高中生物高考2020届高考生物一轮复习专题25基因工程包括PCR技术课件

这是一份高中生物高考2020届高考生物一轮复习专题25基因工程包括PCR技术课件，共60页。
第十一单元　现代生物科技专题专题25　基因工程（包括PCR技术）
生物 (天津市选考专用)
A组　自主命题·天津卷题组
考点1　基因工程的工具与操作程序
1.(2018天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用　　　    技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不能合成完整长度的　　　    ,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒,并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与　　        连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的　　　    进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加　　　　　　　    的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。
特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是　　　    (单选)。A.病毒的DNA聚合酶B.宿主的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶D.宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起　　　    免疫,增强免疫保护效果。
答案　(共14分)(1)PCR　多肽(或蛋白质)(2)载体　总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)　D(4)细胞
解析　本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换　    为编码终止密码子的序列,则改造后的基因转录合成的mRNA中,终止密码子提前出现,将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定,以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA,该tRNA的反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性,故可引起细胞免疫。
疑难突破    ①由(1)中“个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列”可知,改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽。②由(2)中特殊tRNA能与终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)可知,转基因宿主细胞可利用非天然氨基酸Uaa,所以培养基中需加入非天然氨基酸Uaa。③灭活了的病毒已不具有侵染性,因此,只能引起体液免疫;而具侵染性的病毒可引起细胞免疫。
2.(2017天津理综,9,20分)玉米自交系(遗传稳定的育种材料)B具有高产、抗病等优良性状,但难以直接培育成转基因植株,为使其获得抗除草剂性状,需依次进行步骤Ⅰ、Ⅱ试验。Ⅰ.获得抗除草剂转基因玉米自交系A,技术路线如下图。 (1)为防止酶切产物自身环化,构建表达载体需用2种限制酶,选择的原则是　　　    (单选)。①Ti质粒内,每种限制酶只有一个切割位点②G基因编码蛋白质的序列中,每种限制酶只有一个切割位点③酶切后,G基因形成的两个黏性末端序列不相同④酶切后,Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同A.①③　　B.①④　　C.②③　　D.②④
(2)下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知,细胞脱分化时使用的激素是　　　    ,自交系　　　    的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。
(3)农杆菌转化愈伤组织时,T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织,需使用含　　　    的选择培养基。(4)转化过程中,愈伤组织表面常残留农杆菌,导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达,其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织,出现蓝色的是　　　    (多选)。A.无农杆菌附着的未转化愈伤组织
B.无农杆菌附着的转化愈伤组织C.农杆菌附着的未转化愈伤组织D.农杆菌附着的转化愈伤组织(5)组织培养获得的转基因植株(核DNA中仅插入一个G基因)进行自交,在子代含G基因的植株中,纯合子占　    。继续筛选,最终选育出抗除草剂纯合自交系A。
答案　(1)A　(2)2,4-D　乙　(3)除草剂　(4)BD　(5) 
解析　(1)利用双酶切可有效防止出现限制酶切割后的产物(目的基因、载体)发生自身环化及目的基因与载体的任意连接现象。这要求每种限制酶在Ti质粒内只有一个切割位点,含目的基因的DNA片段被两种限制酶切割形成的黏性末端碱基序列不同。(2)细胞脱分化形成愈伤组织。表格信息显示,使用了2,4-D促使细胞脱分化。作为转化受体的幼胚,不仅要易脱分化,而且还要易再分化生芽、生根,故乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)构建的基因表达载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因(除草剂抗性基因位于T-DNA片段上),因利用农杆菌转化法转基因时,只有T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上,故需使用含除草剂的培养基筛选转化的愈伤组织。(4)因“含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达”,只有细胞内含有报告基因(成功转化)的愈伤组织,用K处理后出现蓝色,故选BD。(5)转基因植株相当于携带G基因的杂合子,转基因植株自交,后代有3/4植株携带G 基因,其中纯合子占1/3。
素养解读　本题通过对转基因作物及杂交育种相关知识的考查,让学生形成认识事物、解决时间问题的思维习惯和能力(体现了生命观念、科学思维、社会责任素养的考查)
易错警示　转基因植物培育过程中,筛选成功转化的植物受体细胞的标准利用农杆菌转化法完成植物细胞转基因时,因只有Ti质粒的T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上,故筛选转化的植物受体细胞只能借助T-DNA片段上的特殊基因作为筛选标准,而Ti质粒上的非T-DNA片段未导入植物受体细胞,在对转化后的受体细胞筛选时不能以此作为选择标准。
3.(2015天津理综,8,16分)纤维素分子不能进入酵母细胞。为了使酵母菌能够利用环境中的纤维素为原料生产酒精,构建　    了含3种不同基因片段的重组质粒。下面是酵母菌转化及纤维素酶在工程菌内合成与运输的示意图。 据图回答:(1)本研究构建重组质粒时可选用四种限制酶,其识别序列如下图。为防止酶切片段的自身连
接,可选用的限制酶组合是　　　    或　　　    。 A.①②　　B.①③　　C.②④　　D.③④(2)设置菌株Ⅰ为对照,是为了验证　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    不携带纤维素酶基因。(3)纤维素酶基因的表达包括　　　    和　　　    过程。与菌株Ⅱ相比,在菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有　　　　　　　    。
答案　(16分)(1)B(或C)　C(或B)(2)质粒DNA和酵母菌基因组(3)转录　翻译　内质网、高尔基体(4)Ⅱ　缺少信号肽编码序列,合成的纤维素酶不能分泌到胞外,细胞无可利用的碳源(5)细胞质基质　无氧呼吸　A基因片段
(4)在以纤维素为唯一碳源的培养基上分别培养菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,菌株　　　    不能存活,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。(5)酵母菌生成酒精的细胞部位是　　　　　　　　　    ,产生酒精时细胞的呼吸方式是　    　    。在利用纤维素生产酒精时,菌株Ⅳ更具优势,因为导入的重组质粒含有　　　    ,使分泌的纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,提高酶的利用率。
解析　本题借助新情境材料考查对照实验结果分析、基因工程、分泌蛋白表达、呼吸等相关知识,考查学生获取信息能力、实验能力、理解能力。(1)为防止酶切片段的自身连接,必须用不同限制酶切割,且酶切片段两端的黏性末端不相同(不存在碱基互补片段)。从图示看,符合要求的限制酶有以下组合:①③、①④、②③、②④,B、C正确。(2)分析对照实验首先要确定自变量,本题中自变量是导入含不同基因片段的重组质粒。菌株Ⅰ为空白对照,与其他三个组别比较,不难发现设置菌株Ⅰ的目的是验证质粒自身及酵母菌原基因组不携带纤维素酶基因。(3)基因表达包括转录和翻译两个过程。通过图示来看菌株Ⅱ中,纤维素酶只分布在细胞质基质中,而菌株Ⅲ和菌株Ⅳ的纤维素酶分布在内质网、高尔基体、囊泡、细胞外,所以菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有内质网、高尔基体。(4)菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行对比,不难发现信号肽的作用是引导多肽(纤维素酶)进入内质网加工,再经高尔基体分泌到胞外,这样纤维素酶可在胞外将纤维素水解为葡萄糖,供酵母菌吸收利用。而菌株Ⅱ纤维素酶在胞内无法水解纤维素,故在以纤维素为唯一碳源的培养基上,菌株Ⅱ不能存活。(5)酵母菌无氧呼吸生成酒精,场所为细胞质基质。菌株Ⅲ和Ⅳ均能水解纤维素产生酒精,两组进行对比,菌株Ⅲ的纤维素酶流失多,菌株Ⅳ因导入A基因片段使得纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,酶的利用率更高。
考点2　基因工程的应用与蛋白质工程
1.(2019天津理综,9,12分)B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如下实验。 据图回答:(1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中　　　    (单选)。A.含B基因的染色体缺失B.DNA聚合酶失活C.B基因发生基因突变D.B基因的启动子无法启动转录
(2)从水稻体细胞或　　　    中提取总RNA,构建　　　    文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建重组表达载体。(3)在过程①、②转化筛选时,过程　　　    中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程    　　    在培养基中应加入卡那霉素。(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是　　　    (多选)。A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明　　　    　　　　　　　　　　　　　　　　    。
答案　(共12分)(1)D　(2)精子　cDNA　(3)②　①　(4)BCD　(5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
解析　(1)B基因的启动子无法启动转录,会导致B基因在水稻卵细胞中不转录。(2)利用水稻体细胞或精子中提取的总RNA,经逆转录法构建的基因文库为cDNA文库。(3)过程①需将基因表达载体导入农杆菌,所以可在培养基中加入卡那霉素以筛选成功导入了基因表达载体的农杆菌。过程②农杆菌感染水稻愈伤组织,农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到受体细胞染色体DNA上。(4)水稻细胞中本来就有B基因,正常植株也会出现杂交带,故A错误;B、D选项是检测Luc基因及其产物,B、D正确;C选项检测对象是卵细胞中mRNA,正常水稻植株卵细胞中无B基因的mRNA,C正确。(5)一般情况下,水稻卵细胞在未受精时不能发育成胚,而转基因植株未受精的卵细胞能发育成胚,说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。
素养解读　本题借助基因工程相关知识,考查考生运用所学知识对某些生物学问题进行推理、解释,并作出合理判断或得出正确结论的能力;试题通过B基因表达对卵细胞的影响考查了科学思维素养中的演绎与推理要素。
2.(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。 (1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取　　　    合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。 (2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体,需要选择的启动子是　　　    (填写字母,单选)。A.人血细胞启动子　　　B.水稻胚乳细胞启动子C.大肠杆菌启动子　　　D.农杆菌启动子
(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中,需添加酚类物质,其目的是　　　　　　　　　    　　　　　　　　　　　    。(4)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比,选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。(5)为证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与　　　    的生物学功能一致。
答案　(1)总RNA(或mRNA) (2)B(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物,具有膜系统,能对初始rHSA多肽进行高效加工(5)HSA
解析　本题主要考查基因工程的相关知识。(1)总cDNA是以mRNA为模板反转录合成的,所以需要提取人的总RNA或mRNA;PCR扩增的原理是DNA双链复制,DNA双链复制时,两条子链的延伸方向相反,所以引物的位置及方向如答案所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳细胞内特异性表达,需要选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)酚类物质可吸引农杆菌移向水稻受体细胞,使农杆菌Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,有利于目的基因成功转化。(4)大肠杆菌为原核生物,无内质网和高尔基体,不能对多肽进行高效加工,而水稻是真核生物,具有内质网和高尔基体,可对多肽链进行高效加工。(5)要证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与HSA的生物学功能一致。
素养解读　本题主要考查基因工程的相关知识,培养学生形成利用生物学概念解决问题的能力(体现了对生命观念、科学思维、社会责任素养的考查)
易错警示　注意PCR技术的原理是DNA双链复制,DNA双链复制时,两条母链分别作为模板,新合成的两条子链延伸的方向相反,由此确定引物的位置及扩增方向。
3.(2014天津理综,8,12分)嗜热土壤芽孢杆菌产生的β-葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶,为使其在工业生产中更好地应用,开展了以下实验: Ⅰ.利用大肠杆菌表达BglB酶(1)PCR扩增bglB基因时,选用　　　　　　　　　　    基因组DNA作模板。(2)上图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒,扩增的bglB基因两端需分别引入　　　　　    和　　　　　    不同限制酶的识别序列。(3)大肠杆菌不能降解纤维素,但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力,这
是因为　　　　　　　　　　　　　    。Ⅱ.温度对BglB酶活性的影响(4)据图1、2可知,80 ℃保温30分钟后,BglB酶会　　　    ;为高效利用BglB酶降解纤维素,反应温度最好控制在　　　    (单选)。A.50 ℃　　B.60 ℃　　C.70 ℃　　D.80 ℃ 
注:酶的热稳定性是酶在一定温度下,保温一段时间后通过其活性的保持程度来反映的Ⅲ.利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性
 在PCR扩增bglB基因的过程中,加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选,可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。(5)与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌相比,上述育种技术获取热稳定性高的BglB酶基因的效率更高,其原因是在PCR过程中　　　    (多选)。A.仅针对bglB基因进行诱变
B.bglB基因产生了定向突变C.bglB基因可快速累积突变D.bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变
答案　(1)嗜热土壤芽孢杆菌(2)NdeⅠ    BamHⅠ(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶(4)失活　B(5)A、C
解析　(1)BglB由嗜热土壤芽孢杆菌产生,故PCR扩增bglB基因时,应选用嗜热土壤芽孢杆菌基因组DNA作模板。(2)目的基因在与质粒连接时,需连接在启动子和终止子之间,且所用限制酶不能破坏启动子、终止子和标记基因,所以切割质粒应选用NdeⅠ和BamHⅠ两种酶,则扩增的bglB基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种酶的识别序列。(3)转基因大肠杆菌含有的bglB基因表达,合成了耐热的纤维素酶,所以其获得了降解纤维素的能力。(4)由图2可知,80 ℃保温30分钟后,BglB酶的相对活性为0,所以此时该酶失活;由图1可知:60 ℃~70 ℃时BglB酶的相对活性最高。70 ℃时,该酶活性易降低,所以为高效利用BglB酶降解纤维素应最好将温度控制在60 ℃。(5)在PCR扩增bglB基因时加入诱变剂仅对该基因进行诱变,可快速累积突变,但诱发基因突变时,突变仍是不定向的,且突变的结果可以改变酶中氨基酸的数目。故A、C正确,B、D错误。
B组　统一命题、省(区、市)卷题组
考点1　基因工程的工具与操作程序
1.(2019江苏单科,16,2分)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不会遗传给子代的是 (　　)A.将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌,筛选获得基因工程菌B.将花青素代谢基因导入植物体细胞,经组培获得花色变异植株C.将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵,培育出产低乳糖牛乳的奶牛D.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗
答案    D　本题以基因工程为信息载体,考查考生运用所学知识,对某些生物学问题进行解释、推理得出正确结论的能力;试题通过基因工程技术遗传性分析,体现了对科学思维素养中的分析与判断要素的考查。胰岛素基因表达质粒导入大肠杆菌,获得的工程菌可将胰岛素基因遗传给子代,A不符合题意;B、C培育的转基因植物和转基因动物的每个细胞均含有目有基因,后代可表现转基因性状,B、C不符合题意;将转入目的基因的淋巴细胞回输患者体内后,患者的生殖细胞不含目的基因,故子代不表现转基因性状,D符合题意。
2.(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是 (　　)  图1　酶切位点图  图2　电泳结果示意图A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图2中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案    D　图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道①②电泳结果知,泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。
3.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。 下列操作与实验目的不符的是 (　　)A.用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
答案    C    本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoR Ⅰ的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoR Ⅰ和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。
4.(2019江苏单科,33,8分)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:  图1(1)EcoR Ⅴ酶切位点为 ,EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为　　　    末端。(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为　　　　    的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在　　　    酶作用下,形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是　　　    (填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是　　　　　　　    、　    　　　　　　　    。
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是　　　    。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是　　　　　　　　    。 
图2
答案　(8分)(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA连接　(3)B　A类菌落含有P0　C类菌落未转入质粒　(4)乙丙　目的基因反向连接
解析　本题借助基因工程相关知识,考查考生从表格、图形等提取信息并运用这些信息解决相关问题的能力;通过构建重组质粒的过程图示和菌落生长情况分析等体现了科学思维素养中的演绎与推理要素。(1)EcoRⅤ从识别序列的中心轴线处切割,所以产生的末端为平末端。(2)由于载体和目的基因要连接成DNA分子,所以目的基因片段的两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸时,载体P1的两端应各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸。在DNA连接酶的作用下,可将P2和目的基因连接,形成重组质粒P3。(3)重组质粒P3上有完整的氨苄青霉素基因,所以含有重组质粒P3的菌落在无抗生素和添加氨苄青霉素的培养基上能生长,而在添加四环素的培养基上不能生长,所以应选择的是B类菌落。A类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素+四环素的培养基上均能生长,说明A类菌落导入了P0。C类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素+四环素的培养基上均不能生长,说明C类菌落未导入质粒。(4)选择的一对引物组合、目的基因与重组质粒的连接方向及扩增片段长度的可能情况如表:
由表可知,PCR鉴定时应选择的一对引物是乙丙。若扩增出了400 bp片段,则原因是目的基因反向连接。
知能拓展　PCR过程中,目的基因扩增n次,共产生2n个DNA,其中1个DNA上含引物Ⅰ,1个DNA上含引物Ⅱ,2n-2个DNA既含引物Ⅰ,也含引物Ⅱ。该过程共需要2n-1个引物Ⅰ和2n-1个引物Ⅱ。
5.(2018课标全国Ⅰ,38,15分)回答下列问题:(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了    　　　　　　    　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    (答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的　　    方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与　　　　　　　    组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是　        。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用　　　　　　    的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加　　　    的抑制剂。
答案　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化    外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
解析　本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。
知识归纳    目的基因导入受体细胞的方法(1)若受体细胞为植物细胞:基因枪法、花粉管通道法、农杆菌转化法。(2)若受体细胞为动物细胞:显微注射法。(3)若受体细胞为大肠杆菌:感受态细胞法。
6.(2016课标全国Ⅲ,40,15分)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。  图(a)  图(b)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　    酶切后的产物连接,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　    ,不能表达的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　     。  图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有　　　　　　和　　　　　　　,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)Sau3A Ⅰ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(每空2分,共4分)　(2)甲和丙(2分)　甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(3分,其他合理答案可酌情给分)　(3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶(每空2分,共6分,其他合理答案可酌情给分)
解析　(1)分析图(a)可知,限制酶Sau3A Ⅰ与BamH Ⅰ切割DNA后形成的黏性末端相同,故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时,为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达,目的基因应插入在启动子和终止子之间,据此可判断甲、丙均不符合要求,目的基因均不能被转录。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶,其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
7.(2016江苏单科,33,9分)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题:
 
图1
  图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用　　　　　　　    两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过　　　    酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒,需将其转入处于　　　    态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加　　　    ,平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中　　　　　　　    。(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列为    
　　　　　　　    ,对于该部位,这两种酶　　　    (填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得　　　    种大小不同的DNA片段。
答案　(9分)(1)Bcl Ⅰ和HindⅢ　连接　感受(2)四环素　引物甲和引物丙(3)T GATC C A CTAG G 　都不能(4)7
解析　本题主要考查基因工程的相关知识。(1)分析4种限制酶识别的序列可知:BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ识别序列中含有Sau3A Ⅰ的识别序列,这三种酶切割DNA后可以产生相同的黏性末端。为保证质粒上含有标记基因,切割质粒时不能选用BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ,应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶切割;酶切后的载体和目的基因片段,需用DNA连接酶连接形成重组质粒,为了扩增重组质粒,需将其转入处于感受态的大肠杆菌中。(2)重组质粒中四环素抗性基因结构完整,氨苄青霉素抗性基因结构被破坏,在筛选平板培养基中添加四环素可以筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌。PCR扩增目的基因时,需用引物甲和引物丙两种引物。(3)BamH Ⅰ酶切产生的黏性末端为 ,Bcl Ⅰ酶切产生的黏性末端为 ,经DNA连接酶连接后,连接部位的6个碱基对序列为 ,此序列不能被BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ识别,因此不能被两种酶切开。(4)图1质粒中含有Sau3A Ⅰ酶的3个识别序列,如图:(A、B、C分别表示相邻切点间的DNA片段)
 用Sau3AⅠ酶切,若在一个切点处切割可得到:B+C+A、C+A+B、A+B+C三种DNA片段(但其大小相同),若在两个切点处切割可得到:A、B+C、A+C、B、A+B、C六种DNA片段(其大小均不同);若在三个切点处均切割,可得到A、B、C三种大小不同的DNA片段,综上所述,用Sau3AⅠ酶切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
疑难突破　准确识别BamH Ⅰ酶和Bcl Ⅰ酶识别序列中含有Sau3A Ⅰ酶的识别序列是准确解答本题的关键。注意第(4)小题,Sau3A Ⅰ酶可能打开1个切点、2个切点和3个切点三种情况。
8.(2015福建理综,33,10分)GDNF是一种神经营养因子,对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示),并导入到大鼠神经干细胞中,用于干细胞基因治疗的研究。请回答:  图1
  图2(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中,使用胰蛋白酶的目的是　　　　　    。(2)构建含GDNF基因的表达载体时,需选择图1中的    限制酶进行酶切。(3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接,连接产物经筛选得到的载体主要有3种:单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式,选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切,并对酶切后的DNA片段进行电泳分析,结果如图2所示。图中第　　　    泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后,为了检测GDNF基因是否成功表达,可用相应的
　　　    与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定密度时,需进行　　　    培养以得到更多数量的细胞,用于神经干细胞移植治疗实验。
答案　(1)使细胞分散开　(2)Xho Ⅰ　(3)②　(4)抗体　传代
解析　(1)因动物细胞体外培养时有接触抑制现象,故需用胰蛋白酶处理动物组织,使细胞分散开。(2)目的基因两端及载体DNA分子中均有Xho Ⅰ酶识别的核苷酸序列,故构建基因表达载体时,应用Xho Ⅰ酶切割DNA分子。(3)图示可知载体中酶Hpa Ⅰ与Xho Ⅰ切割点距离为100 bp,GDNF基因切割成600 bp和100 bp两种DNA片段,由正向连接的重组载体中GDNF基因方向与Hpa Ⅰ、Xho Ⅰ酶切割结果可知,正向连接的重组载体被酶Hpa Ⅰ和酶Xho Ⅰ切割后,将得到6 000 bp和700 bp两种DNA片段,即为②。(4)可用抗原—抗体杂交技术,对目的基因是否表达进行检测。当培养液中的细胞达到一定密度后,可分瓶进行传代培养,以获得更多数量的细胞。
考点2　基因工程的应用与蛋白质工程
1.(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的α-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656个碱基对),利用基因工程大量制备α-淀粉酶,实验流程见图。请回答下列问题: (1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前,需先获得细菌的　　　　　　    。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的　　　    端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是　　　　　　　　　　　    　　　　　　　　　　　    。(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中　　    的设定与引物
有关,　　　    的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)①变性温度　②退火温度　③延伸温度　④变性时间⑤退火时间　⑥延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列:5'-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU……-3'图中虚线框内mRNA片段包含　　　　    个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有　　　    种。(5)获得工程菌表达的α-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如下:
根据上述实验结果,初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为　　　　　　　　　　　　　    　　　　　　　　　    。
答案　(1)基因组DNA　(2)5'　使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连　(3)②　⑥　(4)8　13　(5)pH为8.5,缓冲液为50 mmol/L Tirs-HCl
解析　(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有α-淀粉酶基因,因此在扩增α-淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。(2)由于引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,是与引物的3'端相连的,由此确定需在引物的5'端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体,防止自身相连。(3)进行PCR扩增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA上5'端为AUG(起始密码子),因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基,可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子的第一个碱基已经固定为U,因此还有2个碱基未知,共可能有的种数为4×4=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数据可知:α-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条件下相对活性为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。
2.(2018海南单科,31,15分)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质,科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞,得到了转基因植株。回答下列问题:(1)用农杆菌感染时,应优先选用黄瓜　　　　    (填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养,选用这种叶片的理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    　　　　　    。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白,则表明该重组质粒中　　　　　　    已转移到植物细胞中且能够表达;用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交,发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1,则说明甜蛋白基因已经整合到　　　　　    (填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产,若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗,应选用　　　    作为外植体进行组织培养。(4)通常,基因工程操作主要有4个步骤,即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此,基因工程的含义可概括为         　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。
答案　(15分)(1)受伤的　叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质, 可吸引农杆菌移向这些细胞　(2)甜蛋白基因　核基因组　(3)茎尖　(4)按照人们的愿望进行设计,并通过体外重组和转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出符合人们需要的新生物类型
解析　(1)用农杆菌感染时,应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养,理由是叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质,可吸引农杆菌移向这些细胞。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白,则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达;用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交,发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1,则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产,若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗,应选用茎尖作为外植体进行组织培养。(4)通常,基因工程操作主要有4个步骤,即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此,基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计,并通过体外重组和转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出符合人们需要的新生物类型。
3.(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题: (1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过　　    获得　　　    用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物
中需要增加适当的　　　　　　　　    位点。设计引物时需要避免引物之间形成　　　    　　    ,而造成引物自连。(3)图中步骤1代表　　　    ,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏　　　　　　    的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但　　　　　　    的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有　　　    (填序号:①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。
答案　(1)逆转录　cDNA　(2)限制性核酸内切酶　碱基互补配对　(3)变性　(4)引物与模板　GC含量高　(5)②③
解析　本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。
知识归纳　关于引物的几个问题:①引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为20~30个核苷酸。②由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程即题中的退火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有二者结合后才有可能进行“延伸”。③结合DNA的结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键,可知引物中含碱基不同则耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。
4.(2017课标全国Ⅰ,38,15分)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    　　　　　　　　    。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用　　    作为载体,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有　　    　　　　　　　    (答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是　　　　　　　　　    (填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是　　   　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。 
答案　(1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养(4)蛋白A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析　本题主要涉及基因文库与cDNA文库的差异、基因工程的步骤、基因工程产物的检测方法等知识,意在考查考生提取知识、分析和归纳知识的能力。 (1)真核生物和原核生物的基因结构不同,真核生物的基因中存在内含子等不能编码蛋白质的序列,原核生物的基因中不存在内含子。真核生物在基因表达时,转录出的RNA需要将内含子对应的RNA序列切除后才可进行翻译。从人的基因组文库中获得的基因 A 中含有内含子,而作为原核生物的大肠杆菌不能切除内含子对应的RNA序列,故基因 A 在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。 (2)病毒对宿主细胞的侵染具有特异性,噬菌体是专门侵染细菌的病毒,不能侵染家蚕细胞,故可选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。 (3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点,因此在基因工程中常用原核生物作为受体细胞。(4)检测基因A 是否翻译出蛋白A,一般用抗原—抗体杂交的方法,即用蛋白 A 的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交,观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是 S型菌的 DNA 进入 R 型菌体内,并可在 R 型菌体内完成表达,这证明了 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,为基因工程奠定了理论基础。
5.(2015江苏单科,32,9分)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体,图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题:  图1 
图2
(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是　　　    。(2)图1中启动子是　　　    酶识别和结合的部位,有了它才能启动目的基因的表达;氨苄青霉素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有　　　　　　　　　　　　　    。(4)β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于　　　　　　　　　　　　　　　　　    。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链,且β-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为　　　　　　　　　　　　　　　　    　　　　　　　　　　    。(6)根据图2中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是 　　　　　　　　　　　　   ,理由是 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   。
答案　(1)终止子 (2)RNA聚合　作为标记基因,将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来(3)限制酶和DNA连接酶(4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解(5)β-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸,而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸(6)至少2个　两条肽链的一端各有一个游离的氨基,氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基
解析　(1)完整的基因表达载体应包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等,图1中没有标注出终止子。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动转录出mRNA;氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,可利用含氨苄青霉素的培养基筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体需用限制酶分别切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶将两者连接形成重组质粒。(4)利用β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达的意义是将胰岛素肽链上的蛋白酶切割位点隐藏在β-半乳糖苷酶内部,从而防止胰岛素A链或B链被大肠杆菌体内的蛋白酶降解。(5)根据溴化氰的作用特点可知,溴化氰可将β-半乳糖苷酶切成多个肽段,但不会切割胰岛素A、B链,这与肽链中含有的甲硫氨酸数量有关。(6)由于每条肽链的一端都含有一个游离的氨基,所以蛋白质分子中游离氨基的数量=肽链数+R基上游离氨基数,故可推测胰岛素(由A、B链组成)至少含有2个游离的氨基。
6.(2015四川理综,9,11分)将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中,可获得抗棉铃虫的转基因棉,其过程如下图所示(注:农杆菌中Ti质粒上只有T-DNA片段能转移到植物细胞中)。 质粒中“Bt”代表“Bt基因”,“KmR”代表“卡那霉素抗性基因”(1)过程①需用同种　　　　　　　    酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来,应使用　　　    培养基。(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养,旨在让　　　    进入棉花细胞;除尽农杆菌后,还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养,目的是　　　　　　　　　　　　　　    。(3)若过程④仅获得大量的根,则应在培养基中增加　　　　　　　    以获得芽;部分接种在无激素培养基上的芽也能长根,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。
(4)检验转基因棉的抗虫性状,常用方法是　　　　　　    。种植转基因抗虫棉能减少　　        的使用,以减轻环境污染。
答案　(1)限制性核酸内切(1分)　选择(1分)(2)T-DNA(1分)　筛选获得T-DNA片段的植物细胞(2分)(3)细胞分裂素浓度(1分)　芽顶端合成的生长素向基部运输,促进根的分化(2分)(4)投放棉铃虫(2分)　农药(1分)
解析　本题考查基因工程与植物细胞工程的相关知识。(1)同种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA,可获得相同的黏性末端,以构建基因表达载体。重组质粒含完整的卡那霉素抗性基因,故应使用含卡那霉素的选择培养基筛选含重组质粒的农杆菌。(2)实验过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养,其目的是利用含重组质粒的农杆菌将T-DNA导入棉花细胞中。除去农杆菌后在含卡那霉素的培养基上培养,其目的是筛选出含有目的基因的棉花细胞。(3)培养基中生长素用量与细胞分裂素用量比值高时,利于根的分化,抑制芽的形成,反之,有利于芽的分化,抑制根的形成。因芽顶端可合成生长素,故接种在无激素的培养基上的芽也能长根。(4)可用投放棉铃虫的方法检测抗虫棉的抗虫效果。转基因抗虫棉的种植可减少农药使用量,从而减轻环境污染。
C组　教师专用题组
1.(2014广东理综,25,6分)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示,下列叙述正确的是(双选) (　　) A.过程①需使用逆转录酶B.过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因C.过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备D.过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
答案    AD　由mRNA形成cDNA需要逆转录酶,A正确;②过程需要使用限制酶和PCR技术获得并扩增目的基因,B错误;过程③使用的感受态细胞可用CaCl2溶液制备,C错误;工程菌是指用基因工程方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系,所以过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞,D正确。
2.(2014重庆理综,2,6分)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述,错误的是 (　　)A.应严格选择转基因植物的目的基因,避免产生对人类有害的物质B.当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验,但不反对治疗性克隆C.反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿D.生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
答案    D　在获得转基因植物时,要严格选择目的基因,避免产生对人类有害的毒性蛋白或过敏蛋白等物质,A正确;当今社会的普遍观点是禁止有关人类的生殖性克隆,但不反对治疗性克隆,B正确;反对设计试管婴儿的原因之一是有人将此技术用于设计婴儿性别,C正确;生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂及经过基因重组的致病菌等,干扰素不属于生物武器,D错误。
3.(2014重庆理综,4,6分)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述,正确的是 (　　)  
A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B.③侵染植物细胞后,重组Ti质粒整合到④的染色体上C.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就表现出抗虫性状D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
答案    D　②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶参与,A错误;③侵染植物细胞后,通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞并整合到④的染色体上,B错误;④的染色体上含有目的基因(抗虫基因)但不一定表达,C错误;基因工程依据的原理是基因重组,基因重组属于可遗传变异,D正确。
A组　2017—2019年高考模拟·考点基础题组
考点1　基因工程的工具与操作程序
1.(2019江西重点中学盟校一模,38)回答下列与基因工程有关的问题:(1)基因工程技术中,　　　　　　　    是将目的基因导入植物细胞最常用的方法,其中的Ti质粒上的T-DNA是指　　　　　　　　　　　    。(2)获得的目的基因可利用PCR技术在体外反应体系中扩增,该过程利用的原理是　　　　    　　    ,需要加入的原料是　　　　　　　    ,DNA解旋利用的是　　　    原理。(3)基因工程中使用的载体,除质粒外,还有　　　　　　    和　　　　　　　　　　　    。(4)该技术可以培育抗病转基因植物,也可用于动物的基因治疗。与之相比,单克隆抗体也用于诊断或携带药物治疗癌症,这是利用了它　　　　　　　　　　　    的优点。
答案　(1)农杆菌转化法　可转移的DNA(2)DNA双链复制　四种脱氧核苷酸(或dATP、dTTP、dCTP和dGTP)　热变性(或高温变性等类似意思)(3)λ噬菌体的衍生物　动植物病毒(该两空可调换)(4)特异性强、灵敏度高
解析　(1)将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法,其中的Ti质粒上的T-DNA是指可转移的DNA。(2)PCR技术的原理是DNA双链复制。PCR的原料是dATP、dTTP、dCTP和dGTP。DNA解旋利用的是热变性原理,即DNA受热变性(或高温变性)后解链为单链。(3)基因工程中使用的载体,除质粒外,还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(4)单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的优点,可用于诊断或携带药物治疗癌症。
知识拓展　基因工程中的载体可以根据其来源分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等,可以根据它们的主要用途分为克隆载体与表达载体,还可以根据它们的性质分为温度敏感型载体、融合型表达载体、非融合型表达载体等。
2.(2019广东肇庆二模,38)含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶,这两种酶对DNA分子有相同的作用序列,但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰,使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题:(1)目前,基因工程中使用的　　　　　　　    主要是从原核生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是　　　　　　　　　    (填“基因组文库”“cDNA文库”或“基因组文库和cDNA文库”。(2)含有某种限制酶的细胞,可以利用该限制酶切割外源DNA,但不破坏细胞自身的DNA,其原因可能有①　　　　　　　　　　　　　　　　    ;②　　　　　　　　　　　　　　　    　　　    。(3)利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90~95 ℃)、低温复性(55~60 ℃)、适温延伸(70~75 ℃)三个步骤构成一个循环,为使得　　　　　　　　　　    酶能够重复利用,选用的酶应在90~95 ℃处理后仍然具备催化活性。(4)在PCR扩增目的基因时,为实现序列中的腺嘌呤被放射性同位素标记,反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的　　　　    (填“腺嘌呤核糖核苷酸”“dATP”或“ATP”)。
答案　(1)限制酶(或限制性核酸内切酶)　基因组文库和cDNA文库　(2)①细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列　②甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰　(3)热稳定DNA聚合(Taq)　(4)dATP
解析　(1)基因工程中的限制酶是从原核生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中都需要利用DNA连接酶将DNA片段与载体连接导入受体菌群而获得,只不过两者使用的DNA片段不同,cDNA文库是利用反转录法获得的DNA(部分基因),基因组文库使用的是某种生物的全部基因。(2)原核细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列或者甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰,这使含有某种限制酶的原核细胞,可以利用该限制酶切割外源DNA,但不破坏细胞自身的DNA。(3)PCR扩增目的基因的三个步骤是高温变性(90~95 ℃)、低温复性(55~60 ℃)和适温延伸(70~75 ℃),该过程使用的DNA聚合酶需是热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。(4)在PCR扩增目的基因使用的是dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
知识拓展　基因组文库和cDNA文库的区别:对于真核生物来说,基因组文库包含了这种生物体内的所有基因(包括外显子、内含子和非编码区),而cDNA文库只是包含了所有基因中的一部分,因为cDNA文库来源于这种生物体内的mRNA反逆转录,而mRNA实质上来源于外显子的转录,它不包括内含子和非编码区。对于原核生物来说,基因组文库包含了这种生物体内的所有基因(包括编码区和非编码区),而cDNA文库只是包含了其中的一部分,因为cDNA文库来源于这种生物体内的mRNA的反转录,而mRNA实质上来源于编码区的转录,它不包括非编码区。
3.(2019安徽黄山二模,38)反义基因是通过产生的mRNA分子,与相关基因产生的mRNA进行互补,来阻断非正常蛋白质合成。图1为不同的限制酶及相应的切割位点。图2为科学实验中利用小分子量的A反义基因的实例。据图回答下列问题: (1)基因工程中,A基因可以用　　　　　    (仪器)合成,利用该仪器还可以合成　　　    等。若想将图2中的A基因反向连接到结构甲中,应该用　　　　　　　    限制酶切割A基因和结
构甲。DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,　　　　　　　    可以“缝合”平末端和黏性末端。(2)用含A反义基因的农杆菌感染植物细胞的原生质体后,可用含有　　　    的培养基进行筛选。培养一段时间后,在高浓度的蔗糖溶液中,观察细胞　　　　　　　　     来鉴别细胞壁是否再生。(3)导入的A反义基因能转录A反义RNA,且能与正常RNA互补,抑制A基因表达过程中的　    　    。
答案　(1)DNA合成仪　引物(或探针)    EcoRⅠ、BamHⅠ　T4 DNA连接酶(2)抗生素　是否发生质壁分离(3)翻译
解析　(1)基因工程中,利用化学方法人工合成目的基因常使用的仪器是DNA合成仪,利用该仪器还可以合成引物(或探针)等。A基因和结构甲都有EcoRⅠ和BamHⅠ的切割位点,切割A基因,不破坏目的基因,切割结构甲不破坏标记基因,故将图2中的A基因反向连接到结构甲中,应该用EcoRⅠ或BamHⅠ限制酶切割A基因和结构甲。T4 DNA连接酶可以“缝合”平末端和黏性末端。(2)结构甲中含有抗生素抗性基因,用含A反义基因的农杆菌感染植物细胞的原生质体后,可用含有抗生素的培养基进行筛选。培养一段时间后,在高浓度的蔗糖溶液中,观察细胞是否发生质壁分离来鉴别细胞壁是否再生。(3)基因的表达分为转录和翻译,翻译是以mRNA作为模板,氨基酸为原料合成蛋白质的过程,导入的A反义基因能转录A反义RNA,且能与正常RNA互补,使其不能提供翻译模板,故抑制A基因的翻译。
4.(2019天津一中4月考,10)Bt基因是苏云金芽孢杆菌的基因,因其表达产物Bt毒蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。如图为培育转Bt基因抗虫棉幼苗的基本操作过程。 (1)Bt基因可从构建的Bt基因组文库中获取,也可以从其cDNA文库中获取,从前者获取的Bt基因　　　    (填“含有”或“不含有”)启动子。(2)若利用PCR技术从cDNA文库中获取Bt基因(基因序列未知)。需根据Bt毒蛋白中的氨基酸序列设计引物,引物的序列可以有多种,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    　　　　　　　　　　　    。在PCR体系中需加入其中的　　　    (填“全部”“任意1种”或“其中2种”)引物。若Bt基因序列已知,则引物的序列通常为　　　    种。(3)在构建基因表达载体的过程中,为了方便筛选含有目的基因的细胞,作为运载体的Ti质检应
含有　　　    ,Ti质粒中能帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列数称为　　　    。
答案　(1)含有(2)一种氨基酸可能有多种密码子,氨基酸序列对应的DNA碱基序列就会有多种　全部　2(3)标记基因　T-DNA(可转移DNA)
解析　(1)Bt基因是目的基因。提取目的基因时,可以从构建的Bt基因组文库中获取。基因组文库包含了一种生物的全部基因,所以通过此途径获得的基因含有启动子。(2)利用PCR技术扩增目的基因时,引物与DNA单链通过碱基互补配对原则结合形成互补序列,然后在DNA聚合酶的作用下延伸。根据Bt蛋白的氨基酸序列设计引物,首先要依据基因的表达过程推知基因的碱基序列。由于一种氨基酸可能有多种密码子,因此所推对应的DNA碱基序列就会有多种,即设计的引物序列可以有多种。在PCR体系中需加入设计的全部引物。若Bt基因序列已知,则引物的序列通常为2种。(3)标记基因的作用是鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞;T-DNA(可转移DNA)的作用是帮助目的基因整合到宿主细胞染色体DNA上。
5.(2019天津部分区县一模,9)科学家们发现长年生活在寒带的比目鱼不怕冻,因为比目鱼的身体里有一种抗冻蛋白质(AFP)。科学家将比目鱼的抗冻蛋白质基因转移到番茄里,培育出了抗冻番茄,这种番茄可以在冬季或较寒冷的地区种植,使得人们一年到头都能吃到番茄。下图为抗冻番茄的培育过程。据图回答: (1)①过程为　　　　　　　　　    ,重组质粒除了含有目的基因外,还必须有　　　　　　    　　　　　　    、复制原点。(2)②过程常采用农杆菌转化法将AFP基因导入番茄细胞,除此之外,还可利用　　　　    法(答出一种即可)。③过程应用的主要技术是　　　　　　　　    。(3)若AFP基因已表达出抗冻蛋白,还需要进行个体水平的检测,如通过　　　　　　　　　    　　　　　    ,以确定抗冻番茄植株是否具有抗寒特性。
答案　(1)基因表达载体的构建　启动子　终止子　标记基因(2)基因枪(花粉管通道)　植物组织培养(3)低温处理并观察番茄的抗冻情况
解析　①过程是将AFP基因与Ti质粒结合形成重组质粒的过程,属于基因表达载体的构建,为了使目的基因在受体细胞内稳定存在且能够表达,重组质粒除了目的基因外,还必须有启动子、终止子、标记基因和复制原点。(2)将目的基因导入到植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法;③过程是将含目的基因的番茄细胞诱导发育为转基因植株的过程,利用了植物组织培养技术。(3)若需从个体水平检测抗冻番茄植株是否具有抗寒特性,可以通过低温处理并观察番茄的抗冻情况进行判断。
考点2　基因工程的应用与蛋白质工程
1.(2019河北石家庄一模,38)干扰素可以用于治疗病毒感染和癌症,但在体外保存相当困难。如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸,那么,在-70 ℃条件下可以保存半年,这需要利用蛋白质工程来完成。请回答下列问题:(1)天然蛋白质的合成过程是按照　　　　　　    进行的,而蛋白质工程与之相反。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过　　　　　　　　    ,对现有蛋白质进行改造,或制造新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需要。(2)若将干扰素的一个半胱氨酸变成丝氨酸,推测相应的脱氧核苷酸序列　　　    (填“是”或“不是”)唯一的。可利用PCR技术扩增相应基因,该技术的前提是要有一段　　　　　　    　    ,以便根据这一序列合成引物。(3)科学家在基因工程和蛋白质工程中常用大肠杆菌作为受体细胞,原因是　　　　　　　    　　　　　    (答出两点即可)。大肠杆菌常用的转化方法是首先用　　　    处理后成为　    　    细胞,再与重组表达载体溶于缓冲溶液中完成转化。(4)干扰素基因是否翻译出蛋白质,可用　　　　　　　    (物质)进行检测。
答案　(1)中心法则　基因修饰或基因合成　(2)不是　已知目的基因的核苷酸序列　(3)繁殖快,多为单细胞,遗传物质相对较少　Ca2+　感受态　(4)(干扰素)抗体
解析　(1)天然蛋白质的合成过程是按照中心法则中转录和翻译过程进行的,而蛋白质工程与之相反。根据蛋白质工程的概念可知,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需要。(2)由于丝氨酸由多种密码子来决定,因此通过题述方法获得的脱氧核苷酸序列不是唯一的。在PCR技术中扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。(3)原核生物作为基因工程中的受体细胞的原因有繁殖快、多为单细胞、容易培养、遗传物质相对较少等,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是首先用Ca2+处理细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体溶于缓冲液中,与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子(重组表达载体),完成转化过程。(4)检测干扰素的基因是否表达,可用抗原—抗体杂交的技术进行检测,即用(干扰素的)抗体进行检测。
题后悟道　蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程,因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质,必须通过基因修饰或基因合成实现。
2.(2019福建泉州一模,38)干扰素是一类几乎能抵抗所有病毒的糖蛋白,可利用基因工程技术进行制备。请回答:(1)利用mRNA的反转录产物可构建　　　　　　　    文库,进而获得干扰素目的基因,该文库不同于基因组文库的特点是  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  (答出两点)。(2)将干扰素目的基因导入大肠杆菌实现转化时,首先应用　　　    处理大肠杆菌,使之处于    　　    态。大肠杆菌刚表达出的干扰素一般没有活性,原因是　　　　　　　    。(3)利用基因工程生产的干扰素在体外往往不易保存,可通过　　　    工程对其进行改造以延长保存时间。
答案　(1)cDNA(或部分基因)　文库较小、基因中没有启动子、基因中没有内含子、只含有某种生物的部分基因、全部基因可在物种间进行交流　(2)CaCl2(Ca2+)　感受　大肠杆菌没有内质网、高尔基体等细胞器,不能对翻译后的蛋白质进行加工　(3)蛋白质
解析　(1)部分基因文库是利用细胞内的mRNA反转录形成的基因构成的,只含有该生物的部分基因,故部分基因文库比较小,另外cDNA文库是由反转录形成的,故基因中无启动子、内含子等序列。(2)大肠杆菌作为受体细胞时,因其为微生物,故需要采用钙离子处理大肠杆菌,让其处于感受态。大肠杆菌是原核生物,没有内质网、高尔基体等复杂的细胞器,无法对干扰素进行加工,故其刚表达的蛋白质一般没有生物活性。(3)蛋白质工程可以根据人们的预期对基因进行改造,从而生产出符合人们需要的蛋白质,对于不易保存的干扰素,可以采用蛋白质工程进行改造。
B组　2017—2019年高考模拟·专题综合题组时间:45分钟　分值:95分一、选择题(每题5分,共20分)
1.(2019天津和平一模,1)运用现代生物技术的育种方法,将抗菜青虫的Bt毒蛋白基因转移到优质油菜中,培育出转基因抗虫的油菜品种,这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白,对菜青虫有显著抗性,能减轻菜青虫对油菜的危害。下列叙述错误的是 (　　)A.转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt毒蛋白基因B.目的基因的受体细胞可以是油菜受精卵,也可以是其体细胞C.转基因抗虫油菜的种植过程中减少了农药等的使用,降低了生产成本D.转基因抗虫油菜种植时,菜青虫不会产生抗性,可以彻底消灭菜青虫
答案    D　基因控制生物的性状,将抗菜青虫的Bt基因转移到油菜中,培育出的转基因抗虫油菜能产生特异的杀虫蛋白,对菜青虫有显著抗性,表明转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于其细胞内具有Bt基因,A正确。转基因油菜的培育利用了基因工程和植物组织培养技术,目的基因可以导入油菜受精卵,也可以导入其体细胞,B正确。转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白具有抗虫效果,减少了农药的使用,降低了生产成本,保护了环境,C正确。基因突变具有不定向性,转基因抗虫油菜种植时,菜青虫体内可能原来就存在抗性基因,种植的转基因油菜可以对菜青虫进行筛选,具有抗性基因的菜青虫得以存活,故不可能达到彻底消灭菜青虫的目的,D错误。
2.(2019天津河北一模,6)SOD是一种抗氧化酶,它能催化O2形成H2O2,增强植物的抗逆性。如图为培育农作物新品种的一种方式,以下叙述正确的是 (　　)植物细胞(二倍体) 新细胞 愈伤组织 胚状体 新品种A.该育种方式利用了细胞工程和基因工程,能体现细胞的全能性B.①过程中最常用的方法是采用显微注射技术将SOD基因导入植物细胞C.②、③分别表示脱分化、再分化过程,均无需严格的无菌操作就可以完成D.利用植物组织培养生产SOD时,必须选取茎尖或叶尖细胞进行培养
答案    A    SOD基因是目的基因,图中①表示利用基因工程技术将目的基因导入受体细胞的过程;②、③表示植物组织培养过程,其原理是植物细胞具有全能性。该育种方式利用了细胞工程和基因工程,A正确。①过程中最常用农杆菌转化法将SOD基因导入植物细胞,B错误;②、③分别表示脱分化、再分化过程,均需要在严格的无菌条件下完成,C错误;脱毒要选取植物分生区附近(如茎尖)细胞进行组织培养,利用植物组织培养生产SOD时,不用必须选取茎尖或叶尖细胞进行培养,D错误。
3.(2019天津和平一模,4)蓝藻拟核DNA上有控制叶绿素合成的ch1L基因。某科学家通过构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞,以研究ch1L基因对叶绿素合成的控制,技术路线如图所示。下列相关叙述错误的是 (　　) A.①②过程应使用不同的限制性核酸内切酶B.①②过程都要使用DNA连接酶C.终止密码子是基因表达载体的重要组成部分D.若操作成功,可用含红霉素的培养基筛选出该变异株
答案    C　①②过程切割的位点不同,限制性核酸内切酶具有特异性,因此应使用不同的限制性核酸内切酶,A正确。DNA连接酶可连接被限制性核酸内切酶切开的磷酸二酯键,使ch1L基因和红霉素抗性基因连接到重组质粒上,B正确。终止密码子在mRNA上,是使翻译终止的序列;终止子在DNA上,是使转录终止的序列,是基因表达载体的重要组成部分,C错误。变异株的ch1L基因中被插入红霉素抗性基因,红霉素抗性基因可作为标记基因,故可用含红霉素的培养基筛选变异株,D正确。
4.(2019天津和平二模,3)下列有关生物工程及其图解的叙述错误的是 (　　) A.基因工程除了需要图一所示的工具外,还需要两种工具酶B.图二中2、3、4可分别表示受精作用、早期胚胎培养和胚胎移植C.图三中将原肠胚的内细胞团均等分割有利于胚胎的恢复和进一步发育D.图四中动物细胞A和B到细胞C的过程,可用灭活的病毒作为诱导剂
答案    C　图一为质粒,可作为基因工程的运载体,此外基因工程还需要两种工具酶,即限制酶和DNA连接酶,A正确;图二中2表示体外受精过程,3表示早期胚胎培养,4表示胚胎移植,B正确;图三表示胚胎分割,将囊胚的内细胞团均等分割有利于胚胎的恢复和进一步发育,C错误;图四表示动物细胞融合过程,诱导动物细胞融合可用灭活的病毒作为诱导剂,D正确。
二、非选择题(共75分)
5.(2019广东湛江一模,38)(15分)科学家应用基因工程技术培育出抗冻烟草。(1)基因的基本组成单位是　　　　　　　　　　　    ,为了获取抗冻蛋白基因,可从含抗冻蛋白基因的生物细胞中提取对应的mRNA,在　　　　　　　    酶的作用下合成cDNA片段,该片段与抗冻蛋白基因的碱基序列　　　    (“相同”“不同”)。(2)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体,载体上除应含有复制原点、目的基因外,还应有　　　　　　　    、　　　　　　　    、　　　　　　　　　　　    。(3)将抗冻蛋白基因导入植物受体细胞常用的方法是　　　　　　　    ,目的基因导入受体细胞后,可通过　　　　　　　　　　　    技术培育获得转基因植物幼苗。
答案　(1)脱氧核糖核苷酸　逆转录　不同(2)标记基因　启动子　终止子(3)农杆菌转化法　植物组织培养
解析　本题借助抗冻烟草的生产考查知识的综合应用能力,考查科学思维和社会责任素养。(1)基因是有遗传效应的DNA片段,基因的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸,cDNA是通过反转录的方法,以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成DNA的,通过此方法合成的DNA中没有非编码区和内含子片段,与抗冻蛋白基因的碱基序列不同。(2)基因表达载体应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点五部分结构。(3)将目的基因导入植物受体细胞常用的方法是农杆菌转化法,通过植物组织培养技术获得转基因幼苗。
知识拓展　转化方法:若受体细胞是植物细胞,常用的转化方法是农杆菌转化法(双子叶植物),单子叶植物还用基因枪法和花粉管通道法。若受体细胞是动物细胞,一般用显微注射法,受体细胞是微生物用感受态细胞法。
6.(2019河南洛阳二模,38)(15分)草莓营养价值高且有保健功效,但却容易受到病毒的感染。科学家常采用两种方法培育新品种:其一,培育无病毒组培苗;其二,将草莓轻型黄边病毒的外壳蛋白基因(SMYELV-CP)导入草莓基因组中培育出转基因抗病毒草莓。请分析回答下列问题:(1)若培育无病毒组培苗,通常取植株的　　　　　　　    进行组织培养。(2)利用PCR技术扩增目的基因SMYELV-CP,其前提是　　　　　　　　　　　　　　　　    　　    ,以便根据这一序列合成引物。为维护pH基本不变,需要在PCR反应体系中加入　　    　　　　　　　　    。(3)重组载体上应含有特定的　　　    (填“复制原点” “启动子”或“标记基因”),它能被受体细胞的　　　　　　　　　    所识别,以便于催化转录过程。为检测目的基因是否转录出mRNA,常采用分子杂交技术,该技术的具体做法是    　　　　　　　　　　　　　　　    。(4)草莓根系分布浅蒸腾量大,对水分要求严格。我国西北一些地区曾大量种植草莓,但由于降雨量少,致使许多地方的草莓长成半死不活状,其失败的原因主要是违背了　　　    原理。
答案　(1)分生区附近(如茎尖)(2)要有一段已知目的基因的核苷酸序列　缓冲液(3)启动子　RNA聚合酶　从转基因生物中提取mRNA,用标　    记的目的基因作探针与mRNA杂交。如果显示出杂交带,则表明目的基因转录出了mRNA(4)协调与平衡
解析　本题借助无病毒苗的培育考查转基因技术的综合应用能力,属于对科学思维素养的考查。(1)植物的茎尖或根尖等分生区细胞几乎不含病毒,用植株茎尖或根尖等分生区进行组织培养可以获得无病毒组培苗。(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。为维持pH基本不变,需要在PCR反应体系中加入缓冲液。(3)为保证目的基因的表达,重组载体上应含有特定的启动子,它能被受体细胞的RNA聚合酶所识别,以便于催化转录过程。为检测目的基因是否转录出mRNA,常采用分子杂交技术,该技术的具体做法是:从转基因生物中提取mRNA,用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。如果显示出杂交带,则表明目的基因转录出了mRNA。(4)我国西北一些地区曾大量种植草莓,但由于降雨量少,致使许多地方的草莓长成半死不活状,其失败的原因主要是没有考虑生物与环境相适应,违背了生态工程遵循的协调与平衡原理。
知识储备　PCR技术的条件:PCR技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物,该技术需要的条件:模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。
7.(2019天津和平三模,7)(10分)近年CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗的应用领域展现出极大的应用前景。(1)大部分基因治疗的临床试验,都是先从病人体内获得某种细胞(例如T淋巴细胞)进行培养,然后在体外完成基因转移,再筛选成功转移的细胞扩增培养,最后重新输入患者体内,上述方法称为　　　    基因治疗。(2)用CRISPR/Cas9技术治疗遗传病的基本过程:根据遗传病致病基因的序列设计一段RNA(即CRISPR RNA),将该RNA与Cas蛋白结合形成复合体,并导入患者细胞中,导入方法与外源基因导入人体细胞相似,可采用　　　    法;进入细胞后的复合体在RNA的指引下按照　　　　    　    原则准确地结合在致病基因部位,而Cas蛋白则对致病基因进行切割。由此可推知Cas蛋白应该是一种　　　　　　　　    酶。(3)治疗中不能将患病个体的每个细胞都注射该复合体,研究人员选用动物病毒为运载体,从而使复合体在运载体的协助下能够大量主动进入人体细胞,但在使用前需要对运载体进行　    　    处理,以保证其安全性。该运载体进入人体细胞的方式通常是　　　    。
答案　(1)体外(2)显微注射　碱基互补配对　限制性核酸内切(或限制)(3)灭活　胞吞
解析　(1)基因治疗是指把正常基因导入病人体内有缺陷的细胞中,使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的,通常分为体内基因治疗和体外基因治疗。该题方法属于体外基因治疗。(2)将外源基因导入人体细胞的方法主要是显微注射法,因此可用显微注射法将复合体导入患者细胞中;进入细胞后的复合体能在RNA指引下按照碱基互补配对原则准确地结合在致病基因部位,而Cas蛋白则对致病基因进行切割,由此可推知Cas蛋白是一种限制性核酸内切酶,即限制酶。(3)选用动物病毒作为运载体,在使用前需对运载体进行灭活处理以保证其安全性。该运载体(灭活的动物病毒)为大分子物质,进入人体细胞的方式通常是胞吞。
8.(2019天津南开一模,10)(13分)研究表明,HER2/neu是一种原癌基因,可表达H蛋白。H蛋白基因在多种恶性肿瘤特别是乳腺癌细胞中过量表达。抗H蛋白单克隆抗体能抑制过量表达H蛋白的乳腺癌细胞的生长,目前已成为有效的生物治疗手段。(1)H蛋白在成年个体的正常组织中表达量　　　    (填“低”或“高”)。H蛋白是一个跨膜蛋白,结构如图所示。制备免疫小鼠用的H蛋白(抗原)时,应构建　　　    区基因表达载体,转入受体细胞表达并提纯。 (2)为扩增出大量目的基因,需用到PCR技术。常规PCR技术一般包括变性、退火、延伸等步骤,退火(55~60 ℃)时　　　　　　　　    碱基互补配对。设计引物是PCR技术的关键之一,某同学设计的两组引物如表所示,其中引物对　　　    (填“A”或“B”)设计不合理。
(3)制备抗H蛋白单克隆抗体时,需将H蛋白注射到小鼠体内,这样做的目的是使小鼠体内产生　　　　　　　　　　　　　　    。(4)治疗乳腺癌时,可单独使用抗H蛋白单克隆抗体,也可以将　　　　　　　　　　　　　    　　    结合制成“生物导弹”,杀死癌细胞。
答案　(1)低　胞外(2)引物与模板DNA单链　B(3)分泌抗H蛋白抗体的B淋巴细胞浆细胞(4)抗H蛋白单克隆抗体与药物
解析　(1)由题意可知,H蛋白在多种恶性肿瘤细胞中过量表达,因此H蛋白在成年个体的正常组织中表达量低。H蛋白为跨膜蛋白,包括胞外区、跨膜区和胞内区,其中胞外区可被免疫系统识别,所以制备免疫小鼠用的H蛋白时应构建胞外区基因表达载体。(2)PCR技术中,退火时,引物和模板DNA单链碱基互补配对,以便DNA子链延伸。引物B的S1、S2存在大量可以互补配对的碱基对,可能会发生自身碱基互补配对或者S1和S2部分碱基发生互补配对,而失去与模板链结合的机会,因此其设计不合理。(3)制备抗H蛋白单克隆抗体时,以H蛋白为抗原,将H蛋白注射到小鼠体内小鼠体内会发生特异性免疫反应,产生特异性的浆细胞进而产生抗H蛋白的抗体。(4)治疗乳腺癌时,可单独使用抗H蛋白单克隆抗体,通过抗原抗体结合,最终清除癌细胞,也可以将抗H蛋白单克隆抗体和抗癌药物结合制成“生物导弹”,双重作用杀死癌细胞。
9.(2019天津南开中学5月考,8)(12分)草甘膦是一种广谱除草剂,其除草机制是抑制植物体内EPSPS酶的合成,影响植物正常生长,最终导致植物死亡。目前发现,可以从一种抗草甘膦的大肠杆菌突变株中分离出EPSPS基因,若将该基因转入植物细胞内,获得的转基因植物能耐受高浓度的草甘膦。取6株植物分别编号为A~D,其中,植物A和D对草甘膦敏感,B和E对草甘膦天然具有抗性,C和F则经过转基因处理,但是否成功未知(转基因处理过程不影响植物正常生长),图1为4种限制酶的识别序列和酶切位点,图2为含有目的基因的DNA片段及其具有的限制酶酶切位点。据图回答:限制酶　    MspⅠ　    BamHⅠ　　　    MboⅠ　　    SmaⅠ酶切　　C↓CGG　　G↓GATCC　　↓GATC　　CCC↓GGG位点　　GGC↑C　　CCTAG↑G　　　CTAG↑　GGG↑CCC 图1 
图2
(1)若A、B、C浇清水,D、E、F浇含有草甘膦的水,则A~F植物中,一定能正常生长的是　　    　　　    。(2)一个完整的基因表达载体除复制原点、启动子和终止子外,还应包括　　　　　　　　        。若利用酶切法获得目的基因,最应选择的限制酶是　　　    和　　　    。(3)假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中,但植物F没有表现出抗性,分析可能的原因　　    　　　　　　　　　　　　　　　    。
答案　(1)ABCE(2)标记基因和目的基因    MspⅠ    SmaⅠ(3)目的基因没有成功表达或表达的产物失活
解析　(1)植物A和D对草甘膦敏感,B和E对草甘膦天然具有抗性,C和F则经过了转基因处理,但是否成功还未知,所以A~C浇清水,都能正常成长;D~F浇的水中含有草甘膦,D肯定不能正常成长,E肯定能正常成长,F未知。因此,肯定能正常成长的是ABCE。(2)完整的基因表达载体包括复制原点、启动子、终止子、标记基因和目的基因。用酶切法获得目的基因,若选用BamHⅠ和MboⅠ切割会破坏目的基因,因此最应选择的限制酶是MspⅠ和SmaⅠ,这样既可获得目的基因,也可以防止目的基因与运载体反向连接。(3)若EPSPS基因已被成功转移到植物F中,但植物F仍没有表现出抗性,可能的原因是目的基因没有成功表达(即没有转录或者翻译)或表达的产物失活。
10.(2019天津十二区县二模,8)(10分)人体内的t-PA蛋白能高效降解由血纤维蛋白凝聚形成的血栓,是心梗和脑血栓的急救药。然而,为心梗患者注射大剂量的基因工程t-PA蛋白会诱发颅内出血,其原因为t-PA蛋白与血纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实,将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。据此,先对天然的t-PA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因,可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。 
图1
  图2(1)已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的编码序列(即模板链的互补链序列)为TGT,而丝氨酸的密码子为UCU,因此突变基因编码该氨基酸的编码序列应设计为　　　    。(2)若获得的t-PA突变基因如图1所示,那么质粒pCLY11需用限制酶　　　    和　　　    切开后,才能与t-PA突变基因高效连接。(3)将连接好的DNA分子导入大肠杆菌中,含t-PA突变基因重组DNA分子的细胞应具有的性状是　　    。A.新霉素抗性且呈蓝色B.新霉素敏感且呈蓝色C.新霉素抗性且呈白色D.新霉素敏感且呈白色
(4)层析是蛋白质或酶分离提纯的重要步骤。在图2所示的层析装置中,层析柱内装填了特定的细小固体颗粒(称为层析介质),待分离的蛋白质或酶混合溶液通过层析柱,便可将目标蛋白与杂蛋白高效分离,试根据题干信息判断,为了高效分离t-PA突变蛋白,层析介质表面事先应交联或固定　　　　　    。制造该性能优异t-PA突变蛋白的过程称为　　　    工程。
答案　(1)TCT　(2)Xma Ⅰ    Bgl Ⅱ　(3)C　(4)血纤维蛋白　蛋白质
解析　本题考查基因工程和蛋白质工程的相关知识。基因工程的基本操作步骤:获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→得到转基因生物→目的基因检测与鉴定。蛋白质工程可以通过基因修饰或基因合成,对现有的蛋白质进行改造,或制造新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。(1)人t-PA基因第84位半胱氨酸编码序列(即模板链的互补链序列)为TGT,根据转录的碱基互补配对原则,模板链的互补链序列与mRNA上的密码子的序列一致,只是T替换成U,丝氨酸的密码子为UCU,则其编码序列为TCT,要将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,需将编码序列设计为TCT。(2)若要质粒pCLY11与t-PA突变基因高效连接,需质粒和突变基因切割后产生的黏性末端能碱基互补配对,t-PA突变基因切割后的黏性末端分别为—GGCC和—CTAG,故质粒
pCLY11需要用XmaⅠ和BglⅡ切割。(3)质粒pCLY11用XmaⅠ和BglⅡ切割后neor基因未被破坏但mlacZ基因被破坏,而mlacZ基因的表达产物能把细胞染成蓝色。故含t-PA突变基因的重组DNA分子的细胞neor基因表达,mlacZ基因不表达,其应具有的性状是新霉素抗性且呈白色,故选C。(4)t-PA突变蛋白与血纤维蛋白结合的特异性高,为了高效分离t-PA突变蛋白,在层析介质表面事先应交联或固定血纤维蛋白。制造该性能优异t-PA突变蛋白的过程涉及基因工
程和基因改造,最终得到所需要的蛋白质,该过程属于蛋白质工程。
题后悟道　本题综合性较强,难度较大。厘清转录中碱基互补配对原则及基因工程的核心步骤即基因表达载体的构建是解题的关键。
C组　2017—2019年高考模拟·应用创新题组
1.(2019　5·3原创)“青岛奶山羊乳腺生物反应器”生产的乙肝表面抗原、抗凝血酶Ⅲ、胰岛素等药用蛋白已经遍及医药市场,实现了造福人类的初步愿望。回答下列问题:(1)在培育转基因奶山羊时,药用蛋白基因应与　　　　    基因的调控组件重组在一起,其中    　　    应连接在目的基因首端。(2)胰岛素基因可以从人类cDNA文库中获取,建立该基因文库时通常需要从人的　　　　    细胞中提取全部的mRNA,通过　　　    方法获取cDNA,并将其导入　　　　    中储存。(3)利用PCR技术扩增抗凝血酶Ⅲ基因时,设计引物序列的主要依据是　　　　　　　　　    　　　　　　    。与体内DNA复制相比,PCR技术主要优点是    　　　　　　　　　　    。(4)现代基因工程中,构建基因表达载体常用两种限制酶,这样做的优点是　　　　　　　　        　　　　　　　　　　。
答案　(1)乳腺蛋白　启动子(2)胰岛B　逆转录　受体菌群(3)抗凝血酶Ⅲ基因两端的部分核苷酸序列　不需解旋酶、可在短时间内大量扩增目的基因(高效快速)、易于操作(4)防止酶切产物自身环化
解析　(1)构建乳腺生物反应器前,需将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的调控组件重组在一起,其中启动子应连接在目的基因首端,终止子连接在目的基因的尾端。(2)构建人的胰岛素基因文库时需要从人的胰岛B细胞中提取相应的mRNA,通过逆转录方法获取cDNA,并将其导入受体菌群中储存。(3)利用PCR技术扩增抗凝血酶Ⅲ基因时,需根据该基因两端的部分核苷酸序列设计引物。与体内DNA复制相比,PCR技术主要优点是不需解旋酶、可在短时间内大量扩增目的基因(高效快速)、易于操作等。(4)现代基因工程中,构建基因表达载体常用两种限制酶,这样可以防止酶切产物自身环化。
2.(2019　5·3 磨尖卷三,31)为了培育新品种,研究者从其他植物中获取C基因(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再用重组质粒去转化棉花细胞和小鼠细胞。请回答下列问题: (1)构建含C基因的表达载体时,需选择图2中的　　　    限制酶切割质粒。构建基因表达载体的目的是            。
(2)在　　　　　　　　    条件下,将被C基因转化的棉花细胞培养在人工配制的培养基上,给予适宜的条件,诱导其产生愈伤组织、丛芽,最终形成完整的植株。人工配制的培养基中必须有一定的营养和激素,实验过程中发现部分接种在无激素培养基上的芽也能长根,原因是        。(3)若将被C基因转化的小鼠细胞进行细胞培养,在传代培养时常用　　　　　　　　　　    　　    分散细胞,该过程中的酶不能用胃蛋白酶代替,原因是            。
答案　(1)EcoR Ⅰ　使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用(2)无菌和人工控制　芽顶端合成的生长素向基部运输,促进生根(3)胰蛋白酶或胶原蛋白酶　细胞培养的适宜pH为7.2~7.4,胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.5,当pH过大时,胃蛋白酶就会失去活性,所以不能用胃蛋白酶
解析　(1)构建含C基因的表达载体时,因为C基因片段上有酶酶切位点,所以选择图2中的EcoRⅠ限制酶切割质粒。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代,同时可以表达和发挥作用。(2)植物组织培养的主要原理是植物细胞具有全能性,具体过程是在无菌和人工控制条件下,将离体的植物器官、组织、细胞在人工配制的培养基上培养,给予适宜的条件,诱导其产生愈伤组织、丛芽,最终形成完整的植株。人工配制的培养基中必须有一定的营养和激素。实验过程中发现部分接种在无激素培养基上的芽也能长根,原因是芽顶端可以产生生长素,合成的生长素向基部运输,促进根的分化。(3)若将被C基因转化的小鼠细胞进行细胞培养,在传代培养时常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶分散细胞,该过程中的酶不能用胃蛋白酶代替,原因是细胞培养的适宜pH为7.2~7.4,胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.5,当pH过大时,胃蛋白酶就会失去活性,所以不能用胃蛋白酶。
知识归纳　基因表达载体的构建(1)基因表达载体的构建过程:首先用同种限制酶分别切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体,再用DNA连接酶连接目的基因和运载体形成重组DNA分子。(2)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代,同时可以表达和发挥作用。(3)基因表达载体的组成:复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,启动子在基因的首端,它是RNA聚合酶的结合位点,能控制转录的开始;终止子在基因的尾端,它控制着转录的结束;标记基因便于转基因细胞的鉴定和筛选。