧光分子杂交技术

D.可检测到Kp受体、GnRH、GnRH受体相关基因均在下丘脑中表达量最高

解析:根据题意可知,Kp受体和GnRH基因在下丘脑中表达量会比较高,但GnRH受体基因应该是在垂体中表达较高,因为垂体分泌细胞才是GnRH的靶细胞。

2.(2022·北京高三专题练习)研究人员用如图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点),将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。以下叙述不正确的是(　C　)

A.构建重组质粒的过程应选用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶

B.使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组

C.能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠

杆菌

D.利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙

解析:能在添加四环素的培养基上生存的也可能是只含有质粒的大肠杆菌。

3.利用PCR既可以快速扩增特定基因,也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述,错误的是(　D　)

A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶

B.变性过程中,双链DNA的解开不需要解旋酶

C.复性过程中,引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则

D.延伸过程中,需要4种核糖核苷酸

解析:延伸过程中,需要的是4种脱氧核糖核苷酸。

4.控制哺乳动物的性别对于畜牧业生产具有十分重要的意义。SRY基因是Y染色体上决定雄性性别的基因,SRYPCR胚胎性别鉴定技术是现阶段进行胚胎性别鉴定最准确和最有效的方法。下列说法错误的是(　D　)

A.可利用Y精子DNA含量比X精子低的差异筛选两种精子,从而对胚胎性别进行控制

B.从Y染色体DNA分子上获取SRY基因,可用SRY基因的核苷酸序列设计引物

C.SRYPCR胚胎性别鉴定技术中,要用到SRY基因特异性探针进行

检测

D.利用PCR经过3次循环,理论上获得的SRY基因占扩增产物一半

解析:因为经过3次循环之后才能出现目的基因的片段,故利用PCR经过3次循环,理论上获得的SRY基因占扩增产物的1/4。

5.从自然界中的生物体内分离得到的天然酶,在工业生产环境中催化效率往往较低。科研人员对酶的改造包括理性设计方法和非理性设计方法。理性设计方法是通过定点诱变改变蛋白质中的个别氨基酸,以产生更加理想的酶;非理性设计方法主要通过易错PCR技术实现,该技术是利用低保真的TaqDNA聚合酶和改变PCR的反应条件,降低DNA复制的保真度,从而使扩增产物出现较多突变点的一种体外诱导DNA序列变异的方法。下列相关叙述错误的是(　D　)

A.通过理性设计以产生更加理想的酶的技术称为蛋白质工程

B.低保真的TaqDNA聚合酶会增加新DNA链合成过程中碱基的错配率

C.利用易错PCR技术扩增产物时在PCR反应缓冲液中一般会添加Mg2+

D.易错PCR技术的扩增过程中50 ℃处理的目的是使DNA分子彻底

变性

解析:通过理性设计,能够产生并得到更加理想的酶的技术称为蛋白质工程;低保真的TaqDNA聚合酶会增加新DNA链合成过程中碱基的错配率,会产生较多的突变点;Mg2+可以激活DNA聚合酶,故利用易错PCR技术扩增产物时在PCR反应缓冲液中一般会添加Mg2+;易错PCR技术的扩增过程中50 ℃处理的目的是使引物与模板结合。

6.滁菊为菊科多年生草本植物,长期营养繁殖易造成病毒积累,导致滁菊花色劣变。某科研小组比较了3种脱毒方法对滁菊体内菊花B病毒(CVB)和菊花矮化类病毒(CSVd)脱除的效果,结果见表;如图是对不同试管苗利用CVB基因序列引物进行逆转录PCR(RTPCR)后的电泳示意图。下列叙述正确的是(　C　)

A.热处理、病毒唑处理对试管苗的存活率均有显著提高

B.只脱除CVB的最佳选择是热处理和病毒唑结合茎尖组织培养

C.RTPCR中用到的酶有逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶

D.试管苗2、5尚未脱毒成功,3、4已成功脱去CSVd和CVB

解析:由实验结果可知,与对照组相比,热处理、病毒唑处理组的样本存活数都较少,说明热处理、病毒唑处理对试管苗的存活均有一定的抑制作用;与对照组相比,热处理结合茎尖培养时,脱除CVB率比较高,而病毒唑结合茎尖组织培养时,脱除CVB率和对照组相差不大,因此只脱除CVB的最佳选择是热处理结合茎尖组织培养;RTPCR中包括逆转录过程和PCR过程,逆转录过程需要用到逆转录酶,而PCR过程需要用到耐高温的DNA聚合酶;试管苗2、5电泳结果显示阳性结果,试管苗3、4则没有,说明试管苗3、4成功脱毒(CVB),试管苗2、5未能脱去CVB。

7.(2022·山东济宁二模)通过引物设计,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变,如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2 分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(　D　)

A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的3′端

B.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、ATP

C.第2轮PCR中,引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因

D.在第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4

解析:DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的,据此可知,图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5′端;PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和缓冲液等物质,但不需要加入ATP,因为PCR过程中是通过调节温度实现的,不需消耗能量;第2轮PCR中,引物1与图中②结合形成两条链不等长的突变基因,因为图中②是由引物2开始直到完整的DNA单链合成,而引物1与该模板链的复性过程并没有从该模板DNA单链的一端开始;在第3轮PCR结束后,会产生23=8(个)DNA分子,其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有两个,其他的DNA分子均是不等长的,因此含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4。

8.在PCR反应体系中,加入过量的只与双链DNA结合而不与单链DNA结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果,该染料在游离状态不发出荧光,只有在DNA复制过程中掺入DNA双链才发出荧光。下列分析错误的是(　B　)

A.PCR体系中需加入Mg2+来激活耐高温的DNA聚合酶

B.若要扩增一个DNA上的某基因,应加入DNA的两种引物和该基因的两种引物

C.荧光染料在每个循环的延伸阶段掺入双链DNA中

D.荧光信号强度与产物的数量呈正相关

解析:若要扩增DNA上的某一基因,应加入该基因的两种引物。

9.(不定项)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性,原理如图所示。下列说法正确的是(　ACD　)

注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。

A.过程①需要模板、含Mg2+的缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等

B.若引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为G

C.经过过程④获得的杂交DNA有2种,只有其中一种可以经过过程⑤获得目的基因

D.以过程⑤获得的目的基因为模板,可以使用引物1和引物4进行PCR

解析:若引物2的突变位点设计为A,则目的是让基因中的碱基对A—T突变为T—A,步骤④获得的杂交DNA,一条链与引物2互补,另一条链与引物3互补,所以引物2和引物3的序列互补,引物3的突变位点应设计为T。

10.(不定项)(2022·北京高三专题练习)20世纪70年 代,某科学家发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图,在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP); ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点,并终止DNA片段的延伸。在4个试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止,并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法中正确的是(　ABC　)

A.这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶

B.ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′端

C.测得未知DNA的序列为5′—TCAGCTCGAATC—3′

D.电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以胞嘧啶结尾

解析:电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾。

二、非选择题

11.(2022·广东高三专题练习)如图为某种转基因抗病毒棉花培育过程图,请据图回答下列问题。

(1)PCR技术利用的基本原理是　　　　           　　。利用该技术扩增目标DNA片段(子链的延伸方向从5′→3′),应选择图中的引物　　          　　(填字母)与模板DNA结合。 

(2)PCR过程中,子链延伸需要引物的原因是                     

　                         。 

PCR技术通常需要长度为20～30个核苷酸的DNA片段作为引物,如果引物过短,则对扩增结果的影响是　                  。 

(3)在构建基因表达载体时,常用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒,获得不同的黏性末端,其主要目的是防止　　　　　　　　和反向连接。 

(4)重组细胞经过G、H过程成功地培育出了转基因抗病毒棉花植株,该过程利用了　　　　　　技术,其原理是　　　　　　　　　　。

(5)研究表明,转基因植物可以通过花粉将外源基因扩散到其他植物,从而对生态环境造成潜在的危害。因此,科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中,这样做的目的是　　　　　 　 　。

解析:(4)重组细胞经过G、H过程成功地培育出了转基因抗病毒棉花植株,该过程利用了植物组织培养技术,其原理是植物细胞的全能性。

(5)花粉中含有精子,几乎不含细胞质,而受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞,所以科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中后,就不会通过花粉转移到自然界中的其他植物。

答案:(1)DNA半保留复制　B、C

(2)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到已有的核酸片段上　会扩增出更多的非目标DNA分子

(3)目的基因和质粒自身环化

(4)植物组织培养　植物细胞的全能性

(5)防止目的基因通过花粉向其他植物扩散

12.(2022·天津和平区二模)转座子是指能从基因组的一个位置移动到另一个位置的DNA片段。Ac片段能编码转座酶,可自主移动。Ds片段需在转座酶作用下,才可以从原来的位置上切离下来,然后随机插入所在染色体的其他位置或其他染色体上。

(1)用限制性内切核酸酶和DNA连接酶将Ds片段构建在Ti质粒的TDNA片段上,再用含有该重组质粒的土壤农杆菌转化水稻,自交筛选获得DsTDNA纯合体(甲),以同样方法获得AcTDNA纯合体水稻(乙)。甲、乙杂交获得Ac/Ds双因子转座系统水稻,在其后代中筛选到一些淡绿叶突变体。利用淡绿叶突变体与野生型水稻(甲)进行系列杂交实验,　　　(代)获得野生型和淡绿叶水稻植株分别为442株和130株,分离比符合3∶1,初步推测淡绿叶突变是单基因的　　　　性突变。将442株野生型植株单株收获和播种,后代发生性状分离的植株占　　　　,则进一步确认上述推测。 

(2)为进一步确定突变性状与Ds发生切离转座的相关性,设计6种引物(如图1),对上述572株子代的TDNA进行PCR检测。

①检测原理:Ds未发生切离的DNA位点,通过引物　　　　可得到

400 bp的扩增产物;Ds已发生切离的DNA位点通过引物　　　　　可得到870 bp的扩增产物。 

②扩增产物的电泳结果如图2,据此判断　　　　类型为淡绿叶突变体。若A类型∶B类型∶C类型=　　　　　　,则突变性状产生与Ds片段的切离转座有关。 

解析:(1)根据题意分析,利用淡绿叶突变体与野生型水稻(甲)进行系列杂交实验,子一代为杂合子,子二代(F2)中出现性状分离,野生型和淡绿叶水稻植株分别为442株和130株,分离比接近3∶1;符合一对等位基因的杂合子自交实验的性状分离比,说明淡绿叶突变是单基因的隐性突变。如果上述推测是正确的,则杂交后代中442株野生型植株中纯合子∶杂合子=1∶2,将这442株野生型植株单株收获和播种,只有杂合子自交后代会发生性状分离,即后代发生性状分离的植株占2/3。

(2)①检测原理:由于PCR扩增中子链是沿着引物的5′→3′,延伸,因此Ds未发生切离的DNA位点,通过引物b、d可得到400 bp的扩增产物;Ds已发生切离的DNA位点通过引物c、d可得到870 bp的扩增产物。②上述572株子代表型之比为3∶1,对上述572株子代的TDNA进行PCR检测,扩增产物的电泳结果如图2,B类型的接近870 bp,据此判断B类型为淡绿叶突变体;C类型为Ds未发生切离的类型(接近400 bp),而A类型为发生切离的和未发生切离的杂合体,若A类型∶B类型∶C类型=2∶1∶1,则突变性状产生与Ds片段的切离转座有关。

答案:(1)F2　隐　2/3

(2)①b和d　c和d　②B　2∶1∶1