2023届高考生物二轮复习基因工程与蛋白质工程作业含答案

这是一份2023届高考生物二轮复习基因工程与蛋白质工程作业含答案，共29页。试卷主要包含了14 ml/L等内容，欢迎下载使用。
专题27　基因工程与蛋白质工程
高频考点
考点1　基因工程的工具与操作程序
该考点中基础部分训练内容为限制酶、DNA连接酶、运载体、PCR技术等。重难、综合部分为结合具体情境,考查对基因工程工具的理解和应用,目的基因的获取涉及的PCR相关问题的分析、基因表达载体的构建问题的分析等。
基础
1.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为(　　)
A.6　　　　　B.250
C.4 000　　　　　D.24 000
答案　　C　
2.(2022盐城阜宁中学三检,15)热启动PCR可提高扩增效率,其基本方法是进行反应之前将Taq酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内,而是将样品加热,待温度升到70 ℃以上时,再将上述试剂加入,开始PCR扩增。下列叙述正确的有(多选)(　　)
A.Taq酶最适催化温度范围为50~60 ℃
B.与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链合成一定都是从5'端向3'端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
答案　　BC　
3.(2022南通质检一,17)图1表示大肠杆菌pBR322质粒,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述正确的是(多选)(　　)

图1

图2
A.图1质粒中含有多个限制酶的酶切位点,不含游离的磷酸基团
B.构建重组质粒时若选用BamHⅠ会破坏两个标记基因,不便于后续的筛选
C.构建重组质粒时同时用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ,利于防止目的基因反向连接
D.将重组质粒直接转入处于感受态的酵母菌细胞,可实现其快速扩增
答案　　ABC　
重难
4.(2021江苏,13,2分)如图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略,下列相关叙述错误的是(　　)

A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒,都带有T-DNA序列
B.该方法建立在高转化频率基础上,标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C.若要获得剔除标记基因的植株,转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
答案　　D　
5.(2021湖北,16,2分)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量　　　　　B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间　　　　　D.提高复性的温度
答案　　D　
6.(2021浙江6月选考,20,2分)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入受精卵的Y染色体上,获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配,通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是(　　)
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时,不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期,须将其植入同期发情小鼠的子宫,才可获得表达EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞,通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
答案　　B　
综合
7.(2022全国乙,38,15分) 新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是　　　　　　　,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。 
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的　　　　　　　　　　　　来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是　　　　　　　。 
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体),若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明　　　　　　　　　　(答出1种情况即可);若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明　　　　　　　　　　　　　。 
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　　(1)逆转录酶　(2)特定核苷酸序列　复性　(3)曾经感染过新冠病毒但已康复　已感染新冠病毒,还未康复(或为患者)　(4)蛋白S基因的获取→构建蛋白S基因表达载体→导入受体细胞(微生物)→蛋白S基因的检测与鉴定(检测受体能否产生蛋白S)
8.(2022广东,22,12分)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。

回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对　　　　,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　,终止子的作用是　　　　　　　　　　　　。　 
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了　　　　　　　　,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于　　　　　　　,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 
答案　　(1)引物　(2)便于筛选含有目的基因的受体细胞　使转录在所需要的地方停下来　(3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质和能量　(4)废弃物的资源化　减少了碳排放
9.(2020江苏,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例):

请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种　　　　酶,它通过识别特定的　　　　　切割特定位点。 
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成　　　　;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得　　　　　　;Taq DNA聚合酶的作用是催化　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　　　(从引物①②③④中选择,填编号)。 

DNA序列(虚线处省略了
部分核苷酸序列)
已知
序列

PCR
引物
①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'
②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'
④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是　　。 
A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'
答案　　(1)限制性核酸内切(新教材为限制性内切核酸)(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
考点2　基因工程的应用与蛋白质工程
该考点中基础部分训练内容为基因工程在农牧业、医药卫生、食品工业等方面的应用以及蛋白质工程等;重难、综合部分为对转基因生物或产品的生产流程的分析,考查考生运用基因工程的相关知识分析相关事例时的理解与运用能力,以及获取信息并解决问题的能力。

基础
1.(2022苏州期末,19)人参是一种名贵药材,具有良好的滋补作用。干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①~④表示相关的操作,EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶,它们的识别序列及切割位点如表所示。下列有关叙述错误的是(多选)(　　)
限制酶
识别序列及切割位点
EcoRⅠ
↓　　
GAATTC
BamHⅠ
↓　　
GGATCC


A.过程①所需的两种引物中分别加上GAATTC和GGATCC序列,有利于后续操作
B.构建基因表达载体时,目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
C.过程③利用的是T-DNA的特性将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA中
D.过程④需控制培养基中植物激素的种类和比例,以防止愈伤组织细胞发生再分化
答案　　BC　
重难
2.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　)
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案　　D　
3.(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是(　　)
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶),则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带,相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案　　D　
4.(2021全国甲,38,15分)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是　　　　　(用数字序号表示)。 
(2)操作③中使用的酶是　　　　　　　。PCR中的每次循环可分为变性、复性、　　　三步, 其中复性的结果是　。 
(3)为了做出正确的诊断,PCR所用的引物应该能与　　　　　　　特异性结合。 
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 
答案　　(1)④②③①　(2)DNA聚合酶　延伸　引物通过碱基互补配对与单链DNA结合　(3)病原菌DNA　(4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
综合
5.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　　,物质b是　　　　　。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　 
　　　　　　　　　　。 

(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　　　　、　　　　　和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是　　　　　　　。 
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是　。 


(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路   　。 
答案　　(1)多肽链　mRNA　 mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性　(2)从基因文库中获取　人工合成　DNA半保留复制　(3)种类　酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同　 (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大
6.(2021广东,22,12分)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图),可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。

回答下列问题:
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(答出两种即可) 
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方法有　　　　　　　　　　　　　　　。(答出两种即可) 
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应制备　　　　细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有　　　　　　。 
(4)依图中所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是　　　　　　　　　　　。在分子水平上,可以通过改变　　　　,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。 
答案　　(1)从基因文库中获取、用化学方法人工合成　(2)蛋白酶水解法、盐析法、高温变性法　(3)感受态　抗原—抗体杂交　(4)部分酶失活,无法获得肌醇　基因结构
7.(2021河北,24,15分)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例如,收集植物组织器官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力,研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了相关指标。
回答下列问题:
(1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这个群体称为　　　　。 
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是　　　　　　　　。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是　。 
(3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最多的方法是　　　　　　。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采用不育株系作为实验材料的目的是　　　　　。 
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更强的　　　　(填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的　　　　进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 

图1

图2
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是　。 
相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于　　　　　　(写出两点即可)。 
答案　　(1)基因文库　(2)限制酶和DNA连接酶　鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来　(3)农杆菌转化法　防止YCF1基因随花粉扩散,给生态系统带来风险　(4)耐性　叶　(5)转基因杨树液泡膜上的Cd转运蛋白可将细胞质基质中的Cd转运至液泡贮存,降低Cd对细胞代谢的影响　乔木比草本生物量大,与外界物质交换能力强
8.[2021浙江6月选考,29(二),7分]斑马鱼是一种模式动物,体外受精发育,胚胎透明、便于观察,可用于水质监测、基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
(1)人类活动产生的生活污水日益增多,大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体　　　　　　,导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼,可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。 
(2)为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制,用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成　　　　　　　　,导入大肠杆菌菌株DH5α中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的DH5α阳性细胞克隆,质粒载体应含有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。提取质粒后,采用　　　　法,将该基因导入斑马鱼受精卵细胞中,培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。 
(3)为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选,可用　　　　　分散斑马鱼囊胚的内细胞团,取分散细胞作为初始材料进行　　　培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为　　　　　　,以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。 
答案　　(1)富营养化　(2)重组DNA分子　限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)的识别序列、抗生素抗性基因　显微注射　(3)胰蛋白酶　原代　饲养层细胞
考点3　生物技术的安全性及DNA的粗提取与鉴定
该考点中基础部分训练内容主要为DNA的粗提取与鉴定;重难、综合部分训练内容主要为对DNA的粗提取与鉴定的深入考查及对生物产品引发安全性问题的思考。
基础
1.(2022南通如皋一模,8)下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是(　　)
A.植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水破裂,释放DNA
B.在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠,混合均匀后离心取上清液
C.在含有DNA的2 mol/L的氯化钠溶液中加入蒸馏水,搅拌出现丝状物后停止加水
D.鉴定DNA时,将丝状物溶解于2 mol/L的NaCl溶液中,再加入二苯胺试剂进行沸水浴
答案　　D　
2.(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　)
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案　　A　
重难
3.(2022无锡期末,11)我国科研人员在实验室中通过构建多种酶催化体系的方法,首次实现了在细胞外从二氧化碳固定到合成淀粉的过程。下列有关叙述错误的是(　　)
A.可采用PCR技术从不同物种的基因组中扩增得到多酶催化体系中的目标酶基因
B.在多酶催化体系中,可能会因为酶的最适反应条件不同而使反应中断
C.该方法可在分子水平上直接改变氨基酸的序列,实现对酶特性的改造和优化
D.若该科研成果成熟后推广应用,有助于摆脱耕地和自然环境限制,解决粮食危机
答案　　C　
4.(2021南京、盐城一模,13)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是(　　)
A.用蒸馏水使家兔成熟的红细胞破裂,可获取富含DNA的滤液
B.植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水破裂,释放DNA
C.DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精,但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D.鉴定DNA时,应将丝状物直接加到二苯胺试剂中并进行沸水浴
答案　　C　
综合
5.(2021北京,14,2分)社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是(　　)
A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒
D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的
答案　　A　
6.(2022南通质检一,18)某科研团队运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,进行了基因编辑活动。该技术的原理是通过设计向导RNA中的识别序列,引导核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。下列有关叙述正确的是(多选)(　　)

A.向导RNA可在RNA聚合酶催化下,以核糖核苷酸为原料合成
B.向导RNA中的识别序列可与目标DNA单链特定区域进行碱基互补配对
C.Cas9蛋白的作用是破坏DNA特定位点脱氧核苷酸之间的氢键
D.该技术由于存在脱靶等风险,可能会带来一系列安全及伦理问题
答案　　ABD　
7.(2021南通如皋期末,17)为了提取棉花叶绿体DNA,研究人员的下列做法,正确的是(多选)(　　)
A.选取叶肉细胞作为提取叶绿体DNA的实验材料
B.将细胞置于蒸馏水中,可以使细胞吸水破裂释放叶绿体
C.采用差速离心法去除核物质时,转速小于获得叶绿体的转速
D.整个实验过程置于低温条件下,可以防止DNA的降解
答案　　ACD　
题型模板
模型一　限制酶的选择
典型模型
模型　限制酶选择的基本原则
模型特征:基因工程的试题往往会考查限制酶的选择,做题时要结合目的基因和质粒综合考虑选择哪些限制酶。
1.(2021辽宁,24节选,3分)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9 kb (1 kb=1 000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题:
图1为所用载体图谱示意图,图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接,在扩增的phb2基因两端分别引入　　　　和　　　　两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时,可选用　　　　　　(填 “E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 

图1
相关限制酶的识别序列及切割位点

注:箭头表示切割位点
答案　　PvuⅡ　EcoRⅠ　T4 DNA连接酶　
2.(2022浙江百校联盟联考,37节选)钙依赖蛋白激酶(CDPK)在植物的信号传导和提高植物抗性方面发挥着重要作用。科学家通过将CDPK基因导入拟南芥(双子叶植物)中,来获得具有抗性的新品种。如图为某种质粒表达载体和含CDPK基因的DNA片段示意图,图中标记了限制酶的切割位点。据此回答下列问题:


通过基因工程,将CDPK基因导入拟南芥中,获得具有抗性的新品种的育种原理是　　　　　。为了使CDPK基因插入质粒中,应选取　　　　　　(两种限制酶)分别切割质粒和含目的基因的DNA片段,不选取另两种限制酶的理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　　基因重组　SmaⅠ和XbaⅠ　Hind Ⅲ可切断目的基因(CDPK基因),EcoRⅠ可切断标记基因(卡那霉素抗性基因)
变式模型
变式　特殊情况下的限制酶选择
模型特征:在某些特殊情况下,如载体和目的基因上的限制酶不同时,可以考虑选择同尾酶(识别序列不同但切出的DNA片段具有相同的黏性末端);质粒和目的基因都能进行转录,且转录方向是确定的,在将目的基因插入质粒时,要考虑选择哪种限制酶才能使二者的转录方向一致。
3.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。


(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　,在R末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要　　　　种酶。 
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是　　　　　　　　　。 
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,理由是　 
　。 
答案　　(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上

模型二　PCR技术及应用
典型模型
模型　PCR技术
模型特征:基因工程中,PCR技术是获取和扩增目的基因的重要手段,PCR技术的条件、步骤及结果是最常见的命题落脚点。
1.(2022南通如皋中学阶段考,19)农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA上。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环,并以此环为模板,利用PCR技术扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列,以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法正确的是(多选)(　　)

A.进行PCR扩增的依据是DNA分子双链复制的原理
B.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C.利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D.通过与受体细胞的基因组序列比对,可确定T-DNA的插入位置
答案　　AD　
2.(2022山东济南十一校联考,15)为减少引物与模板之间的非特异性配对,人们在常规PCR技术的基础上进行了改良,发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增,首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15~30个循环的扩增;第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行15~30个循环的扩增,具体过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)

A.巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同,但扩增产物比常规PCR特异性更强
B.两套引物需进行两次PCR,由于和两套引物都互补的靶序列较少,因此大大提高了扩增的特异性
C.内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物,第二阶段反应能否进行,也是对第一阶段反应正确性的鉴定
D.如果第一次扩增产生了错误片断,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加
答案　　D　
变式模型
变式1　定点突变技术
模型特征:定点突变是指通过PCR等方法向目的DNA片段中引入所需变化,包括碱基的添加、删除、点突变等。常用的技术手段有重叠延伸PCR技术、大引物PCR技术等。
3.(2022江苏百校联考,18)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,经过多次PCR扩增,获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景,如图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述正确的是(多选)(　　)

A.引物中G+C的含量越高,引物与模板DNA结合的稳定性越高
B.在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对,因此两者置于不同反应系统中
C.引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后,共产生4种双链DNA分子
D.在引物1、2组成的反应系统中,经第一阶段要形成图示双链DNA,至少要经过3次复制
答案　　AB　
变式2　荧光定量PCR技术
模型特征:荧光定量PCR技术是指在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处时,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成。
4.(2022湖北应城一高一模,15)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量,其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处时,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成,过程如图所示。下列相关叙述错误的是(　　)

A.引物与探针均具特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C.若用cDNA作模板,上述技术也可检测某基因的转录水平
D.耐高温的DNA聚合酶催化DNA的合成总是从子链的3'端向5'端延伸的
答案　　D　
情境应用
简单情境
1.靶向基因敲除技术(2022南京三模,13)如图是一种靶向基因敲除技术即TALEN技术。该技术的敲除工具是由DNA识别域TALE和非特异性内切核酸酶FoKⅠ两个部分组成的蛋白质。TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系。FoKⅠ是一种形成二聚体后具有内切核酸酶活性的蛋白单体。下列相关叙述错误的是(　　)

A.单独使用FoKⅠ对基因的切割敲除具有随机性
B.TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程
C.二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对
D.TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列
答案　　C　
2.甲醇酵母菌(2022扬州中学3月月考,13)甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌,它可以高效表达外源蛋白,但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是(　　)
A.用两种酶切割目的基因和质粒,可防止目的基因反向连接和质粒的自身环化
B.常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中
C.与大肠杆菌相比,甲醇酵母作受体菌所表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近
D.与其他酵母菌相比,甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化
答案　　B　
复杂情境
3.Cre/loxP重组酶系统(2022泰州泰兴中学4月考,24)Cre/loxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接,从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。请回答下列问题:

图1

图2
(1)loxP具有方向性,结构如图1所示,其中决定方向的序列是　　　　(填序号)。 
(2)Cre酶能催化如图2所示的反应,随机识别DNA分子上同向排列的两个相同的loxP序列,并在图1的②中特定位点切断DNA双链,切口被重新连接后,保留片段　　　　,从而实现目标基因的敲除。若经Cre酶作用使得两个loxP位点间的序列发生反转,其原因可能是　　　　　　　　　　　　　。 
(3)Cre/loxP重组酶系统可以调控基因的表达,在目的基因　　　(填“上游”或“下游”)插入一个带有loxP位点的编码终止密码子的序列,在Cre酶存在的情况下,目的基因　　　(填“表达”或“不表达”)。 
(4)抗虫烟草的制备过程中,通常用　　　　法将重组质粒导入烟草细胞,导入成功后,标记基因如抗除草剂基因可用Cre/loxP重组酶系统将其　　　　　　　,其继续留在烟草体内可能会将抗除草剂基因转移到杂草中,造成基因污染。 
(5)GUS基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物,GFP基因会产生绿色荧光蛋白,配合Cre/loxP重组酶系统来研究发育生物学的问题。

图3
①构建基因表达载体时,可用　　　　　　酶将loxP序列、GUS基因及GFP基因连接,接上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区(如图3所示),这是由于　　　　基因自身无启动子而无法表达。 
②Cre基因经38 ℃热处理后可被激活表达,在此前提下组织中可检测出绿色荧光区,据此分析绿色荧光区形成的原因是　　　　　　　　　　　　　　,采用　　　　　　　　等手段可以扩大组织中绿色荧光区的面积。 
答案　　(1)②　(2)2　两个loxP序列方向相反　(3)上游　表达　(4)农杆菌转化　敲除　(5)①限制酶和DNA连接　GFP　②Cre酶能(特异性识别并)切割loxP序列,使GFP基因得以表达　延长热处理时间
4.实时荧光RT-PCR技术(2022江苏新高考基地4月联考,6)实时荧光RT-PCR技术(RT-qPCR)利用荧光标记探针对扩增产物量进行实时跟踪,再根据扩增曲线计算出起始模板量,即样本病毒载量。如图是利用RT-qPCR进行新型冠状病毒(SARS-CoV-2)载量测定的主要过程。请据图回答:

(1)过程①中,RNA提取裂解液可同时灭活病毒,原因是　　　　　　　　　　　　　　。采集到的样本要迅速进行病毒灭活处理,其目的是　　　　　　　　　　　　。RNA酶抑制剂的作用是　　　　　　　　　　　　　。 
(2)过程②中,加入的酶N是　　　　。根据图示,保证病毒核酸检测准确的关键是　　　　　　　　　　。 
(3)在进行新冠病毒核酸检测时,通常以病毒的ORF1ab基因为检测的目标基因,是因为ORF1ab基因具有　　　　　　　　　的特点。检测试剂中还加有“阳性对照”和“阴性对照”,阴性对照的主要作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(4)如表是SARS-CoV-2核酸检测时PCR仪参数设定要求:
步骤
温度
时间
循环
a.病毒cDNA合成
50 ℃
15 min
1
b.预变性
95 ℃
5 min
1
c.变性
95 ℃
5 s

d.?
60 ℃
40 s
45

①步骤a的反应时间要足够长,其目的是　　　　　　　　　　　　　　。 
②步骤d主要包括PCR过程的　　　　阶段。 
(5)临床上,将症状及影像学结果高度疑似、核酸多次检测为“阴性”的现象称为检测结果“假阴性”,导致“假阴性”结果可能是由于　　　(填序号) 
①检测者处于感染初期　②检测者感染时间较长　③样本采集位置不规范　④样品稀释度不足　⑤病毒出现变异
答案　　(1)蛋白酶K能催化病毒蛋白质水解　提高样本转运和检测阶段的安全性　防止样本RNA水解,影响检测结果的准确性　(2)逆转录酶　设计引物和探针的特异性　(3)特异性强、基因结构相对稳定(变异小)　排除因检测过程、试剂等因素引起的假阳性　(4)①保证样本中病毒RNA均能逆转录形成cDNA　②退火(或复性)、延伸　(5)①②③⑤
审题解题
1.(2022山东淄博一模,5)为确定W基因在染色体上的位置,研究人员进行了如下操作:①破裂细胞后将染色体固定在玻片上,去除mRNA及染色体上的蛋白质,拍摄染色体得到显微照片1。②制备32P标记的W基因探针(单链DNA)。③将玻片上的染色体DNA变性为单链后,置于含W基因放射性探针的杂交溶液中温育一段时间。④洗脱玻片上未杂交的放射性探针,对玻片进行放射性自显影处理得到照片2。⑤将照片1和照片2叠加,确定W基因的所在染色体及其位置。下列分析错误的是(　　)
A.可用A—32P~P~P制备W基因的放射性探针
B.W基因探针的碱基序列与W基因中某条单链的部分碱基序列相同或互补
C.去除染色体上的蛋白质并将DNA变性为单链有利于DNA与探针完成杂交
D.去除mRNA可以防止W基因的mRNA与探针杂交,对实验结果产生干扰
补充设问
设问① 染色体上为什么会有RNA和蛋白质?如何去除?去除RNA有何意义?
设问② A—32P~P~P去掉两个磷酸基团后剩下的结构可以合成DNA吗?为什么?
答案　　A　
补充设问答案 设问① 染色体(质)上的DNA可能正结合RNA聚合酶进行RNA的转录,染色体主要由DNA和蛋白质构成;可用RNA酶和蛋白酶去除RNA和蛋白质;去除mRNA可以防止W基因的mRNA与探针杂交,去除蛋白质后,有利于DNA与探针碱基互补配对。
设问② 不可以。A—32P~P~P去掉两个磷酸基团后剩下的结构为AMP,是构成RNA的基本单位之一。
2.(2022山东烟台一模,25)2020年8月16日,由我国军事医学研究院陈薇院士团队及康希诺生物联合申报的腺病毒载体新冠疫苗被授予专利权,是我国首个新冠疫苗专利。全面接种新冠疫苗,建立免疫屏障,可有效防止新冠病毒大规模传染。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,通过其表面的S蛋白与宿主细胞膜表面ACE2受体结合而完成感染。研制疫苗时,通过RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)获取S蛋白基因所需要的酶是　　　　　　　　。据图1分析,选择的引物是　　　　,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 

图1

图2
(2)PCR的产物一般通过电泳来鉴定,结果如图2所示。1号泳道为标准(Marker),2号泳道为阳性对照(提纯的S蛋白基因片段),3号泳道为实验组。标准(Marker)的实质为　　　　　　　　　　　　　　　　,3号泳道的杂带出现的原因一般有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(至少答出两点)。 
(3)腺病毒是一种DNA病毒,基因组中的E1区蛋白与腺病毒的复制有关,对宿主细胞的毒性很强。科研中将去除E1基因构建的复制缺陷型腺病毒作为运载S蛋白基因的载体,经过改造后的腺病毒应该具备的特点有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(至少答出两点)。试说明科研中选用复制缺陷型腺病毒作载体制备新冠疫苗的原因是　 
 
　。 
补充设问
设问① 如何判断DNA单链的5'端和3'端?引物只能结合在DNA单链的哪一端?
设问② 电泳鉴定DNA时,如果不止一条条带,分析原因时常从哪几个方面分析?

答题技巧　设问③ 腺病毒基因组中的E1基因去除后的病毒称为什么病毒?该腺病毒还能复制吗?用去除E1基因的腺病毒作为载体制备DNA疫苗在安全性方面有何优势?
答案　　(1)逆转录酶、Taq酶　Ⅱ、Ⅲ　使Taq酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　(2)不同已知长度的DNA片段混合物　模板受到污染;引物的特异性不强;复性温度偏低　(3)能够侵染宿主细胞;具有多个限制酶酶切位点;不能复制　避免人体因重组腺病毒增殖而感染,进而提高疫苗的安全性。
解析　
补充设问答案 设问① “—”端为DNA单链的5'端,“—OH”端为DNA单链的3'端。引物只能结合在DNA单链的3'端。
设问② 模板不唯一,可能掺入了其他DNA分子;引物设计不合理,它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体;复性温度过低,复性的温度取决于引物的长度、碱基组成等;DNA聚合酶的质量不好等。
设问③ 复制缺陷型腺病毒。不能复制。可以避免腺病毒增殖,提高疫苗的安全性。