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高中生物高考2023年高考生物一轮复习（新人教新高考） 第10单元 第6课时 基因工程的基本工具和基本操作程序
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这是一份高中生物高考2023年高考生物一轮复习（新人教新高考） 第10单元 第6课时 基因工程的基本工具和基本操作程序，共25页。试卷主要包含了将目的基因导入受体细胞，7 kb等内容，欢迎下载使用。
考点一 重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
(1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。
拓展 基因工程的理论基础
2．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(2)DNA连接酶
(3)载体
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
延伸应用 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
考向一 限制酶和DNA连接酶
1．(2022·长春市高三期中)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是( )
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案 D
解析 HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A项正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B项正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C项正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D项错误。
2．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是( )
A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B．图乙中只用EcRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团
C．用EcRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
答案 C
解析 从图甲看出，用EcRⅠ切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中EcRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C项错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D项正确。
考向二 基因工程载体的应用
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
答案 C
4．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案 D
解析 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②常用PCR特异性地快速扩增目的基因
归纳总结 PCR技术和DNA复制的比较
易错提醒 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律
源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
易错提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
3.将目的基因导入受体细胞
4．目的基因的检测与鉴定
考向一 目的基因的获取
5．利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B．变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶
C．复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D．延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
答案 D
6．利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是( )
A．PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果
B．引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基
C．①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右
D．②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
答案 D
考向二 基因工程的基本操作程序
7．(2022·云南高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是( )
A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒
C．过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
答案 D
解析 戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A项错误；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2蛋白的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，B项错误；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的透过性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C项错误。
8．某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是____________________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________________。该方法中农杆菌的作用是______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是_______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
答案 (1)Ti质粒 T－DNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
(2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率 (3)否 含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)如图所示
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2 ml·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)操作流程
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定
考向一 DNA的粗提取与鉴定
9．下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液
B．采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质
C．用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化
答案 B
解析 将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去沉淀物，收集上清液，A错误；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离，进行DNA的粗提取，B正确；用塑料离心管可减少提取过程中DNA的损失，C错误；将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后，将试管置于沸水中加热5 min，观察颜色变化，D错误。
10．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的是( )
A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色
答案 D
解析 图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色，D错误。
考向二 DNA片段的扩增及电泳鉴定
11．利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
B．PCR利用了DNA的热变性原理
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误。
12．下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A．电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
答案 C
重温高考 真题演练
1．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案 A
解析 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
2．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
答案 B
解析 引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确。
3．(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是__________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是____________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_______________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于________________________________________________________________________，
理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)SalⅠ EcRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
解析 (1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhⅠ所识别，故应该选用添加限制酶EcRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，由图中可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcRⅠ和限制酶SalⅠ切割，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用TaqDNA聚合酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是TaqDNA聚合酶、限制酶EcRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhⅠ、DNA连接酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
一、易错辨析
1．限制酶也可以识别和切割RNA( × )
2．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( × )
3．E.cliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
4．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( √ )
5．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精( √ )
6．在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( × )
二、填空默写
1．(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2．(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
3．(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
4．(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
5．(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。
6．(选择性必修3 P81)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
课时精练
一、选择题
1．若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )
A．用EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
答案 D
解析 解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。
2．农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的载体，下列相关叙述正确的是( )
A．Ti质粒是能够自主复制的单链DNA
B．Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接
C．重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞
D．Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上
答案 B
3．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( )
A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16
答案 D
解析 用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成(两种)引物，但不必知道基因的全部序列，A正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。
4．(2022·北京高三一模)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是( )
注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因，TetR：四环素抗性基因
A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G
B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因
C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出含重组质粒的受体菌
D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
答案 C
解析 为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌的选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据图可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。
5．科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。下图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeR表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述不正确的是( )
A．目的基因插入到质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中
B．为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcRⅠ和PstⅠ
C．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素
D．可用PCR等技术或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达
答案 D
解析 农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，将目的基因插入到质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中，A正确；应选用EcRⅠ和PstⅠ切割质粒，氨苄青霉素抗性基因被破坏，故成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素，C正确；检测目的基因是否表达应检测是否成功产生蛋白质，可用抗原—抗体杂交技术，D错误。
6．(2022·扬州市高三期中)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
答案 C
解析 PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。
7．一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(下图左边一列)。关于该双链DNA，下列说法错误的是( )
A．呈环状结构
B．分子质量大小为10 kb
C．有一个NtⅠ和两个EcRⅠ切点
D．其NtⅠ切点与EcRⅠ切点的最短距离为2 kb
答案 D
解析 单用EcRⅠ处理和利用EcRⅠ和NtⅠ双酶切时产生的结果不同，说明DNA含有NtⅠ酶切位点，因为用NtⅠ处理只产生了一个10 kb的条带，所以该分子必须是环状的，且长度一定是10 kb，A、B正确；因为用NtⅠ处理只产生了一个10 kb的条带，说明该环状DNA上含有一个NtⅠ切割位点，单用EcRⅠ处理后产生了4 kb和6 kb两个条带，说明该环状DNA上含有2个EcRⅠ切割位点，C正确；用EcRⅠ处理后产生的4 kb的片段，进一步被NtⅠ酶切为3 kb和1 kb的片段，可以得知NtⅠ切点与EcRⅠ切点的最短距离为1 kb，最大距离为3 kb，D错误。
8．科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析错误的是( )
A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因表达效率低
B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译
C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中
D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能只是载体DNA分子导入受体细胞
答案 D
解析 抗原、抗体能特异性结合，可提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，说明抗虫基因能表达。但棉花植株并无抗虫性状，则可能是抗虫基因表达效率低，合成的Bt抗虫蛋白太少，A正确；核酸分子杂交技术的原理是碱基互补配对，检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，说明抗虫基因能转录，细胞中无Bt抗虫蛋白，说明抗虫基因不能正常翻译，导致棉花植株并无抗虫性状，B正确；核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，而抗虫基因又不能表达，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中，C正确；由题干信息“鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株”可知，导入受体细胞的是重组DNA分子，D错误。
9．某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列叙述不正确的是( )
A．a酶与b酶切断的化学键相同
B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接
C．仅用b酶切割，则得到2个DNA分子产物
D．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
答案 C
解析 限制酶作用的化学键都是磷酸二酯键，A正确；由图可以看出，a酶和b酶切割后产生的黏性末端互补，它们之间能相互连接，B正确；由表格可以看出，b酶把大小为2 100 bp的DNA片段切成大小分别为1 900 bp和200 bp的两个DNA片段，把大小为1 400 bp的DNA片段切成大小分别为800 bp和600 bp的两个DNA片段，说明b酶在该DNA分子上有2个切割位点，因此仅用b酶切割，可得到3个DNA分子产物，C错误。
10．荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是( )
A．检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNA
B．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段
C．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
D．若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性
答案 C
解析 Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越少，患者危险性更低，C错误；若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，则逆转录无法得到相应DNA，检测结果可能为阴性，D正确。
11．某中学生物兴趣小组进行DNA的粗提取与鉴定时，选取如下实验材料：新鲜花椰菜、体积分数为95%的冷酒精、研磨液(含表面活性剂SDS、DNA酶抑制剂EDTA、适量的NaCl)、0.015 ml·L－1的NaCl溶液、二苯胺试剂、蒸馏水以及其他必要实验器材。下列有关选择实验材料的理由，叙述不正确的是( )
A．新鲜的花椰菜DNA含量丰富，易获取
B．SDS具有瓦解植物细胞膜的作用
C．DNA溶于冷酒精，而蛋白质等杂质不溶
D．EDTA可减少提取过程DNA的降解
答案 C
12．缺乏维生素A容易导致夜盲症或营养不良，甚至能够威胁到生命。而β胡萝卜素可以在人体内转化成维生素A。科学家尝试通过转基因技术生产富含β胡萝卜素的大米。八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。根据以上信息分析，下列叙述错误的是( )
A．pmi基因作为标记基因可以鉴别受体细胞中是否含有目的基因
B．psy基因和crtI基因的序列中可以含有用到的限制酶的识别序列
C．可通过基因枪法将目的基因导入水稻的受体细胞
D．PCR技术不能检测目的基因是否表达出相应的蛋白质
答案 B
二、非选择题
13．如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：
表1
注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。
表2
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断裂，切割形成的末端有______________________两种。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为____________kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成_______________________________________________________________
过程。
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在________μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是____________________________________________________
________________________________________________________________________。
若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的____________(填“DNA”或“RNA”)。
答案 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)1.4 pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段 (3)转化 (4)5 根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选 RNA
解析 (2)质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为6.7－5.7＋0.4＝1.4 kb。(4)从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5 μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5 μg/mL。检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成mRNA。
14．(2022·济南联考)下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是_________________________________________________________________，③过程的目的是________________________，⑤过程常用________________________________
处理大肠杆菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有______种和_________________________________________种。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选____________________的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是__________________________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是__________________________。
答案 (1)调控作用 人垂体组织细胞 将平末端处理为黏性末端 Ca2＋ (2)9 3 3 (3)含四环素抗性基因 完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒) 在丙中能存活，在乙中不能存活
解析 (2)(后面的→均按照顺时针方向)假设PstⅠ、EcRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用1、2、3表示。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。限制酶名称
识别序列和切割位点
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHⅠ
G↓GATCC
KpnⅠ
GGTAC↓C
EcRⅠ
C↓AATTC
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅡ
GTY↓RAC
SmaⅠ
CCC↓GGG
循环次数
1
2
3
n
DNA分子数
2
4
8
2n
含引物A(或B)的DNA分子数
1
3
7
2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数
0＝21－2
2＝22－2
6＝23－2
2n－2
共消耗的引物数量
2＝21＋1－2
6＝22＋1－2
14＝23＋1－2
2n＋1－2
项目
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
本质
DNA
DNA
mRNA
mRNA
位置
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
功能
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
辨析 1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
2农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入,第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入非人工操作是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
3农杆菌特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
注意事项 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
注意事项 1为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
3电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。
a酶切割产物(bp)
b酶再次切
割产物(bp)
2 100；1 400；
1 000；500
1 900；200；800；
600；1 000；500
pIJ702
pZHZ8
BglⅡ
5.7 kb
6.7 kb
固体培养基中硫链丝菌素浓度(μg/mL)
0
1
2
5
10
不含质粒的链霉菌生长状况
＋＋＋＋＋
＋＋＋
＋
－
－
考点一 重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
(1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。
拓展 基因工程的理论基础
2．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(2)DNA连接酶
(3)载体
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
延伸应用 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
考向一 限制酶和DNA连接酶
1．(2022·长春市高三期中)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是( )
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案 D
解析 HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A项正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B项正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C项正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D项错误。
2．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是( )
A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B．图乙中只用EcRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团
C．用EcRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
答案 C
解析 从图甲看出，用EcRⅠ切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中EcRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C项错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D项正确。
考向二 基因工程载体的应用
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
答案 C
4．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案 D
解析 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②常用PCR特异性地快速扩增目的基因
归纳总结 PCR技术和DNA复制的比较
易错提醒 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律
源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
易错提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
3.将目的基因导入受体细胞
4．目的基因的检测与鉴定
考向一 目的基因的获取
5．利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B．变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶
C．复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D．延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
答案 D
6．利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是( )
A．PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果
B．引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基
C．①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右
D．②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
答案 D
考向二 基因工程的基本操作程序
7．(2022·云南高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是( )
A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒
C．过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
答案 D
解析 戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A项错误；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2蛋白的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，B项错误；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的透过性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C项错误。
8．某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是____________________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________________。该方法中农杆菌的作用是______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是_______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
答案 (1)Ti质粒 T－DNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
(2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率 (3)否 含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)如图所示
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2 ml·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)操作流程
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定
考向一 DNA的粗提取与鉴定
9．下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液
B．采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质
C．用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化
答案 B
解析 将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去沉淀物，收集上清液，A错误；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离，进行DNA的粗提取，B正确；用塑料离心管可减少提取过程中DNA的损失，C错误；将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后，将试管置于沸水中加热5 min，观察颜色变化，D错误。
10．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的是( )
A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞
B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C．图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精
D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色
答案 D
解析 图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色，D错误。
考向二 DNA片段的扩增及电泳鉴定
11．利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
B．PCR利用了DNA的热变性原理
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误。
12．下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A．电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
答案 C
重温高考 真题演练
1．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案 A
解析 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
2．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
答案 B
解析 引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确。
3．(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是__________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是____________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_______________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于________________________________________________________________________，
理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)SalⅠ EcRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
解析 (1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhⅠ所识别，故应该选用添加限制酶EcRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，由图中可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcRⅠ和限制酶SalⅠ切割，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用TaqDNA聚合酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是TaqDNA聚合酶、限制酶EcRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhⅠ、DNA连接酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
一、易错辨析
1．限制酶也可以识别和切割RNA( × )
2．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( × )
3．E.cliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
4．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( √ )
5．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精( √ )
6．在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( × )
二、填空默写
1．(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2．(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
3．(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
4．(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
5．(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。
6．(选择性必修3 P81)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
课时精练
一、选择题
1．若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )
A．用EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
答案 D
解析 解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。
2．农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的载体，下列相关叙述正确的是( )
A．Ti质粒是能够自主复制的单链DNA
B．Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接
C．重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞
D．Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上
答案 B
3．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( )
A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16
答案 D
解析 用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成(两种)引物，但不必知道基因的全部序列，A正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。
4．(2022·北京高三一模)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是( )
注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因，TetR：四环素抗性基因
A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G
B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因
C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出含重组质粒的受体菌
D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
答案 C
解析 为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌的选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据图可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。
5．科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。下图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeR表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述不正确的是( )
A．目的基因插入到质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中
B．为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcRⅠ和PstⅠ
C．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素
D．可用PCR等技术或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达
答案 D
解析 农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，将目的基因插入到质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中，A正确；应选用EcRⅠ和PstⅠ切割质粒，氨苄青霉素抗性基因被破坏，故成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素，C正确；检测目的基因是否表达应检测是否成功产生蛋白质，可用抗原—抗体杂交技术，D错误。
6．(2022·扬州市高三期中)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
答案 C
解析 PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。
7．一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(下图左边一列)。关于该双链DNA，下列说法错误的是( )
A．呈环状结构
B．分子质量大小为10 kb
C．有一个NtⅠ和两个EcRⅠ切点
D．其NtⅠ切点与EcRⅠ切点的最短距离为2 kb
答案 D
解析 单用EcRⅠ处理和利用EcRⅠ和NtⅠ双酶切时产生的结果不同，说明DNA含有NtⅠ酶切位点，因为用NtⅠ处理只产生了一个10 kb的条带，所以该分子必须是环状的，且长度一定是10 kb，A、B正确；因为用NtⅠ处理只产生了一个10 kb的条带，说明该环状DNA上含有一个NtⅠ切割位点，单用EcRⅠ处理后产生了4 kb和6 kb两个条带，说明该环状DNA上含有2个EcRⅠ切割位点，C正确；用EcRⅠ处理后产生的4 kb的片段，进一步被NtⅠ酶切为3 kb和1 kb的片段，可以得知NtⅠ切点与EcRⅠ切点的最短距离为1 kb，最大距离为3 kb，D错误。
8．科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析错误的是( )
A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因表达效率低
B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译
C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中
D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能只是载体DNA分子导入受体细胞
答案 D
解析 抗原、抗体能特异性结合，可提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，说明抗虫基因能表达。但棉花植株并无抗虫性状，则可能是抗虫基因表达效率低，合成的Bt抗虫蛋白太少，A正确；核酸分子杂交技术的原理是碱基互补配对，检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，说明抗虫基因能转录，细胞中无Bt抗虫蛋白，说明抗虫基因不能正常翻译，导致棉花植株并无抗虫性状，B正确；核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，而抗虫基因又不能表达，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中，C正确；由题干信息“鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株”可知，导入受体细胞的是重组DNA分子，D错误。
9．某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列叙述不正确的是( )
A．a酶与b酶切断的化学键相同
B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接
C．仅用b酶切割，则得到2个DNA分子产物
D．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
答案 C
解析 限制酶作用的化学键都是磷酸二酯键，A正确；由图可以看出，a酶和b酶切割后产生的黏性末端互补，它们之间能相互连接，B正确；由表格可以看出，b酶把大小为2 100 bp的DNA片段切成大小分别为1 900 bp和200 bp的两个DNA片段，把大小为1 400 bp的DNA片段切成大小分别为800 bp和600 bp的两个DNA片段，说明b酶在该DNA分子上有2个切割位点，因此仅用b酶切割，可得到3个DNA分子产物，C错误。
10．荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是( )
A．检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNA
B．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段
C．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
D．若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性
答案 C
解析 Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越少，患者危险性更低，C错误；若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，则逆转录无法得到相应DNA，检测结果可能为阴性，D正确。
11．某中学生物兴趣小组进行DNA的粗提取与鉴定时，选取如下实验材料：新鲜花椰菜、体积分数为95%的冷酒精、研磨液(含表面活性剂SDS、DNA酶抑制剂EDTA、适量的NaCl)、0.015 ml·L－1的NaCl溶液、二苯胺试剂、蒸馏水以及其他必要实验器材。下列有关选择实验材料的理由，叙述不正确的是( )
A．新鲜的花椰菜DNA含量丰富，易获取
B．SDS具有瓦解植物细胞膜的作用
C．DNA溶于冷酒精，而蛋白质等杂质不溶
D．EDTA可减少提取过程DNA的降解
答案 C
12．缺乏维生素A容易导致夜盲症或营养不良，甚至能够威胁到生命。而β胡萝卜素可以在人体内转化成维生素A。科学家尝试通过转基因技术生产富含β胡萝卜素的大米。八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。根据以上信息分析，下列叙述错误的是( )
A．pmi基因作为标记基因可以鉴别受体细胞中是否含有目的基因
B．psy基因和crtI基因的序列中可以含有用到的限制酶的识别序列
C．可通过基因枪法将目的基因导入水稻的受体细胞
D．PCR技术不能检测目的基因是否表达出相应的蛋白质
答案 B
二、非选择题
13．如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：
表1
注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。
表2
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断裂，切割形成的末端有______________________两种。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为____________kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成_______________________________________________________________
过程。
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在________μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是____________________________________________________
________________________________________________________________________。
若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的____________(填“DNA”或“RNA”)。
答案 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)1.4 pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段 (3)转化 (4)5 根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选 RNA
解析 (2)质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为6.7－5.7＋0.4＝1.4 kb。(4)从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5 μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5 μg/mL。检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成mRNA。
14．(2022·济南联考)下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是_________________________________________________________________，③过程的目的是________________________，⑤过程常用________________________________
处理大肠杆菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有______种和_________________________________________种。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选____________________的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是__________________________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是__________________________。
答案 (1)调控作用 人垂体组织细胞 将平末端处理为黏性末端 Ca2＋ (2)9 3 3 (3)含四环素抗性基因 完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒) 在丙中能存活，在乙中不能存活
解析 (2)(后面的→均按照顺时针方向)假设PstⅠ、EcRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用1、2、3表示。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。限制酶名称
识别序列和切割位点
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHⅠ
G↓GATCC
KpnⅠ
GGTAC↓C
EcRⅠ
C↓AATTC
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅡ
GTY↓RAC
SmaⅠ
CCC↓GGG
循环次数
1
2
3
n
DNA分子数
2
4
8
2n
含引物A(或B)的DNA分子数
1
3
7
2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数
0＝21－2
2＝22－2
6＝23－2
2n－2
共消耗的引物数量
2＝21＋1－2
6＝22＋1－2
14＝23＋1－2
2n＋1－2
项目
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
本质
DNA
DNA
mRNA
mRNA
位置
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
功能
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
辨析 1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
2农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入,第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入非人工操作是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
3农杆菌特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
注意事项 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
注意事项 1为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
3电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。
a酶切割产物(bp)
b酶再次切
割产物(bp)
2 100；1 400；
1 000；500
1 900；200；800；
600；1 000；500
pIJ702
pZHZ8
BglⅡ
5.7 kb
6.7 kb
固体培养基中硫链丝菌素浓度(μg/mL)
0
1
2
5
10
不含质粒的链霉菌生长状况
＋＋＋＋＋
＋＋＋
＋
－
－
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