2023届高考生物二轮复习基因工程与蛋白质工程学案含答案

这是一份2023届高考生物二轮复习基因工程与蛋白质工程学案含答案，共32页。学案主要包含了p100，p251等内容，欢迎下载使用。

第三讲　基因工程与蛋白质工程
　【p93】
1．基因工程的操作原理、操作对象、操作水平、优点分别是什么？
操作原理——基因重组；操作对象——基因；操作水平——分子水平；优点：定向改造生物的性状，打破生殖隔离。
2．基因工程的三种工具分别是什么？
限制酶、DNA连接酶、载体。
3．限制酶的来源？作用的结果是什么？为什么不切割原核细胞中的DNA?
主要来自原核生物；结果是产生黏性末端或平末端；含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
4．DNA连接酶的作用和种类？
①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
②种类：E.coli DNA连接酶，来源于大肠杆菌，只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来；T4 DNA连接酶，来源于T4噬菌体，既可以连接黏性末端，又可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较低。
5．能作用于磷酸二酯键的酶有哪些？
DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶、DNA水解酶、逆转录酶。
6．载体的种类有哪些？
质粒、噬菌体、动植物病毒等。
7．常用载体——质粒的本质是什么？
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
8．质粒作为载体所具备的条件及原因是？

条件
原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA分子的筛选
无毒害作用
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
　　9.基因工程的基本操作程序是？
(1)目的基因的筛选与获取；
(2)基因表达载体的构建；
(3)将目的基因导入受体细胞；
(4)目的基因的检测与鉴定。
10．PCR的原理和需要的基本条件分别是什么？
(1)DNA半保留复制。
(2)基本条件
①场所：一定的缓冲溶液中，一般要添加Mg2＋
②模板：DNA母链
③原料：4种脱氧核苷酸
④酶：耐高温的DNA聚合酶
⑤引物：2种
11．PCR的过程和产物的鉴定分别是？
(1)过程
①变性：当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链。
②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
(2)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
12．基因表达载体构建的目的是什么？
让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
13．基因表达载体的组成包括什么？

14．基因表达载体的构建过程是什么？
(1)首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
(2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；
(3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处。
15．将目的基因导入动物细胞的方法和常用的受体细胞？
①方法：显微注射技术；②受体细胞：受精卵。
16．将目的基因导入微生物细胞的方法和常用的受体细胞？
①常以大肠杆菌作为受体细胞；
②一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
17．目的基因的检测与鉴定如何进行？
(1)分子水平的检测
①通过PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因；检测目的基因是否转录出了mRNA。
②利用分子探针技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因；检测目的基因是否转录出了mRNA。
③用相应抗体进行抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质等。
(2)个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病接种实验等。
18．乳腺生物反应器的构建，受体细胞是什么？有什么限制？
受体细胞是受精卵；发育出的个体必须是雌性个体。
19．乳腺生物反应器中目的基因为什么只在乳腺细胞中表达？
因为目的基因前的启动子是乳腺细胞中特异表达的基因的启动子。
20．DNA的粗提取的原理是？
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；
(2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。
21．鉴定DNA的原理是什么？
在沸水浴加热下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
22．蛋白质工程的直接操作对象和基本思路是什么？
直接操作对象：基因(进行改造或合成新基因)
基本思路：预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
23．蛋白质工程的结果是什么？
改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质。
　【p95】
1．你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？(选择性必修3 p71旁栏思考题)
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
2．用PCR可以扩增mRNA吗？(选择性必修3 p79旁栏思考题)
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：
第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条DNA链，形成RNA—DNA杂交分子。
第二步，核酸酶降解RNA—DNA杂交分子中的氢键使之变成单链DNA。
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条DNA链，形成双链DNA分子。
3．研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。(选择性必修3 p83)
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
4．水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他们提出了以下两种方案。方案一：把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而减少氮肥的施用量。方案二：直接将固氮相关基因导入水稻细胞中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，这样就可以免施氮肥了。(选择性必修3 p98)
(1)请评估这两种方案哪种更容易实现。
从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。(其他合理答案均可)
(2)如果两个方案都实现的话，你认为哪种更值得推广？请说出你的理由。
此题不要求有唯一的答案，学生可从便捷性、安全性、经济性等角度进行分析，言之成理即可。例如，从便捷性角度认为能固氮的水稻新品种更值得推广；或从转基因安全性角度认为能固氮的水稻根系微生物更值得推广等。
　【p96】
1．DNA连接酶能将两碱基间的氢键连接起来。(×)
2．限制酶也可以识别和切割RNA。(×)
3．质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(√)
4．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×)
5．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。(√)
6．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)
7．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(×)
8．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(×)
9．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。(√)
10．在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。(×)
11．利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(×)
12．由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(×)
13．蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。(√)
14．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×)
15．转入油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中。(√)
16．如果转基因植物的外源基因源于自然界，则不会存在安全性问题。(×)
17．“设计试管婴儿”与“试管婴儿”相比在植入前需要对胚胎进行遗传学诊断。(√)
18．中国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆。(√)
19．中国反对生物武器，但中国在特殊情况下可以生产生物武器。(×)
　【p96】
　　　　　　　　　　　　　　　

　　(2022·广东卷)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。

回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对____________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________________________________________，终止子的作用是______________________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是______________________________________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__________________________________________________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【解析】(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3′端延伸子链。
(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞；终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。
(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。
(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】(1)引物
(2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录，使转录在需要的地方停下来
(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
(4)废物的资源化　不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是__________________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是______________________________________________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与________________________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指__________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【解析】(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
(2)在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶(热稳定DNA聚合酶)，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物开始进行互补链的合成。
(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。
(4)据分析可知，PCR(多聚酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】(1)④②③①
(2)Taq酶(热稳定DNA聚合酶)　延伸　Taq酶从引物起始进行互补链的合成
(3)两条单链DNA
(4)一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAGP和FLAGP△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是______________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的____________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

(3)融合蛋白表达成功后，将FLAGP、FLAGP△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAGP和FLAGP△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是________________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是__________________________________________________________。

(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是____________________________________________________________________。
【解析】(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAGP，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAGP，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAGP的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAGP，出现杂交带；④⑤组使用FLAGP△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAGP的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
【答案】(1)两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对　5′端
(2)在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变
在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数
(3)促进UBC与FLAGP的结合　P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列
(4)药物A促进UBC与FLAGP的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的
　　(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RTPCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是__________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的__________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是____________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明__________________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明________________________________________________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【解析】(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RTPCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。
(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(90～95 ℃)、复性(55～60 ℃)、延伸(70～75 ℃)，故其中温度最低的一步是复性。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
(4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)。
【答案】(1)逆转录酶(反转录酶)
(2)特异性核苷酸序列　复性
(3)曾感染新冠病毒，已康复　已感染新冠病毒，是患者
(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)
(2020·山东卷)水稻胚乳含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______________________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为____________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了__________________________________________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是______________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如下图所示，据图推测糯性最强的品系为______，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

【解析】(1)将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。
(2)启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列位于基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。
(3)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要有根据Wx基因设计合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术转移性扩增出Wx基因的cDNA。
(4)由图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
【答案】(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶　转化
(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
(3)逆转录(或反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
(2020·天津卷)Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。

据图回答：
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有________个。

(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________(多选)。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。
(4)检测转化的乳酸菌发现，信号肽—重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是______________________________________。
(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原。能够特异性识别它的免疫细胞有______(多选)。
A．B细胞 B．T细胞
C．吞噬细胞 D．浆细胞
【解析】(1)mRNA中，相邻的三个碱基决定一个氨基酸，根据图示可知，改造前后的单链有7个碱基发生了替换，第三、四两个替换的碱基对应mRNA中的同一个密码子，因此对应的mRNA中存在碱基替换的密码子有6个。
(2)人胰岛素分子含有一条A链和一条B链，为了确保等比例表达A、B肽链，引入短肽编码序列不能含有终止子序列，使重组人胰岛素编码序列完整进行转录，A正确；引入短肽编码序列不能含有终止密码子编码序列，使重组人胰岛素编码序列转录形成的mRNA完整翻译，B正确；引入短肽在翻译后应切除，不能改变A链氨基酸序列，不能改变原人胰岛素抗原性，以免影响其功能，C、D正确。
(3)据图中碱基分布情况可知，重组表达载体为一环形DNA分子，其中有两个SacⅠ酶切位点和一个XbaⅠ酶切位点，用这两种酶充分切割重组表达载体，可形成3种DNA片段。
(4)乳酸菌为原核细胞，信号肽—重组人胰岛素的化学本质为蛋白质，在核糖体上合成后，依次经过细胞质基质、细胞膜，最后出现在乳酸菌的细胞壁上。
(5)B细胞、T细胞可特异性识别抗原，吞噬细胞只能识别“自己”与“非己”，不能特异性识别抗原，浆细胞通过产生抗体作用于抗原，不能识别抗原。A、B符合题意。
【答案】(1)6
(2)ABCD
(3)3
(4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁
(5)AB
(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例)：

请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′羟基与5′磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________，Taq DNA聚合酶的作用是催化________________________________________________________________________。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________(从引物①②③④中选择，填编号)。


DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知
序列

PCR
引物
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
　　(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′
B．5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′
C．5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′
【解析】(1)EcoRⅠ是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。
(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3′羟基和5′磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 ℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的、依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
(3)引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。
(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5′端应该是AATTC，3′端是GAATT，故选A。
【答案】(1)限制性核酸内切(或限制)　核苷酸序列
(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸
(3)②④
(4)A
　【p100】
1．复习重组DNA技术所需的三种基本工具的作用，DNA的粗提取与鉴定，关注基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
2．复习基因工程的原理和基本操作程序、PCR的基本操作和产物的鉴定，关注基因工程相关技术的发展以及给人类生活带来的便利。
3．认同基因工程的应用价值，关注基因工程的进展，了解基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面的应用。
4．复习蛋白质工程的基本原理，了解蛋白质工程崛起的缘由，关注蛋白质工程可以依据人类的需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。
　　　　　　　　　　　　　　　

　【p251】
A组(选择题为单选)
1．下列有关限制性内切核酸酶的叙述中错误的是(　　)
A．用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，4个磷酸二酯键断裂
B．－CATG↓－和－G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同
C．用不同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也可能形成重组质粒
D．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小
【答案】D
【解析】用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，需要切开两个切口，断裂4个磷酸二酯键，A正确；－CATG↓－和－G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同，都是4个，B正确；用不同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，再用DNA连接酶也可能形成重组质粒，C正确；限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，D错误。
2．2015年诺贝尔化学奖颁给了研究DNA修复细胞机制的两位科学家，细胞通过DNA损伤修复可使DNA(基因)在复制过程中受到损伤的结构大部分得以恢复，如图为其中的一种方式——切除修复过程示意图。下列有关叙述不正确的是(　　)

A．图示过程的完成，可能需要多种酶的共同作用
B．图中二聚体的形成可能是物理、化学等因素的作用
C．该修复过程遵循碱基互补配对原则
D．对DNA(基因)的损伤修复，从生物变异角度看属于基因重组
【答案】D
【解析】图示过程的完成需要限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等的共同作用，A正确；二聚体的形成可能是受环境因素的影响，如物理、化学等因素，B正确；在两个胸腺嘧啶脱氧核苷酸封闭缺口的过程中利用了碱基互补配对原则，C正确；修复过程的变化不属于生物变异，D错误。
3．为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，下图为重组Ti质粒上TDNA的序列结构示意图。下列相关叙述不正确的是(　　)

A．以水稻RNA为模板通过逆转录及PCR扩增可获得大量OsPTF基因
B．RNA聚合酶与启动子1识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录
C．可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织
D．用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切重组Ti质粒后，经电泳分离可得到两条不同长度的带
【答案】B
【解析】以水稻RNA为模板通过逆转录可以合成cDNA，然后再以cDNA为模板利用PCR扩增可获得大量OsPTF基因，A正确；识图分析可知，抗除草剂基因位于启动子2的后面，因此RNA聚合酶与启动子2识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录，B错误；由于图中TDNA的序列中含有目的基因和抗除草剂基因，故可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织，C正确；用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切重组Ti质粒后，经电泳分离得到两条带，即含耐低磷基因OsPTF的片段和含除草剂基因的片段，D正确。
4．如图为蛋白质工程操作的基本思路，下列叙述不正确的是(　　)

A．图中①代表转录，②代表翻译，④代表分子设计，⑤代表DNA合成
B．因为蛋白质的高级结构十分复杂，所以蛋白质工程是一项难度很大的工程
C．蛋白质工程的目的是对基因的结构进行分子设计
D．从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是相反的
【答案】C
【解析】图中①代表转录，②代表翻译，④代表分子设计，⑤代表DNA合成，A正确；因为蛋白质的高级结构十分复杂，所以蛋白质工程是一项难度很大的工程，B正确；蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计，通过基因合成或修饰实现，C错误；从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是相反的，D正确。
5．草甘膦是一种广泛应用的除草剂，将抗草甘膦基因转入油菜中，可使油菜抗草甘膦。在转基因油菜种植多年后，调查发现在公路边的野生油菜有80%含有抗草甘膦基因。下列叙述错误的是(　　)
A．80%的野生油菜体内出现抗草甘膦基因是人工选择的结果
B．抗草甘膦的油菜与野生油菜之间未产生生殖隔离
C．野生油菜体内的抗草甘膦基因主要源自转基因油菜的花粉
D．轮换使用不同作用机理的除草剂有利于减缓植物抗性的提高
【答案】A
【解析】80%的野生油菜体内出现抗草甘膦基因是转基因油菜和野生油菜发生了基因交流，这属于基因污染，是自然选择，不是人工选择，A错误；含抗草甘膦基因的野生油菜并不是新物种，因为它仍可以与油菜杂交，产生后代，没有出现生殖隔离，B正确；转基因油菜与野生油菜杂交(在转基因油菜作为父本，提供花粉的情况下)，会将抗草甘膦基因传递给野生油菜所产生的后代，C正确；大量使用单一除草剂会导致植物抗性的提高，轮换使用不同作用机理的除草剂有利于减缓植物抗性的提高，D正确。
6．荧光PCR法根据化学发光原理可以分为染料法和探针法。染料法中特殊染料本身不发光，但是当PCR扩增的时候，染料能够与DNA双链结合从而发光，如图1所示。探针法中除了引物外另外设置了一个探针，在探针的两端分别带上发光基团和淬灭基团，此时发光基团并不发光，但是当DNA通过引物合成的时候，探针被酶切降解释放出发光基团和淬灭基团，两种基团分开后产生荧光，如图2所示。下列说法错误的是(　　)

A．两种方法均可用于目标DNA的定量分析
B．与染料法相比，探针法的特异性更强
C．通过适当延长引物长度和降低复性温度可提高荧光PCR的特异性
D．用荧光PCR法检测人体是否感染新冠病毒前需要先进行逆转录
【答案】C
【解析】染料法中“染料能够与DNA双链结合从而发光”，探针法中“两种基团分开后产生荧光”，荧光强度和DNA含量成正相关，A正确；染料法中，染料不与单链DNA链结合，只要掺入DNA双链中就可以发光。探针法中，只有探针结合的片段上发生扩增才能发光，探针法的特异性更强，B正确；适当延长引物长度，和引物互补配对的特定DNA序列更长，能提高荧光PCR的特异性，降低复性温度，则引物和DNA序列更容易结合，可能发生错误配对，降低荧光PCR的特异性，C错误；新冠病毒的遗传物质是RNA，染料法和探针法都是检测DNA，检测人体是否感染新冠病毒前需要先进行逆转录，以病毒RNA为模板来合成DNA，D正确。
7．SV40病毒是一种感染猴细胞的病毒，其基因组DNA可以在寄主细胞中编码一种大T抗原，用免疫荧光反应，可以定位大T抗原蛋白在寄主细胞的存在位置。此抗原中含有一段氨基酸序列(NLS)。如表显示出NLS的作用。(Pro、Lys、Arg、Val、Thr分别代表5种氨基酸)

NLS野
生型
ProProLysLysLysArgLysVal
荧光在核内
NLS突
变型
ProProThrLysLysArgLysVal
荧光在细胞质中
以下叙述错误的是(　　)
A．NLS可以引导T抗原蛋白进入寄主细胞的核内
B．碱基对的替换导致控制NLS的基因发生了突变
C．大T抗原蛋白的表达在寄主细胞的细胞核内发生
D．免疫荧光反应的原理是抗原—抗体杂交
【答案】C
【解析】由题干信息“NLS是大T抗原蛋白上的一段氨基酸序列，荧光可以定位大T抗原蛋白在寄主细胞的存在位置”，结合表格看出，NLS野生型的大T抗原蛋白在细胞核内存在，NLS突变型的大T抗原蛋白在细胞质内存在，推测NLS可以引导T抗原蛋白进入寄主细胞的核内，A正确；NLS野生型和NLS突变型的氨基酸序列中第三位氨基酸种类不同，氨基酸的数量不变，说明DNA中发生了碱基对的替换导致控制NLS的基因发生了基因突变，B正确；大T抗原蛋白基因的表达，包含转录和翻译，其中翻译过程在寄主细胞的核糖体上合成，不在细胞核内发生，C错误；用相应的抗体与大T抗原蛋白特异性结合，从而产生免疫荧光反应，此方法称为抗原—抗体杂交，D正确。
8．黄萎病是危害棉花种植的常见疾病，其病原菌主要为大丽轮枝菌和黑白轮枝菌。科学家通过基因工程技术将抗黄萎病基因D导入棉花，获得抗黄萎病棉花。图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因，BclⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为限制酶。请回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增基因D时，设计引物序列的主要依据是__________________________________________________。
(2)将目的基因D和Ti质粒连接构建重组质粒时，切割Ti质粒应选用的限制酶是____________，原因是______________________________________________；可利用含____________的培养基对导入重组质粒的农杆菌进行筛选。
(3)农杆菌能够感染棉花的愈伤组织细胞，与这些细胞可以分泌大量的__________有关。种植抗黄萎病棉花在环境保护方面的意义主要表现在________________________________________________。
【答案】(1)与D基因两端的部分核苷酸序列碱基互补配对
(2)HindⅢ和BamHⅠ　双酶切产生不同的黏性末端，防止自身环化和倒接，保证了目的基因准确插入到TDNA内部　氨苄青霉素
(3)酚类化合物　减少化学农药的用量，减少环境污染和对人类的危害，对保护环境有益
【解析】(1)设计引物序列的主要依据是与D基因两端的部分核苷酸序列碱基互补配对。
(2)为了保证目的基因能够插入到TDNA上，TDNA上没有BclⅠ的切点，所以不选BclⅠ，TDNA上有HindⅢ和BamHⅠ的切点，同时D基因两端也分别含有HindⅢ和BamHⅠ的切点，由于双酶切可产生不同的黏性末端，能防止自身环化和倒接，并保证目的基因准确插入到TDNA内部，故选择的限制酶为HindⅢ和BamHⅠ。四环素抗性基因被BamHⅠ破坏，质粒中的氨苄青霉素抗性基因能表达出相关氨苄青霉素抗性，因而可在培养基中加入氨苄青霉素，含有重组质粒的农杆菌能生存。
(3)农杆菌能够感染棉花的愈伤组织细胞，与这些细胞可以分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌有关。种植抗黄萎病棉花在环境保护方面的意义主要表现在减少化学农药的用量，减少环境污染和对人类的危害，对保护环境有益。
9．人体内的tPA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心肌梗死和脑血栓的急救药。通过基因工程技术可以大量制备基因工程药物tPA。
(1)研究人员采用PCR技术可以获得大量tPA基因，PCR的原理是____________________________。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增目的基因的前提条件之一，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除其中的蛋白质，原因是____________________________________。
(3)研究表明，为心肌梗死患者注射大量tPA会诱发颅内出血，其原因在于tPA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血的副作用。据此，先对天然的tPA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良tPA蛋白。(注：如下图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。)请回答下列问题：

①以上制造出性能优异的改良tPA蛋白的过程被称为__________。已知人tPA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为__________。
②如图所示，需选用限制酶XmaⅠ和__________切开质粒pCLY11，才能与tPA改良基因高效连接。与单一酶酶切相比，本操作采用的双酶切方法的优点是____________________________。
③将连接好的DNA分子导入大肠杆菌，含tPA改良基因重组DNA分子的细胞应具有的性状是________。
A．新霉素抗性且呈蓝色
B．新霉素敏感且呈蓝色
C．新霉素抗性且呈白色
D．新霉素敏感且呈白色
【答案】(1)DNA半保留复制
(2)蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性
(3)蛋白质工程　AGA　BglⅡ　防止质粒载体(和目的基因)自身环化　C
【解析】(1)PCR是指体外合成DNA的技术，其原理是DNA半保留复制。
(2)根据蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性的特征，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除其中的蛋白质，从而获得较纯净的DNA模板。
(3)①天然的tPA基因控制tPA蛋白的合成，改良tPA蛋白需要对天然的tPA基因进行序列改造，然后用改造的基因作为目的基因让其表达，从而实现对天然蛋白质的改造。题中性能优异的tPA蛋白的改良过程被称为蛋白质工程，已知人tPA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，根据碱基互补配对原则可推测，改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为AGA。
②目的基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割产生的黏性末端能与目的基因的黏性末端碱基互补，要想把目的基因与质粒pCLY11(运载体)拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11(运载体)也需要限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一个环节为基因表达载体的构建，其目的是让目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，这里用两种不同的限制酶切割质粒的目的是为了使其呈现两种不同的黏性末端分别与目的基因的两个黏性末端连接，这样可以保证目的基因和质粒的正向连接，同时也可避免目的基因和质粒的自身环化。
③结合图示可知，限制酶XmaⅠ和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏neor(新霉素抗性基因)，导入重组质粒的大肠杆菌具有新霉素抗性，但由于mlacZ基因被破坏，因而菌落呈现白色，而导入pCLY11质粒的大肠杆菌，既有新霉素抗性，且mlacZ基因也能正常表达，因而菌落呈现蓝色。当然这里作为受体细胞的大肠杆菌应该不具有pCLY11质粒，据此可将成功导入目的基因的大肠杆菌筛选出来。故选C。
B组(选择题为不定项)
1．下图是利用现代生物技术获取转基因羊的流程图，并利用PCR技术检测目的基因的转录水平来推断目的基因的表达情况。下列有关叙述正确的是(　　)

A．在转基因羊发育的不同时期提取的总mRNA不完全相同
B．图中A过程需要逆转录酶参与，获得的cDNA不含基因的启动子序列
C．利用目的基因cDNA与总cDNA的比值可以推测目的基因的转录水平
D．PCR扩增过程中需要用耐热的DNA聚合酶来合成与模板结合的引物
【答案】ABC
【解析】因为基因的选择性表达，故在转基因羊发育的不同时期提取的总mRNA不完全相同，A正确；图中A过程为逆转录，故需要逆转录酶参与，因为以RNA为模板，获得的cDNA不含基因的启动子序列，B正确；因为题中的cDNA是通过逆转录获得的，故用目的基因的cDNA与总cDNA的比值可以推测目的基因的转录水平，C正确；PCR扩增过程中，引物的合成不需要耐高温的DNA聚合酶，D错误。
2．大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。下列关于质粒的粗提取和鉴定的分析正确的是(　　)

A．提取DNA时可加入酒精，使不溶于酒精的蛋白质等物质析出
B．将提取的DNA溶于NaCl溶液后，可用二苯胺试剂直接进行鉴定
C．用限制酶Ⅰ和Ⅱ分别处理提取的产物，电泳出现如图结果，说明未提取到质粒
D．溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响
【答案】D
【解析】DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精，A错误；DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液，这样可以去除DNA中的某些杂质，提取的DNA可用二苯胺试剂在沸水加热条件下生成蓝色，B错误；限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ处理提取的产物，只得到一条带，说明提取物是环状DNA，即提取物为质粒，C错误；溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响，常用于使细胞破碎，D正确。
3．ACC合成酶是乙烯合成的关键酶，乙烯的合成会影响番茄的储藏和运输。如图为科学家利用ACC合成酶基因的反向连接构建载体，通过基因工程设计的耐储转基因番茄流程图。下列说法正确的是(　　)

A．引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键
B．反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，限制了细胞内乙烯的合成
C．可以在培养基中加入氨苄青霉素和四环素，存活下来的细胞内则含有携带目的基因的质粒
D．设计双酶切处理目的基因及载体是为了更好地保证目的基因的反向连接
【答案】ABD
【解析】通过PCR技术获取ACC合成酶基因，必须有特异性的引物，A正确；反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补形成双链RNA，限制了细胞内乙烯的合成，B正确；由图示可知，基因表达载体构建时四环素抗性基因已被破坏，因此可以在培养基中加入氨苄青霉素，存活下来的细胞内则含有携带目的基因的质粒，C错误；设计双酶切处理目的基因及载体是为了更好地保证目的基因的反向连接，D正确。
4．下列有关蛋白质工程的叙述，正确的是(　　)
A．蛋白质工程是在分子水平上通过基因修饰或基因合成来完成的
B．蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程
C．蛋白质工程的途径是从预期蛋白质结构开始，进行氨基酸的增减或替换
D．蛋白质工程的最终目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，以满足人类的需求
【答案】ABD
【解析】蛋白质工程是在分子水平上通过基因修饰或基因合成来完成的，A正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，B正确；蛋白质工程的途径是从预期蛋白质结构开始，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列，C错误；蛋白质工程的最终目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，以满足人类的需求，D正确。
5．科学家利用耐盐碱植物中的耐盐基因，培育出了耐盐水稻新品系，过程如图所示。下列说法不正确的是(　　)

A．阶段Ⅰ、Ⅱ分别采用重组DNA技术、植物组织培养技术
B．可采用抗原—抗体杂交技术对耐盐基因的表达产物进行检测
C．水稻细胞内检测到耐盐基因的表达产物，并不能说明育种已成功
D．常采用显微注射法将目的基因导入水稻细胞
【答案】D
【解析】阶段Ⅰ表示将目的基因导入水稻细胞中，采用了重组DNA技术；阶段Ⅱ表示利用植物组织培养技术将水稻细胞培养成完整植株，采用了植物组织培养技术，A正确；耐盐基因表达产物是蛋白质，可用抗原—抗体杂交技术检测，B正确；水稻细胞内检测到耐盐基因表达产物，并不能说明育种已成功，还要进一步检测该转基因植物是否能够在盐碱地中生长，C正确；通常采用农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞，D错误。
6．如图是采用CRISPR技术对某生物基因进行编辑的过程，该过程中用到的sgRNA可指引内切核酸酶Cas9结合到特定的位点进行切割，下列叙述正确的是(　　)

A．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的sgRNA
B．图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2的碱基序列相同或互补
C．根据破坏B基因后生物体的功能变化，可推测B基因的功能
D．被编辑后的B基因能进行转录
【答案】CD
【解析】sgRNA可指引内切核酸酶Cas9结合到特定的切割位点，因此基因定点编辑前需要设计与被切割基因两端碱基序列配对的sgRNA，A错误；图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2的碱基序列结合的是不同的DNA区段，故二者一般情况下既不相同也不互补，B错误；通过破坏B基因后生物体的功能变化可推测B基因的功能，C正确；被编辑后的B基因能进行正常转录，D正确。
7．图1是利用两种不同生物技术将小鼠培育成大鼠的过程。图2中质粒是基因工程中常用的质粒pIJ702，其中tsr为硫链丝菌素抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而限制酶ClaⅠ、BglⅡ、PstⅠ、SacⅠ、SphⅠ在pIJ702上分别只有一处识别序列。

(1)图1中应用到的生物工程技术有______________________________________(写3个)。c分子称为______________，其上的生长激素基因表达产物几乎可以作用于丁鼠的所有细胞，主要原因是这些细胞膜上具有__________________。
(2)若大鼠甲和大鼠乙体内X染色体上均带有某种致病基因，则培育出的大鼠丙和大鼠丁携带致病基因的情况是________________________(不考虑基因突变)。
(3)用SacⅠ和SphⅠ同时切割大鼠生长激素基因和质粒pIJ702，获取的目的基因去置换pIJ702上0.4 kb的片段，构成重组质粒pZHZ8。上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在下表1中。由此判断目的基因的片段长度为________kb。参照表1数据，如果用PstⅠ和ClaⅠ同时酶切重组质粒pZHZ8，则两种酶可将pZHZ8切成____________个片段。
表1


pIJ702
pZHZ8
BglⅡ
5.7 kb
6.7 kb
ClaⅠ
5.7 kb
2.2 kb，4.5 kb
PstⅠ
5.7 kb
1.6 kb，5.1 kb
(4)重组质粒pZHZ8上的标记基因是____________，在含硫链丝菌素固体培养基上培养后，筛选过程中要淘汰________菌落。
【答案】(1)核移植技术、转基因技术、胚胎移植技术、动物细胞培养技术　基因表达载体(重组DNA分子或重组质粒)　特异性的受体　(2)大鼠丙携带，丁不携带
(3)1.4　4
(4)tsr基因(硫链丝菌素抗性基因)　黑色的
【解析】(1)图1中，技术Ⅰ采用了核移植、动物细胞培养、胚胎移植等技术，技术Ⅱ采用了基因工程、动物细胞培养和胚胎移植等技术，因此图1中应用到的生物工程技术有核移植技术、转基因技术、胚胎移植技术、动物细胞培养技术等。c是构建好的基因表达载体(重组DNA分子或重组质粒)；生长激素基因表达产物为生长激素，几乎可以作用于丁鼠的所有细胞，主要原因是这些细胞膜上具有特异性的受体。
(2)大鼠丙的细胞核遗传物质都来自大鼠甲，因此其携带致病基因；大鼠丁只导入了大鼠乙的一个基因，因此不携带致病基因。
(3)质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为6.7－5.7＋0.4＝1.4 kb。用ClaⅠ切割质粒pIJ702时只产生一种长度的DNA片段，但用该酶切割重组质粒pZHZ8时能产生两种长度的DNA片段，这说明目的基因中含有ClaⅠ的切割位点，同理目的基因中也含有PstⅠ的切割位点，即重组质粒pZHZ8中含有2个PstⅠ酶切位点，也含有2个ClaⅠ酶切位点。因此，用这两种酶同时酶切重组质粒pZHZ8时，可将pZHZ8切成4个片段。
(4)构建基因表达载体时，破坏了mel(黑色素合成基因)，但没有破坏tsr(硫链丝菌素抗性基因)，因此重组质粒pZHZ8上的标记基因是tsr基因(硫链丝菌素抗性基因)；由于mel(黑色素合成基因)被破坏，含有重组质粒的受体细胞不能表达产生黑色素，因此在含硫链丝菌素固体培养基上培养后，筛选过程中要淘汰黑色的菌落。
8．针对新冠病毒(SARSCoV2)的重组蛋白疫苗、核酸疫苗(包括DNA疫苗和RNA疫苗)等疫苗已陆续研发问世。下图为其中一种疫苗的研发思路，图中①～⑦表示过程，质粒B中箭头表示NcoⅠ、SphⅠ、NheⅠ、BamHⅠ的酶切位点(四种酶的识别序列详见下表)，标记基因SUC2控制合成蔗糖酶，使P型酵母菌能利用培养基中的蔗糖生存。


限制酶
NcoⅠ
SphⅠ
NheⅠ
BamHⅠ
识别序列和切割位点
C↓CATGG
GCATC↓C
G↓GATCC
G↓CTAGC
(1)图中①过程需要使用____________酶先得到cDNA，再使用PCR技术扩增得到S基因。
(2)为使③过程顺利进行，需使用限制酶____________切割质粒B。
(3)图中表示筛选的过程是____________(填编号)，为达到利用标记基因筛选的目的，普通的P型酵母菌应该满足的代谢特点是________________________。
(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为________，刺激机体产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足的条件之一是________(填“有”或“无”)SARSCoV2感染史，理由是__________________________________________________________________。
(5)新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有__________________________(答一点即可)。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。
③某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为__________。
④阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c．病毒发生变异
【答案】(1)逆转录
(2)NcoⅠ、NheⅠ
(3)⑤　不能利用蔗糖
(4)抗原　无　有SARSCoV2感染史的志愿者血清中会存在一定量相应抗体，对试验结果产生干扰
(5)①耐高温的DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料浓度下降　②越小　③阳性　④abc
【解析】(1)①是以RNA为模板合成DNA的逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化；体外扩增目的基因可采用PCR(聚合酶链式反应)技术。
(2)根据C分子的两端的碱基序列及黏性末端可知，③过程需要用限制酶NcoⅠ、NheⅠ切割质粒B。常选用两种限制酶对新冠病毒的S基因进行切割，目的是防止S基因自身环化、防止S基因与运载体反向连接。
(3)图中表示筛选的过程是⑤(筛选含重组质粒的P型酵母菌)。标记基因SUC2控制合成蔗糖酶，使P型酵母菌能利用培养基中的蔗糖生存，因此筛选时普通的P型酵母菌不能利用蔗糖，而培养基中以蔗糖为唯一碳源。
(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为抗原，刺激机体产生特异性免疫过程，机体免疫系统产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足无SARSCoV2感染史，即未感染过新冠病毒的志愿者，因为感染过新冠病毒的人体血清中含有一定量的相应抗体，对试验结果产生干扰。
(5)①线性增长期目的基因数量的增长率下降，有可能是底物浓度降低导致的，也有可能是耐高温的DNA聚合酶的活性缓慢下降、引物浓度下降、原料浓度下降等导致的。
②样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越小，Ct值就越小。
③据图2可知荧光阈值大概是36，新型冠状病毒核酸检测结果应判定为阳性。
④阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有：取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值，样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解；病毒发生变异，abc均正确。