2023届高考生物二轮复习基因工程与蛋白质工程作业含答案

这是一份2023届高考生物二轮复习基因工程与蛋白质工程作业含答案，共33页。
专题28　基因工程与蛋白质工程
A组
简单情境
1.肿瘤细胞耐药性机制(2022广州二模,22节选)肿瘤已成为严重危害人类健康的高发病,主要的治疗手段有化疗、放疗和手术等,而肿瘤细胞对肿瘤药物产生耐药性是化疗失败的主要原因之一,研究表明肿瘤细胞耐药性的产生与过量表达的跨膜转运蛋白BCRP有关,研究人员尝试建立稳定表达BCRP的细胞系。回答下列问题:
(1)研究人员从人的　　　　　　　(填“普通体细胞”或“癌细胞”)中提取出总RNA,逆转录后进行PCR扩增获得大量BCRP基因。 
(2)随后构建BCRP基因的真核表达载体,研究人员选择了P质粒作为载体,因为其具有①能被真核细胞识别的启动子,作用是　　　　　　　　　　　　　　;②抗新霉素的标记基因;③多个限制酶切割位点,作用是　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)在不破坏表达载体各功能序列的基础上,对上述环状载体进行酶切得到线性化载体,随后将其导入受体细胞,线性化载体可整合到染色体DNA上。联系所学知识推测进行酶切得到线性化载体的原因是  　。 
答案　(1)癌细胞　(2)①RNA聚合酶识别和结合的位点　③便于插入外源基因　(3)与环状载体相比,线性化载体能更稳定地存在并发挥功能
解析　(1)分析题意可知,肿瘤细胞耐药性的产生与过量表达的跨膜转运蛋白BCRP有关,故为获取BCRP基因,需要从癌细胞中提取出总RNA,逆转录后进行PCR扩增。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,用于驱动基因的转录过程;载体中有多个限制酶切割位点的作用是便于插入外源基因。(3)与环状载体相比,线性化载体能更稳定地存在并发挥功能,故需要酶切得到线性化载体。
复杂情境
2.逆转录-荧光PCR技术(2022广东二模,22改编)如图所示为RT-PCR(逆转录-荧光PCR技术)的原理:PCR过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有荧光基团和淬灭基团(抑制荧光发出),当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。

请回答下列问题:
(1)PCR技术的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　。RT-PCR过程中,需先将RNA逆转录成cDNA,故装置中需添加的酶有　　　　　　　　　。 
(2)对新冠病毒进行检测时,探针的设计依据是　　　　　　　　　　　　。探针与模板结合发生在PCR循环中的　　　　(选填“变性”“复性”或“延伸”)阶段。 
(3)若监测系统检测到荧光信号,则可判定该检测样本为阳性,其原理是   　。 
(4)为了在没有核酸检测的条件下及早发现新冠病毒,我国于2022年3月11日推出新冠病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施,该试剂盒的检测原理是　　　　　。 
答案　(1)大量扩增目的基因片段,用于检测　逆转录酶　(2)一段已知目的基因的核苷酸序列　复性　(3)样本中的新冠病毒核酸会被探针识别,从而进行快速复制,导致监测系统检测到荧光信号　(4)抗原与抗体的特异性结合
解析　(1)PCR技术的目的是大量扩增目的基因片段,用于基因工程或检测。以RNA为模板逆转录成cDNA,是逆转录过程,需要用到逆转录酶。(2)探针是可以与模板结合的一小段DNA序列,故设计的依据是一段已知目的基因的核苷酸序列,变性过程是DNA双链打开的过程,复性时,引物与探针结合到模板DNA上。(3)根据题意,当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。因此,样本中有新冠病毒核酸时,能进行快速复制,导致监测系统检测到荧光信号。(4)新冠病毒抗原检测试剂盒的检测原理是抗原与抗体的特异性结合。
复杂陌生情境
3.基因编辑技术(2022韶关二模,22)我国科学家黄三文团队通过基因编辑技术培育出二倍体自交系和杂交优势显著的杂交马铃薯品系“优薯1号”,突破了百年来马铃薯自交不亲和,薯块只能无性繁殖的难题。如图是科学家用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因的示意图。

(1)据图分析CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA引导Cas9蛋白到　　　　　　　　　进行切割。已知CRISPR/Cas9仅存在于原核生物中,故需借助　　　　技术才能在马铃薯细胞中发挥作用。Cas9蛋白和向导RNA结合形成的复合物能切割DNA,从功能上来看该复合物相当于基因工程中的限制酶,CRISPR/Cas9打破了限制酶　　　　　　　　　　　　　　的局限性。所以在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时,应使用　　　　(填“相同”或“不同”)的向导RNA。 
(2)敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因后可让该植株自交观察是否产生种子来检测其作用效果,这属于　　　　　　　水平的鉴定。 
(3)基因编辑技术比传统的基因工程技术更准确,目的性更强。通过上述材料,推测利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行基因敲除的应用价值可能有　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　(答出一点即可)。 
答案　(1)一个特定的基因位点　转基因　只能识别一种特定的核苷酸序列　不同　(2)个体生物学　(3)进行基因治疗、研究基因功能、构建疾病治疗动物模型等
解析　(1)据题意可知,向导RNA是一条单链RNA,主要功能是与目标DNA(目的基因)上特定碱基序列互补配对,从而定向引导Cas9蛋白与一个特定的基因位点进行结合,并在该位点切割DNA。因为CRISPR/Cas9仅存在于原核生物中,而马铃薯属于真核生物,故需借助转基因技术才能实现基因在不同生物间的转移和表达。Cas9和向导RNA结合形成的复合物具有类似限制酶的作用,但限制酶在发挥作用时只能识别一种特定的核苷酸序列,而CRISPR/Cas9则打破了这一局限性。CRISPR/Cas9系统具有定向切除DNA片段的作用,因此对不同基因进行编辑时,应使用不同的向导RNA,与相应的目标DNA进行配对,完成定点切除。(2)敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因后可让该植株自交观察是否产生种子来检测其作用效果,这属于个体生物学水平的鉴定。(3)与传统的基因工程相比较,运用CRISPR/Ca9基因编辑技术培育转基因生物,可以更准确地进行目的基因的敲除,且明显避免了目的基因随机插入受体细胞DNA引发的生物安全性问题,因此该技术有望应用在基因治疗、研究基因功能、构建疾病治疗动物模型等方面。
4.基因敲除和基因沉默(2022佛山二模,22)心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命唯一有效的手段,然而心脏移植过程中会发生缺血再灌注损伤(IRI),可能导致心脏坏死。研究发现,IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达,导致细胞凋亡坏死,最终引起器官损伤。根据Caspase8基因合成的小干扰RNA(siRNA)可以使Caspase8基因沉默,有效抑制IRI所致的器官损伤。图是利用猪的心肌细胞开展siRNA作用研究的示意图。

回答下列问题:
(1)图中步骤②构建重组质粒需要使用　　　　　　　　　　等工具酶。与直接将siRNA导入猪的心肌细胞相比,通过重组质粒将siRNA对应的DNA序列导入心肌细胞,其优点是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出一点)。 
(2)siRNA对应DNA序列在心肌细胞中表达产生的siRNA,与RISC组装形成基因沉默复合物,通过抑制基因表达的　　　　过程,使Caspase8基因沉默,从而降低IRI引起的细胞凋亡。 
(3)研究人员根据Caspase8基因的碱基序列,设计了三种序列分别导入猪的心肌细胞,通过测定靶基因Caspase8的mRNA含量来确定最优序列。测定mRNA含量时,需提取心肌细胞的总RNA,经过　　　　过程得到cDNA,再进行PCR扩增,测定PCR产物量,结果如图所示。据此判断最优序列是　　　　。 

(4)选用猪的心肌细胞作受体细胞是因为猪在基因、解剖结构、生理生化和免疫反应等方面与人类极为相似。为了解决心脏移植供体短缺问题,许多科学家正在研究用猪心脏代替人的心脏。你认为将猪心脏移植到人体面临的最大挑战是　　　　　　　　　,请说出一种解决这一问题的思路:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)限制酶、DNA连接酶　可持续产生siRNA,使靶基因长时间沉默(或:可以使质粒只在特定的组织中表达;或:可构建某基因永久沉默的实验动物模型)　(2)翻译　(3)逆转录　序列2　(4)免疫排斥反应　可以利用基因工程技术将猪与免疫排斥有关的抗原基因敲除;转入一些人类特有蛋白的基因,将猪细胞伪装成人的细胞
解析　(1)限制酶、DNA连接酶是构建重组质粒需要的工具酶。与直接将siRNA导入猪的心肌细胞相比,通过重组质粒将siRNA对应的DNA序列导入心肌细胞,siRNA可随重组质粒增殖而持续产生,从而使靶基因长时间沉默。(2)据图可知,基因沉默复合物作用于Caspase8 mRNA,抑制了基因表达的翻译过程,使Caspase8基因沉默。(3)测定mRNA含量时,需提取细胞总RNA,经过逆转录过程得到cDNA,再进行PCR扩增,通过PCR产物的量间接反映细胞中相关基因的mRNA含量。根据图示可知,在序列2作用下,Caspase8的mRNA含量最低,表明其抑制效果最好,是最优序列。(4)免疫排斥反应是将猪心脏移植到人体面临的最大挑战。利用基因工程技术将猪与免疫排斥有关的抗原基因敲除,或转入一些人类特有蛋白的基因,将猪细胞伪装成人的细胞等可能解决这一问题。
B组
简单情境
1.细菌的防御机制(2022辽宁鞍山二模,15)(不定项)CRISPR/Cas9是近年来生物学科研的热门技术,该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示,当细菌感知到噬菌体侵入时,会通过gRNA识别噬菌体DNA,并通过Cas9蛋白切断目标DNA,从而起到防御作用。下列关于该机制的叙述错误的是(　　)

A.噬菌体DNA的变化体现了基因突变的不定向性
B.gRNA与目标DNA结合片段中最多含有5种核苷酸
C.Cas9蛋白可破坏DNA分子的磷酸二酯键
D.高倍光学显微镜可观察到该现象
答案　ABD　噬菌体DNA被细菌gRNA识别并被Cas9蛋白切割属于特定位点的切割,不是基因突变,不能体现基因突变的不定向性,A错误;gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核苷酸,B错误;Cas9蛋白可切断目标DNA,该过程破坏的是DNA分子的磷酸二酯键,C正确;该现象属于分子水平的改变,光学显微镜下无法观察到,D错误。
2.引物设计与定点诱变(2022山东济宁二模,14)通过引物设计,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变,如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是(　　)

A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的3'端
B.PCR体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、ATP
C.第2轮PCR中,引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4
答案　D　DNA子链的延伸方向为5'→3',据此可知,图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5'端,A错误;PCR体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和缓冲溶液等,但不需要加入ATP,B错误;第3轮PCR中,引物1与图中②结合形成两条链等长的突变基因,C错误;在第3轮PCR结束后,会产生23=8(个)DNA分子,其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有两个,因此含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4,D正确。
复杂情境
3.实时荧光RT-PCR(2022福建模拟预测,15)实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其原理是:在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团,新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(　　)

A.做RT-PCR之前,需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B.RNA不能作为PCR扩增的模板,故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C.若有强烈荧光信号发出,说明被检测者没有感染病毒
D.病毒的检测还可以检测病毒的蛋白类物质或病毒引发产生的抗体,其原理都是抗原—抗体杂交
答案　C　RT-PCR需要根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针,且引物、探针要与待测样本cDNA混合,A正确;PCR扩增必须以DNA为模板,RNA不能作为PCR扩增的模板,所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增,B正确;若有强烈荧光信号发出,说明被检测者极有可能感染了病毒,C错误;RNA病毒的检测方法还有特异性抗原蛋白检测(可检测病毒表面的一种蛋白)和特异性抗体检测(检测感染者体内通过免疫反应产生的某种抗体),其原理均为抗原—抗体杂交,D正确。
复杂陌生情境
4.基因打靶(2022湖南师大附中一模,22)1985年,科学家利用同源重组将一段外源质粒插入人类染色体DNA β-珠蛋白位点,首次在哺乳动物中进行基因打靶并获得成功。目前,在胚胎干细胞中进行同源重组已经成为遗传修饰小鼠染色体组基因位点的常规技术。通过对这些基因敲除小鼠的表型分析,新发现了许多与人类疾病相关的基因。基因打靶的操作如图,在目的基因序列的第一个外显子中插入neor基因(新霉素抗性基因),同时目的基因序列的两端加HSV-tk基因(该基因的表达产物能将DHPG转化为有毒物质而使细胞死亡)构建基因敲除载体;将基因敲除载体导入ES细胞,在ES细胞中基因敲除载体可以和染色体上目的基因所在区段发生同源重组,再通过添加新霉素和DHPG的培养基筛选,即可得到打靶成功的ES细胞。

(1)构建基因敲除载体时,需用　　　　酶对目的基因、neor基因和HSV-tk基因进行处理。 
(2)ES细胞在功能上具有的特征是　　　　　　　,常用　　　　技术将基因敲除载体导入ES细胞。 
(3)根据题图信息分析,通过同源重组插入染色体组基因中的neor基因的作用是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(写出两点)。 
(4)将基因敲除载体导入ES细胞后,除了发生同源重组外,还会发生非同源重组,而非同源重组会将neor基因和HSV-tk基因同时插入染色体组基因中,据此分析,用加入新霉素和DHPG的培养基将同源重组细胞筛选出来的机理是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)限制酶和DNA连接　(2)发育的全能性　显微注射　(3)修饰小鼠染色体组中特定的基因,将成功发生同源重组的ES细胞筛选出来　(4)只有成功发生重组的ES细胞才会含有neor基因,所以加入新霉素的培养基可以将发生同源重组和非同源重组的ES细胞筛选出来;同时,发生同源重组的ES细胞由于不含HSV-tk基因,不会将DHPG转化为有毒物质,从而在含有DHPG的培养基中生存下来;而发生非同源重组的ES细胞,由于含有HSV-tk基因,会将DHPG转化为有毒物质,从而无法在含DHPG的培养基中生存
解析　(1)构建基因敲除载体时需要用限制酶处理后形成相同末端,再用DNA连接酶将片段连接起来。(2)ES细胞为胚胎干细胞,具有发育的全能性。基因工程中动物细胞作为受体细胞时,常采用显微注射技术将目的基因导入受体细胞。(3)由题干信息和图示可知,通过同源重组将neor基因插入染色体组目的基因序列的第一个外显子中,对染色体组基因进行了修饰,同时,该基因是新霉素抗性基因,可以将成功发生同源重组的ES细胞筛选出来。(4)只有成功发生重组的ES细胞才会含有neor基因,所以加入新霉素的培养基可以将发生同源重组和非同源重组的ES细胞筛选出来;同时,发生同源重组的ES细胞由于不含HSV-tk基因,不会将DHPG转化为有毒物质,从而在含有DHPG的培养基中生存下来,而发生非同源重组的ES细胞,由于含有HSV-tk基因,会将DHPG转化为有毒物质,从而无法在含DHPG的培养基中生存。
知识拓展　基因敲除技术是用外源片段整合到活体细胞DNA的同源序列中,使某个基因被取代或被破坏而失活,是在DNA水平对细胞遗传信息进行改造的技术。基因敲除技术可使细胞的基因定点改变的原理是基因重组,其可使某个基因被取代或被破坏而失活,故将来有可能用于癌症的治疗。
C组
简单情境
1.靶向基因敲除技术(2022南京三模,13)如图是一种靶向基因敲除技术即TALEN技术。该技术的敲除工具是由DNA识别域TALE和非特异性内切核酸酶FoKⅠ两个部分组成的蛋白质。TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系。FoKⅠ是一种形成二聚体后具有内切核酸酶活性的蛋白单体。下列相关叙述错误的是(　　)

A.单独使用FoKⅠ对基因的切割敲除具有随机性
B.TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程
C.二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对
D.TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列
答案　C　根据题干信息分析,FoKⅠ是一种非特异性内切核酸酶,若单独使用FoKⅠ对基因的切割敲除具有随机性,A正确;分析题图可以看出TALE蛋白左右臂中间有FoKⅠ结合的部位,因此完整的TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程,B正确;根据题干信息分析,TALE的二连氨基酸与四种碱基有恒定的对应关系,但不能说二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对,C错误;由于TALE的二连氨基酸与四种碱基有恒定的对应关系,因此TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计可依据靶基因碱基序列,D正确。
2.甲醇酵母菌(2022扬州中学3月月考,13)甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌,它可以高效表达外源蛋白,但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是(　　)
A.用两种酶切割目的基因和质粒,可防止目的基因反向连接和质粒的自身环化
B.常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中
C.与大肠杆菌相比,甲醇酵母作受体菌所表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近
D.与其他酵母菌相比,甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化
答案　B　用两种酶切割目的基因和质粒,可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化,A正确;常用制备感受态细胞的方法,将目的基因导入微生物细胞,B错误;与大肠杆菌作受体相比,甲醇酵母为真核生物,其表达出的胶原蛋白可经过内质网和高尔基体的加工,与人体产生的胶原蛋白结构更相近,C正确;与其他酵母菌相比,甲醇酵母可以高效表达外源蛋白,但自身蛋白分泌到培养基的较少,便于目的蛋白的分离与纯化,D正确。
复杂情境
3.Cre/loxP重组酶系统(2022泰州泰兴中学4月考,24)Cre/loxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接,从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。请回答下列问题:

图1

图2
(1)loxP具有方向性,结构如图1所示,其中决定方向的序列是　　　　(填序号)。 
(2)Cre酶能催化如图2所示的反应,随机识别DNA分子上同向排列的两个相同的loxP序列,并在图1的②中特定位点切断DNA双链,切口被重新连接后,保留片段　　　　,从而实现目标基因的敲除。若经Cre酶作用使得两个loxP位点间的序列发生反转,其原因可能是　　　　　　　　　　　　　。 
(3)Cre/loxP重组酶系统可以调控基因的表达,在目的基因　　　(填“上游”或“下游”)插入一个带有loxP位点的编码终止密码子的序列,在Cre酶存在的情况下,目的基因　　　(填“表达”或“不表达”)。 
(4)抗虫烟草的制备过程中,通常用　　　　法将重组质粒导入烟草细胞,导入成功后,标记基因如抗除草剂基因可用Cre/loxP重组酶系统将其　　　　　　　,其继续留在烟草体内可能会将抗除草剂基因转移到杂草中,造成基因污染。 
(5)GUS基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物,GFP基因会产生绿色荧光蛋白,配合Cre/loxP重组酶系统来研究发育生物学的问题。

图3
①构建基因表达载体时,可用　　　　　　酶将loxP序列、GUS基因及GFP基因连接,接上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区(如图3所示),这是由于　　　　基因自身无启动子而无法表达。 
②Cre基因经38 ℃热处理后可被激活表达,在此前提下组织中可检测出绿色荧光区,据此分析绿色荧光区形成的原因是　　　　　　　　　　　　　　,采用　　　　　　　　等手段可以扩大组织中绿色荧光区的面积。 
答案　(1)②　(2)2　两个loxP序列方向相反　(3)上游　表达　(4)农杆菌转化　敲除　(5)①限制酶和DNA连接　GFP　②Cre酶能(特异性识别并)切割loxP序列,使GFP基因得以表达　延长热处理时间
解析　(1)由图1可知,决定方向的是序列②。(2)Cre酶识别两个相同的loxP序列,从而实现对目标基因的敲除,片段1自身环化且带有待敲除基因,因此应保留片段2。若两个loxP位点间的序列发生反转,则可能是两个loxP序列方向相反。(3)Cre/loxP重组酶系统可以调控基因的表达,在目的基因上游插入带有loxP位点的编码终止密码子的序列,Cre酶会切开loxP位点,使编码终止密码子的序列不发挥作用,因此目的基因表达。(4)将目的基因导入植物细胞通常采用农杆菌转化法,导入成功后,可用Cre/loxP重组酶系统将抗除草剂基因敲除,其继续留在烟草体内可能会转移到杂草中,造成基因污染。(5)①构建基因表达载体时,可用限制酶和DNA连接酶处理相关基因,使loxP序列、GUS基因及GFP基因连接,接上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区,是因为GFP基因自身无启动子不能表达。②Cre基因经过热处理后被激活表达,Cre酶切割了loxP序列,使GFP基因得以表达,最终出现绿色荧光区,延长热处理的时间使Cre基因充分表达,可以扩大绿色荧光区面积。
4.实时荧光RT-PCR技术(2022江苏新高考基地4月联考,6)实时荧光RT-PCR技术(RT-qPCR)利用荧光标记探针对扩增产物量进行实时跟踪,再根据扩增曲线计算出起始模板量,即样本病毒载量。如图是利用RT-qPCR进行新型冠状病毒(SARS-CoV-2)载量测定的主要过程。请据图回答:

(1)过程①中,RNA提取裂解液可同时灭活病毒,原因是　　　　　　　　　　　　　　。采集到的样本要迅速进行病毒灭活处理,其目的是　　　　　　　　　　　　。RNA酶抑制剂的作用是　　　　　　　　　　　　　。 
(2)过程②中,加入的酶N是　　　　。根据图示,保证病毒核酸检测准确的关键是　　　　　　　　　　。 
(3)在进行新冠病毒核酸检测时,通常以病毒的ORF1ab基因为检测的目标基因,是因为ORF1ab基因具有　　　　　　　　　的特点。检测试剂中还加有“阳性对照”和“阴性对照”,阴性对照的主要作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(4)如表是SARS-CoV-2核酸检测时PCR仪参数设定要求:
步骤
温度
时间
循环
a.病毒cDNA合成
50 ℃
15 min
1
b.预变性
95 ℃
5 min
1
c.变性
95 ℃
5 s

d.?
60 ℃
40 s
45

①步骤a的反应时间要足够长,其目的是　　　　　　　　　　　　　　。 
②步骤d主要包括PCR过程的　　　　阶段。 
(5)临床上,将症状及影像学结果高度疑似、核酸多次检测为“阴性”的现象称为检测结果“假阴性”,导致“假阴性”结果可能是由于　　　(填序号) 
①检测者处于感染初期　②检测者感染时间较长　③样本采集位置不规范　④样品稀释度不足　⑤病毒出现变异
答案　(1)蛋白酶K能催化病毒蛋白质水解　提高样本转运和检测阶段的安全性　防止样本RNA水解,影响检测结果的准确性　(2)逆转录酶　设计引物和探针的特异性　(3)特异性强、基因结构相对稳定(变异小)　排除因检测过程、试剂等因素引起的假阳性　(4)①保证样本中病毒RNA均能逆转录形成cDNA　②退火(或复性)、延伸　(5)①②③⑤
解析　(1)分析题图,过程①中,RNA提取裂解液含有的蛋白酶K可水解病毒蛋白质,起到灭活病毒的作用。采样后迅速进行病毒灭活,可以防止样本在运输和检测阶段造成病毒泄漏,以提高样本转运和检测阶段的安全性。RNA酶能催化RNA水解,RNA提取裂解液中的RNA酶抑制剂可以防止病毒RNA被水解,进而影响检测结果的准确性。(2)过程②为逆转录,需要逆转录酶催化,说明加入的酶N是逆转录酶。采用实时荧光PCR技术检测病毒核酸,其关键是设计新冠病毒基因的特异性引物和依据检测的基因内部特异序列设计特异性探针。(3)在进行新冠病毒核酸检测时,选择检测的目标基因应具有特异性强、基因结构相对稳定(变异小)的特点。设置“阴性对照”的目的是排除因检测过程、检测试剂等因素引起的假阳性。(4)①表格中步骤a为逆转录,该步骤反应时间要足够长,其目的是使病毒RNA均能逆转录形成cDNA。②步骤d是实时荧光PCR中变性后的两个步骤:退火(或称复性)和延伸。(5)检测者处于感染初期,其样本中病毒载量少,由于检测的灵敏度限制,可能使检测结果出现假阴性,①符合题意;检测者感染时间较长,由于自身免疫,可能使样本中病毒载量很低,进而导致检测结果出现假阴性,②符合题意;样本采集位置不规范、样品稀释度过高等可造成样品中病毒载量低,进而导致检测结果出现假阴性,③符合题意,④与题意不符;若病毒发生了变异,可能会使试剂中引物不能跟模板结合,不能获得PCR产物,也会使检测结果出现假阴性,⑤符合题意。
D组
复杂情境
1.剔除标记基因(2022济宁二模,20)(不定项)如图是基因工程育种过程中剔除转基因植物标记基因的一种策略,下列叙述正确的是(　　)

A.图中的两个质粒,都带有T-DNA序列
B.该方法可以将标记基因和目的基因转移到同源染色体上
C.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
D.除去转化植株的标记基因必须经过有性繁殖阶段的基因重组
答案　ABD　图中的两个质粒,均为农杆菌的Ti质粒,都带有T-DNA序列,A正确;T-DNA序列可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体上,对Ti质粒进行改造,可以将标记基因和目的基因转移到同源染色体上,B正确;经过杂交过程,获得了无筛选标记的转基因植株,该过程中发生了基因重组(非同源染色体的自由组合),C错误;结合图示可知,经过有性繁殖阶段的基因重组除去了转化植株的标记基因,D正确。
知识归纳　农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞的染色体DNA上。将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上,可通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞,并将其插入植物细胞的染色体DNA上。
2.用引物检测个体的基因组成(2022泰安二模,15)用农杆菌侵染水稻(二倍体)细胞,获得1条染色体上R基因被插入T-DNA的个体T0。T-DNA插入基因的位置如图1所示。T0自交得T1,同时用P1、P2、P3为引物检测T1个体的基因组成情况,如图2所示。(图1箭头方向为引物所在子链的延伸方向;R基因被T-DNA插入后,用P1、P2为引物无法完成PCR)。下列说法错误的是(　　)

图1

图2
A.该实验中所用的P1、P2、P3三种引物均为单链DNA
B.R基因被T-DNA插入后可能会导致基因无法表达相应蛋白
C.用P1、P2引物进行PCR得到产物的个体均为R基因纯合子
D.W、H、M个体的比例不为1∶2∶1,可能是因为调查的样本数量较小
答案　C　引物一般为单链DNA分子,A正确;R基因被T-DNA插入后,R基因被破坏,所以可能无法表达相应蛋白,B正确;R基因被T-DNA插入后,用P1、P2为引物无法完成PCR,用P1、P2引物进行PCR得到产物的个体不可能是R基因纯合子,C错误;T0为杂合子,自交后代W、H、M个体的比例理论上为1∶2∶1,图中W、H、M个体的比例不为1∶2∶1,可能是因为调查的样本数量较小,误差较大所致,D正确。
3.多基因表达载体(2022济宁二模,6)OsGLOl、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接,构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示),利用农杆菌转化法转化棉花,在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径,提高了棉花的产量。下列叙述正确的是(　　)

A.四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译
B.OsGLOl、EcCAT基因转录时以DNA的同一条单链为模板
C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞
D.可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达情况
答案　D　利用农杆菌转化法转化棉花,可使目的基因插入棉花细胞的染色体DNA上,所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因,在棉花细胞核内进行转录,在核糖体上进行翻译,之后在叶绿体转运肽的引导下进入叶绿体,A错误;在同一个T-DNA中OsGLOl基因和EcCAT基因的启动子启动转录的方向不同,因此OsGLOl、EcCAT基因转录时不是以DNA的同一条单链为模板的,B错误;只有Ti质粒的T-DNA能转移到受体细胞的染色体DNA上,卡那霉素抗性基因不在T-DNA中,而潮霉素抗性基因在T-DNA中,应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞,C错误;可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达量情况,D正确。
名师点睛　RNA聚合酶只能从启动子部位与基因结合,且只与基因(DNA)的3'端结合,因此转录形成mRNA时只能由5'端向3'端延伸,且mRNA的延伸方向与模板链的方向相反。
复杂陌生情境
4.亚洲棉光籽性状遗传机制(2022济宁二模,25)亚洲棉的光籽(突变体无短绒)和毛籽(野生型有短绒)是一对相对性状,中国农业科学院棉花研究所对亚洲棉光籽性状遗传机制进行了研究,发现突变体光籽表型的出现与8号染色体上DNA片段发生突变有关,研究者提取突变体和野生型的8号染色体的DNA进行PCR,产物扩增后电泳结果如图:

(1)据图分析,该PCR过程是根据野生型毛籽棉的　　　　　　　　　　　　　DNA序列设计连续的重叠引物对。电泳结果表明相对分子质量较大的扩增产物与点样处的距离较　　　(选填“大”或“小”),并推测8号染色体上第　　　　对引物对应的区间(简称M)发生了碱基的　　　　(选填“增添”“缺失”或“替换”)是突变体光籽出现的根本原因。 
(2)研究者从野生型和突变体中克隆出区间M后,运用基因工程技术分别导入棉花原生质体,检测其下游报告基因的基因表达水平,进而推测区间M的作用,结果如图。

内参基因REN是为了排除转化效率不同对实验结果的干扰,因此图中LUC表达量/REN表达量可用来衡量报告基因的表达水平。实验结果说明:　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)研究者发现基因GaFZ的表达会影响毛籽棉花短绒的发育,而且突变体GaFZ蛋白结构与野生型一致。综合上述研究推测突变体光籽表型出现的可能原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)8号染色体的880 kb至903 kb区间　小　6　增添　(2)区间M促进下游报告基因的表达,且其作用的发挥与区间M的长度(或M的类型)和方向有关　(3)突变体区间M突变后,促进了GaFZ基因的表达,进而抑制了棉花短绒的发育,导致出现了光籽性状
解析　(1)据图分析,该PCR过程设计了8组连续的重叠引物对,这些引物扩增的片段都在野生型毛籽棉的880 kb至903 kb区间。电泳结果表明相对分子质量较大的扩增产物会更靠近点样处,与点样处的距离较小。观察电泳结果,8号染色体上的第6对引物扩增出来的片段不同,突变体比野生型更靠近点样处,说明突变体这个片段比野生型的相对分子质量大,应该是发生了碱基对的增添。(2)根据柱形图可知,空载体、野生型和突变体的LUC表达量/REN表达量不同,说明LUC表达量/REN表达量可以用来衡量M的表达水平。区间M的长度和方向不同,LUC表达量/REN表达量值不同,说明M可以促进下游基因的表达,其作用的发挥与区间M的长度和方向有关。(3)“基因GaFZ的表达会影响毛籽棉花短绒的发育,而且突变体GaFZ蛋白结构与野生型一致”,说明基因GaFZ可能不在区间M上,突变体区间M突变后,促进了下游基因,如GaFZ基因的表达,进而影响了棉花短绒的发育,导致出现了光籽性状。
5.同源重组基因敲除技术(2022德州二模,25)同源重组基因敲除技术是将同源DNA片段导入受体细胞,利用同源DNA片段的互换,用其他DNA片段在原有位置替代靶基因,从而实现基因的敲除。米曲霉产生的曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆能力,具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力,科研人员用同源重组基因敲除技术成功敲除了米曲霉3.042菌株中的msn2基因,获得高产的g-5菌株。其部分机理如图所示。

(1)据图分析,欲实现msn2基因的敲除,需要在pyrG基因两侧分别插入　　　　　　　　片段,该过程中需要的工具酶有　　　　　　　　。 
(2)科研人员选取进行基因敲除操作后的3个菌落,分别提取其DNA,利用引物　　　　进行PCR扩增,电泳结果如图所示。根据1号菌落电泳结果可得出的结论是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。为进一步验证3号菌落为目的菌落,需要选择引物　　　　　　重复上述操作,最终电泳结果应出现1条长度为　　　　bp的条带。 

(3)米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关,tpsI基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。研究发现g-5菌落tpsI基因表达量明显降低。据此推测msn2基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的机理是　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)msn2L、msn2R　限制酶、DNA连接酶　(2)A和B　1号菌落没有实现基因敲除,含有米曲霉3.042基因组原始序列　C和D　2 602　(3)msn2基因表达产物的缺乏,抑制了tpsI基因的表达,提高了米曲霉对逆境的敏感性,从而导致米曲霉产生更多的曲酸
解析　(1)从题图中可以看出在msn2两侧存在msn2L和msn2R基因,所以欲实现msn2基因的敲除,需要在pyrG基因两侧分别插入msn2L和msn2R片段,在这个过程中,需要用限制酶将基因切割,再用DNA连接酶将三个基因片段连接起来。(2)从图中可以看出,引物C和引物D都不能将g-5基因组扩增完,所以为进行PCR扩增,需要选择引物A和B;1号菌落条带长度接近3 000 bp,米曲霉3.042基因组的碱基对数为1 032+1 024+909=2 965 bp,两者较为接近,所以推测1号菌落没有实现基因敲除;3号菌落条带长度约为3 700 bp,引物C和D可以扩增msn2L和pyrG,所以可以选择引物C和D重新扩增并电泳,从图中可以看出,这对引物扩增的片段长度是2 602 bp。(3)tpsI基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性,g-5菌落tpsI基因表达量明显降低,所以可以推测msn2基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的机理是msn2基因表达产物的缺乏,抑制了tpsI基因的表达,提高了米曲霉对逆境的敏感性,从而导致米曲霉产生更多的曲酸。
知识拓展　基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用同源DNA片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的,由此可见,基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以用突变基因或其他基因敲除相应的正常基因,也可以用正常基因敲除相应的突变基因。
E组
简单情境
1.基因工程生产胰岛素(2022天津和平一模,16)我国是糖尿病患者第一大国,胰岛素市场广阔,目前我们国家已经成功通过基因工程生产出胰岛素,如图是进行基因工程生产胰岛素的部分示意图。据图回答下列问题:

图1　胰岛素基因与引物位置、限制酶作用位点

图2　质粒结构示意图
(1)已知DNA链的合成方向是5'→3',若要扩增出胰岛素基因并用于表达载体的构建,应该选择的引物是　　　　　　　　　　,选择这两种引物的原因是　　　　　　　　　　。 
(2)结合图1和图2,应该选择的限制酶最好是　　　　　　　　,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)能够发挥作用的胰岛素是由两条链盘曲折叠形成的,如果选择大肠杆菌作为受体菌,只能从大肠杆菌中提取到两条单链肽链,不能得到有活性的胰岛素,原因是　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)引物4和引物5　既能保证正常合成子链,又包含限制酶切割位点　(2)BamHⅠ和HindⅢ　既能防止质粒自身环化,又可以保证目的基因正确连接在质粒上　(3)大肠杆菌为原核生物,无内质网和高尔基体等细胞器,不能对多肽链进行加工
解析　(1)(2)在选择限制酶切割质粒和目的基因时需注意不能破坏目的基因、启动子等,且能切出相同的黏性末端。由图1、图2可知,选择的限制酶最好是BamHⅠ和HindⅢ,因其既能防止目的基因和质粒自身环化,又可以保证目的基因正确连接在质粒上。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,需要与模板链的3'端结合。据图可知,引物3、引物4以及引物5、引物6都位于子链的3'端,可以复制出目的基因,但是经引物3和引物6复制后的目的基因没有限制酶BamHⅠ和HindⅢ的切割位点,不能与质粒连接,故应选择引物4和引物5用于表达载体的构建。(3)胰岛素的本质是分泌蛋白,其最终能发挥作用需要内质网和高尔基体等的加工,而大肠杆菌属于原核生物,只有核糖体这一种细胞器,故只能从大肠杆菌中提取到两条单链肽链,不能得到有活性的胰岛素。
复杂情境
2.基因工程生产苯乳酸(2022天津十二校一模,17)乳酸菌无氧呼吸过程中,第一阶段产生的丙酮酸会在LDH的催化下产生乳酸,科学家通过改造乳酸脱氢酶(LDH),能够高效地生产高纯度的苯乳酸。
(1)科学家拟改造LDH基因成为mLDH基因,需将LDH第52位的酪氨酸替换为亮氨酸,使得活性中心增大,可用于生产苯乳酸。
①先将LDH基因片段连入载体中,形成环状质粒,如图。

注:1.方框中“GTA”转录出的UAC是酪氨酸的密码子
2.亮氨酸的密码子为CUX(X可为任意碱基)、UUA、UUG
将突变后的序列设计在引物1中,以环状质粒为PCR的　　　　　　,再向体系中加入四种脱氧核苷酸(dNTP)、　　　　　酶、　　　　以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因,PCR产物的序列便引入了预期的突变。下列引物序列中符合引物1要求的有　　　、　　　。 
A.5'-TGACTGACTAACACTCGGAC-3'
B.5'-TGACTGACAACCACTCGGAC-3'
C.5'-TGACTGACGATCACTCGGAC-3'
D.5'-TGACTGACGAGCACTCGGAC-3'
②上述PCR产物为　　　状DNA分子,改造后的LDH基因序列位于PCR产物的两侧,需要用　　　　　酶将产物两端连接起来,获得含有mLDH基因的质粒。 
(2)产生苯乳酸的过程还需FDH酶参与,现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。根据如图信息,先用限制酶　　　　和　　　　切割质粒2和空载体,将两种酶切产物连接获得连接产物,再用限制酶　　　　　切割质粒1和上一步中的连接产物,连接获得基因表达载体。 

(3)上述科学实践属于生物工程中的　　　　工程。 
答案　(1)①模板　耐高温的DNA聚合(Taq DNA聚合)　引物2　A　D　②链　DNA连接　(2)NdeⅠ　XhoⅠ　NcoⅠ和BamHⅠ　(3)蛋白质
解析　(1)①分析题意可知,科学家拟改造LDH基因。将突变后的序列设计在引物1中,以环状质粒为PCR的模板,加入四种游离的脱氧核苷酸(dNTP)、耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、引物2以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因。由于亮氨酸的密码子为CUX、UUA、UUG,根据碱基互补配对原则,引物中相同位点(对应题干方框中的“GTA”)能转录出含有相应密码子的只有A和D。②题干中扩增得到的PCR产物为链状DNA分子,需要用DNA连接酶将产物两端连接起来,获得含有mLDH基因的质粒。(2)分析题图可知,质粒1中的mLDH基因适合用限制酶NcoⅠ和BamHⅠ切割,质粒2中的FDH基因适合用限制酶XbaⅠ和XhoⅠ或NdeⅠ和XhoⅠ切割,而空载体中限制酶XbaⅠ切割位点位于启动子中,故不宜选用限制酶XbaⅠ。因此,应先用限制酶NdeⅠ和XhoⅠ切割质粒2和空载体,将两种酶切产物连接获得连接产物,再用限制酶NcoⅠ和BamHⅠ切割质粒1和上一步中的连接产物,连接获得基因表达载体。(3)由分析可知,题干的科学实践中,先设计需要的蛋白质再改造出相应的基因,属于生物工程中的蛋白质工程。
F组
简单情境
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
1.引物的应用(2022北京朝阳一模,13)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是(　　)

A.该图表示PCR循环中的变性环节
B.dNTP作为扩增的原料会依次连接到5'端
C.Taq酶催化相邻的dNTP间形成磷酸二酯键
D.用图中引物扩增两个循环后可获得目的产物
答案　C　图示引物与模板链的配对过程,为PCR循环中的复性环节,A错误;扩增时,dNTP添加到核酸链的3'端,同时形成磷酸二酯键,B错误,C正确;两个引物均不在模板DNA的端点,需在第三轮循环产物中才出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(目的产物),D错误。
2.细菌的防御机制(2022辽宁鞍山二模,17)(多选)CRISPR-Cas9是近年来生物学科研的热门技术,该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示,当细菌感知到噬菌体侵入时,会通过gRNA识别噬菌体DNA,并通过Cas9切断目标DNA,从而起到防御作用。下列关于该机制的叙述错误的是(　　)

A.噬菌体DNA的变化体现了基因突变的不定向性
B.gRNA与目标DNA结合片段中最多含有5种核苷酸
C.Cas9可破坏DNA分子的磷酸二酯键
D.高倍光学显微镜可观察到该现象
答案　ABD　噬菌体DNA被细菌gRNA识别并被Cas9切割过程属于特定位点的切割,不能体现基因突变的不定向性(不一定是基因突变),A错误;gRNA为RNA,最多由4种核糖核苷酸组成,结合的目标DNA最多由4种脱氧核苷酸组成,故gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核苷酸,B错误;Cas9切断目标DNA属于分子水平的改变,光学显微镜下观察不到,D错误。
复杂情境
3.双脱氧终止法核酸测序(2022天津一模,12)20世纪70年代, Fred sanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图,在4个试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP);ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点,并终止DNA片段的延伸。在4个试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止,并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法中正确的是(　　)

A.这种测序方法需要引物和耐高温的DNA连接酶
B.电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾
C.测得未知DNA的序列为5'- GATTCGAGCTG-A-3'
D.ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的5'末端
答案　B　双脱氧终止法对DNA进行测序是利用了PCR的技术原理,PCR扩增DNA需要引物和耐高温的DNA聚合酶,A错误;电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾(依据右侧的碱基判断),B正确;以未知序列为模板,合成的子链与未知序列互补,因此未知DNA的序列为5'-TCAGCTCGAATC-3',C错误;ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3'末端,D错误。
复杂陌生情境
4.TALEN靶向基因敲除技术(2022河南孟津一中月考一,23)TALEN技术是一种靶向基因敲除技术(原理如图1)。TALEN技术使用的基因敲除工具是由DNA识别域和核酸内切酶两个部分组成的蛋白质。科学家发现了一种细菌蛋白质(TALE),它的二连氨基酸(NI、NG、HD、NN,其中字母N、I、G、H、D分别代表了一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系:NI识别A,NG识别T,HD识别C,NN识别G。FokⅠ是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。因此,可以利用TALE作为DNA识别域,用FokⅠ二聚体定点切断DNA。

图1
科学家发现水稻植株无论是否具有光周期敏感蛋白基因P,在短日照条件下均表现为雄性可育。在长日照条件下,具有光周期敏感蛋白的水稻才表现为雄性可育。基因P只在单倍体花粉细胞中表达,使其能够合成淀粉。科研人员使用TALEN技术对水稻基因P进行靶向敲除,以得到光敏雄性不育水稻新品种。
(1)在TALEN技术的设计中,选择使用FokⅠ单体而不直接使用FokⅠ二聚体,这样能减少对DNA的　　　　　　　切割,保证了基因敲除的靶向性。为了让TALEN技术能用于各种不同生物、不同基因的敲除,没有与TALE蛋白结合的FokⅠ二聚体对DNA的切割应　　　　　　(选填“具有”或“不具有”)类似于限制酶的“限制性”。 
(2)若TALE蛋白左臂所识别的基因P的序列为“—TGACC—”,则TALE蛋白左臂对应的二连氨基酸序列应为　　　　。用这种方法,可以确定TALE蛋白的氨基酸序列,进而人工合成TALE蛋白基因。然后将TALE蛋白基因与　　　基因进行融合,得到融合基因。 
(3)科研人员用图2所示的质粒为载体,其中的潮霉素抗性作为标记基因,作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　。应选用　　　　　　　酶将该质粒与融合基因构建为重组质粒,并将融合基因设法导入水稻愈伤组织中,再利用　　　　技术获得T0植株。 

图2
(4)由于基因靶向敲除成功的概率比较低,因此科研人员培育T0植株时应保证　　　　日照条件,待其自花受粉得到T1,再将T1植株　　　　,并在开花期随机选择一部分植株的花粉进行鉴定,鉴定方法是　　　　　　　　　　,若观察到某植株的花粉全部未被染成蓝色,则该植株为所需的纯合光敏雄性不育新品种。 
(5)与传统的雄性不育水稻品种相比,光敏雄性不育新品种的优势在于它能实现自交繁殖并保留雄性不育特性,这是因为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)非靶向(或“随机”)　不具有
(2)—GNNNINDHDH—　FokⅠ单体　(3)筛选转化成功的受体细胞　BamHⅠ及DNA连接　植物组织培养　(4)短　在长日照下种植　将花粉用碘液染色后,在显微镜下观察　(5)光敏雄性不育新品种在短日照条件下雄性可育,可实现自交繁殖;自交后代能保持基因P敲除的纯合性,使其在长日照条件下雄性不育
解析　(1)若使用FokⅠ二聚体,则可在靶基因的左侧或右侧序列进行随机切割,使用FokⅠ单体可保证基因敲除的靶向性。限制酶只在特定的核苷酸序列进行切割,为让TALEN技术能用于不同基因的敲除,没有与TALE蛋白结合的FokⅠ二聚体需不具有类似于限制酶的“限制性”。(2)NI识别A,NG识别T,HD识别C,NN识别G,故对应的二连氨基酸序列应GNNNINDH为—DH—,融合基因由TALE蛋白基因和FokⅠ单体基因融合而成,如果表达后就可以获得具有特异性识别并且切割的工具。(3)在基因工程中,标记基因用于筛选转化成功的受体细胞。选用限制酶时,不能破坏标记基因,且位于启动子和终止子之间,故需选用BamHⅠ酶处理目的基因和质粒,再用DNA连接酶连接形成重组质粒。融合基因导入水稻愈伤组织中后,再利用植物组织培养技术获得T0植株。(4)由于在短日照条件下水稻植株有无光周期敏感蛋白P均表现为雄性可育,在长日照条件下,具有光周期敏感蛋白P的水稻才表现为雄性可育,因此培育T0植株应该保证在短日照条件,获得T1后将其放入长日照下种植,然后进行花粉鉴定,基因P只在单倍体花粉细胞中表达,使其能够合成淀粉,故可以用碘液染色,鉴定是否含基因P,筛选花粉全部未被染色的植株,即不含基因P的纯合植株。(5)由于光敏雄性不育新品种在短日照条件下雄性可育,可实现自交繁殖;自交后代能保持基因P敲除的纯合性,使其在长日照条件下雄性不育,因此与传统的雄性不育水稻品种相比,光敏雄性不育新品种的优势在于它能实现自交繁殖并保留雄性不育特性。