高中生物高考选修三 第31讲

这是一份高中生物高考选修三 第31讲，共29页。试卷主要包含了基因工程的基本工具，基因工程的基本操作程序，14 ml/L NaCl溶液等内容，欢迎下载使用。
考点一 基因工程的基本工具及操作过程
1.基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(限制酶)
①来源：主要从原核生物中分离纯化而来。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③作用结果
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
②类型
(3)载体
①条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点；具有标记基因。
②种类eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(最常用：质粒,其他：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等))
③作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
2.基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。
②获取方法eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(从基因文库中获取,,\a\vs4\al(人工,合成)\b\lc\{(\a\vs4\al\c1(利用mRNA反转录合成,,通过DNA合成仪用化学方法人工合成)),,利用PCR技术扩增))
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成
③构建过程
(3)将目的基因导入受体细胞的“三种类型”
①导入植物细胞——农杆菌转化法(花粉管通道法、基因枪法)。其受体细胞为体细胞或受精卵。
农杆菌在自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，并将其Ti质粒上的T－DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
②导入动物细胞——显微注射法其受体细胞为受精卵。
③导入微生物细胞——感受态细胞法，需用Ca2＋处理获得感受态细胞使其能吸收DNA分子。
3.目的基因检测与鉴定的“两个水平”
1.限制性核酸内切酶Mun Ⅰ和限制性核酸内切酶EcR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是eq \a\vs4\al( ↓,—CAATTG—)和eq \a\vs4\al( ↓,—GAATTC—)。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。
提示 适合的质粒是①。由图可知，质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。
2.下图中的图1和图2分别表示的是EcRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请思考：
(1)EcRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的化学本质是什么？其单体是什么？两类酶识别的碱基序列及切割的位点分别是什么？
提示 蛋白质 氨基酸 EcRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
(2)以上实例说明限制酶具有何种特性？
提示 专一性。
(3)要将图1中的末端再连接起来，需要用哪类连接酶，若连接图2的末端呢？
提示 连接图1中的黏性末端既可用E·cli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶，连接图2中平末端只能用T4 DNA连接酶。
3.已知限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，根据图示思考下列问题：
(1)切割目的基因应选用哪类限制酶？切割质粒呢？请说明理由。
(2)限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ切割后获得的黏性末端是否相同？
(3)将基因表达载体导入受体细胞后，进行筛选时，培养基中应添加填“青霉素”还是“四环素”)？为什么？
提示 (1)由于限制酶Ⅰ识别位点—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ识别位点为—↓GATC—，由此可见限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，图中显示目的基因两端分别有限制酶Ⅰ、限制酶Ⅱ识别位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，然而，倘若使用限制酶Ⅱ切割质粒，则会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
(2)相同(均具GATC—)。
(3)青霉素 因使用限制酶Ⅰ后，四环素抗性基因已被破坏。
[重点·串讲整合]
1.诠释基因表达载体
(1)分段解读
(2)载体上标记基因的标记原理辨析
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力——当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：
2.四类受体细胞的筛选与判定
当用相应的限制酶切割了目的基因与载体后，可将二者混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化受体细胞，其结果有如下四种：
上述四类受体细胞中通过“标记基因”(制备的培养基)可区分出①②与③④，而通过DNA分子杂交技术，可进一步区分③与④。
点悟：“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？
经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定(具有标记基因)的载体，然而，该载体上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。
3.诠释基因组文库与部分基因文库
1.(2018·全国卷Ⅱ，38)[生物——选修3：现代生物科技专题]
某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是 。使用这两种酶进行酶切是为了保证 ，也是为了保证 。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了 和 过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的 移入牛的 中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 (填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析 (1)据图示信息分析：将L1－GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1－GFP融合基因的完整，又能保证L1－GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
答案 (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
(2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞 (4)核DNA
2.(2016·全国卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有 (答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_______________；
并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是__________________
_____________________________________________________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有 的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_______________________________________________________________。
解析 (1)作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定维持和表达；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；③具1～多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。
答案 (1)能自我复制、具有标记基因
(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素
(3)受体细胞
考点二 基因工程的应用及蛋白质工程
1.基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。
(3)比较基因治疗与基因诊断：
2.蛋白质工程
(1)流程图
A.转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
(2)手段：基因修饰或基因合成。
(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
(4)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。
1.既然存在基因工程，为什么还要改造蛋白质？
提示 基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质。
2.(教材P26旁栏思考题解答)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？
提示 毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：
(1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的；(2)蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造。
1.(2018·海南卷，31)[选修3：现代生物科技专题]
甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜 (填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是__________________。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中 已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到 (填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用 作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为_____________________________________________________________
____________________________________________________________________。
解析 (1)当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，因此用农杆菌感染时，优先选用黄瓜受伤的叶片。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，说明目的基因——甜蛋白基因在受体细胞中已经完成表达；若甜蛋白基因整合到线粒体基因组或叶绿体基因组中，在遗传时遵循母系遗传，不会出现固定的分离比，所以子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组。
(4)基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出符合人们需要的新生物类型和生物产品。
答案 (1)受伤的 叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞
(2)甜蛋白基因 核基因组 (3)茎尖 (4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型
2.(2015·全国卷Ⅱ，40)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的 进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括______________________________________________________________________
的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_________________________
____________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_________________________________________________________________
和 ，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对合成蛋白质的生物 进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构) (2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译) (3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
蛋白质工程与基因工程的比较
考点三 PCR技术与DNA的粗提取与鉴定
1.PCR技术
(1)PCR含义：即多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
(2)原理：DNA双链复制。
(3)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便据其合成引物。
(4)条件：除需引物及控制温度外，还必须有耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
(5)PCR反应过程
(6)结果： 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子 ，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加——PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
2.DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)操作流程
(3)DNA与蛋白质在NaCl溶液中的溶解度比较
仔细观察图示过程，请思考：
(1)图中方法可以获得大量目的基因，这是一种什么技术方法？其原理是什么？
(2)图中A、B分别是什么？其单体是否相同？
(3)过程①②③的名称是什么？过程①首先要将反应体系的温度升高到90～95 ℃，其目的是什么？如果是在体内，该过程如何完成？
提示 (1)图中方法为PCR技术，该技术是生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA双链复制。
(2)图中A为引物，B为热稳定DNA聚合酶(Taq酶)，二者单体不同，前者单体为核苷酸，后者单体为氨基酸。
(3)①为变性，②为复性，③为延伸，过程①升温到90～95 ℃，目的是使目的基因受热变性后解链为单链，该过程若发生于体内，需在解旋酶作用下解旋为两条单链(且为边解旋边复制)。
1.(PCR技术)(2017·经典高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR 扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过 获得 用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1 和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表 ，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有 。(填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。
解析 (1)由mRNA获得目的基因片段需通过逆转录获得的片段为cDNA。
(2)为方便构建重组质粒，宜在引物中增加适当的限制酶位点以便使复制出的目的基因两端含限制酶切点；设计引物时，需避免引物之间碱基互补配对，以防引物间自连。
(3)图中步骤1为高温下实现DNA变性解链。
(4)PCR扩增时，若退火温度过高会破坏引物与模板间的碱基互补配对，DNA片段中G与C间可形成三个氢键，G—C比例越高时DNA分子越稳定，其退火温度应越高。
(5)若PCR反应得不到任何扩增产物，则可通过降低退火温度及重新设计引物等措施，以便使引物与模板结合，从而进行后序扩增过程。
答案 (1)逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性 (4)引物与模板 G—C含量高
(5)②③
2.(DNA的粗提取与鉴定)DNA的粗提取与鉴定的实验(如图)：
(1)本实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡的全血，主要原因是鸡血细胞液中 含量较高，另外本实验不适合用哺乳动物的血细胞液，原因是______________
____________________________________________________________________。
(2)图中A所示加入蒸馏水的目的是__________________________________
___________________________________________________________________。
(3)通过图中B所示步骤取得滤液后，再向滤液中加入2 ml/L的NaCl溶液的目的是_______________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(4)图中C所示加入蒸馏水的目的是____________________________________
____________________________________________________________________。
(5)为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可用 试剂进行检验，在沸水浴条件下，冷却后可以看到颜色反应为 色。
答案 (1)DNA 哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核
(2)使血细胞吸水涨破，释放出核物质DNA
(3)使DNA溶解于NaCl溶液中
(4)使DNA的溶解度下降而析出
(5)二苯胺 蓝
(1)DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
(2)细胞内DNA复制和体外扩增DNA(PCR)
澄清易混易错·强化科学思维
[易错易混]
易错点1 目的基因插入载体的部位是随机的吗？
点拨 目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去原功能。
易错点2 混淆常考的8种酶
点拨 归纳如下
易错点3 混淆启动子与起始密码，终止子与终止密码
点拨 启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，其位于基因的首端——它是RNA聚合酶识别、结合的部位。
(2)终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，其位于基因的尾端——其作用是使转录过程停止。
(3)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，二者分别控制翻译过程的启动和终止。
易错点4 切割目的基因与切割载体时是否“只能”使用“同一种酶”？
点拨 (1)在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(2)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上切口两侧均具有两个不同的黏性末端，但又能彼此嵌入。
[规范答题]
下表中列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。请回答下列问题：
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有几个游离的磷酸基团？ 。
(2)组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造，人工改造质粒时，要使目的基因能成功表达，还应插入 。若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越低还是越高？
_______________________________________________________________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，能否使用Sma Ⅰ切割？为什么？__________________________________________________________________。
(4)构建重组质粒时能否使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA？ ，如果能同时使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶，与只使用EcRⅠ相比较，其优点在于___________________________________________。
(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。
(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了________________________。
(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在 的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
探索高考命题的奥秘(九)
[教材原型]
1.(人教版选修三P3“内文”)博耶(H.Byer)和科恩(S.Chen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达。
转换视角1
[2018·全国卷Ⅰ，38(1)]回答下列问题：
(1)博耶(H.Byer)和科恩(S.Chen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了__________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
答案 体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
[教材原型]
2.(人教版选修三P2“内文”)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
转换视角2
[2017·全国卷Ⅰ，38(5)]艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________________________
____________________________________________________________________。
答案 DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
[教材原型]
3.(人教版选修三P6“内文”)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：①能自主复制；②具有标记基因；③具有一个或多个限制酶切位点。
转换视角3
[2016·全国卷Ⅰ，40(1)]质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有 (答出两点即可)。
答案 能自我复制、具有标记基因
[教材原型]
4.(人教版选修三P13“内文”)在基因工程中，常用Ca2＋处理大肠杆菌，其目的是使之成为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子，进而使重组质粒导入细菌细胞内(或提高受体细胞的转化率)。
转换视角4
[2014·海南卷，(4)]下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。
据图回答：
在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是___________________________
____________________________________________________________________。
答案 使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的重组DNA分子
[教材原型]
5.(人教版选修三P12“内文”)在培育有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是农杆菌可感染植物，将目的基因转移到受体细胞中。
转换视角5
[2013·全国卷Ⅰ，40(1)]材料甲 科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”；科学家采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。
回答下列问题：
材料甲属于基因工程的范畴。将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用 法。构建基因表达载体常用的工具酶有 和 。在培育转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是 。
答案 显微注射 限制酶 DNA连接酶 农杆菌可感染植物，将目的基因转移到受体细胞中
[教材原型]
6.(人教版选修三P13“内文第二自然段”)由于原核生物具有一些其他生物没有的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等，因此，早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。
转换视角6
[2017·全国卷Ⅰ，38(3)]若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有 (答出两点即可)等优点。
答案 繁殖快、容易培养
[教材原型]
7.(人教版选修三P5“内文第二自然段”)
DNA连接酶——“分子缝合针”
根据酶的来源不同，可以将DNA连接酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E·cli DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键(图1－4)，但这两种酶的作用有所差别：E·cliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
转换视角7
[2016·全国卷Ⅲ，40(3)]DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和 ，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________________________________________________________________。
答案 E·cliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
[教材原型]
8.(人教版选修三P26“内文第四自然段”)我们知道，天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：基因→表达(转录和翻译)→形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能；而蛋白质工程却与之相反，它的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)(图1－29)。
转换视角8
[2015·全国卷Ⅱ，40(3)]蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_____________________________________________
和 ，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对合成蛋白质的生物 进行鉴定。
答案 设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
eq \a\vs4\al\c1(课后·强化训练)
(时间：20分钟)
1.(2019·四川绵阳一诊)基因工程的应用十分广泛，利用此项技术可创造出更加符合人类需求的优良品种或产品。如美洲拟鲽(是鲽科下的一种比目鱼)的体液中存在抗冻蛋白，能够降低鱼的血液冰点。科学家按cDNA路线分离和克隆了抗冻蛋白基因，并将其导入番茄，获得了抗冻的番茄品种。根据有关知识，回答下列问题：
(1)基因工程操作的核心步骤为 ，以mRNA为材料可获得cDNA，其原理是________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(2)将目的基因导入植物的细胞最常用的方法是___________________________。
(3)构建重组质粒，需要限制性内切酶切取目的基因、切割质粒。限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—C↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？ 理由是________________________________________________。
(4)质粒作为基因工程常用运载体必需具备的条件是_______________________
______________________________________________________________________(至少答2点)。
答案 (1)基因表达载体的构建 在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA (2)农杆菌转化法 (3)可以 因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同 (4)能在宿主细胞内复制并稳定保存；具有多个限制酶切位点，有利于剪切
2.(2019·四川广安眉山一诊)白僵菌可感染农业害虫，因而可用来防治农业害虫。由于白僵菌对草丁膦(一种除草剂)敏感，且杀死害虫的能力较弱，科研人员将Bar基因(抗除草剂基因)和毒蛋白基因导入白僵菌进行基因工程改造，流程如图所示：
(1)从苏云金芽孢杆菌中获取的毒蛋白基因，通过PCR技术可以在体外大量扩增。该扩增过程需要提供 种引物，所需添加的酶是 。
(2)图中形成重组质粒1时需要的限制酶是 ；形成重组质粒2除了需要限制酶XbaⅠ外，还需要 酶。
(3)将重组质粒2导入经 处理成为感受态的白僵菌，一段时间后用含有 的平板培养基进行筛选，获得含有Bar基因的重组白僵菌。
(4)为了判断重组白僵菌的杀虫效果，科研人员接下来应该 。
答案 (1)两 耐热的DNA聚合酶 (2)NcⅠ、BamHⅠ DNA连接 (3)Ca2＋ 草丁膦 (4)将重组白僵菌喷涂在植物叶片上，再用此叶片饲喂害虫，记录单位时间内的害虫死亡的数
3.(2019·广东七校联考)真核生物基因中通常含有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。下图表示从基因文库提取胰岛素基因的过程。回答下列问题：
(1)从基因结构分析，与基因组文库中的基因相比，cDNA文库中获得的目的基因少了 等结构(至少写两个)。
(2)将获得的胰岛素基因导入受体菌内，并在受体菌内维持稳定和表达的过程，在基因工程中称为 。
(3)过程⑤需将纤维素膜上的细菌裂解，释放出 ，再用32P标记的 作为探针进行杂交。依据杂交结果，应选取培养基上 (填字母)菌落继续培养，才能获得含有胰岛素基因的受体菌。
(4)经过目的基因的检测和表达，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是_________________________________
____________________________________________________________________。
(5)与从基因组文库获取目的基因相比，图示方法获得的目的基因在受体菌中更容易表达，原因是______________________________________________________
____________________________________________________________________。
答案 (1)启动子、终止子、内含子
(2)转化
(3)DNA 目的基因(或胰岛素基因) a
(4)受体菌中没有内质网和高尔基体，不能对基因表达获得的蛋白质进行加工
(5)cDNA中不含有内含子，转录出的RNA不需要经过加工，可直接作为合成蛋白质的模板
4.(2019·山东聊城模拟)普通番茄细胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(简称PG)，PG能破坏细胞壁，使番茄软化不耐贮藏。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。下图表示抗PG基因的作用原理，回答下列问题：
(1)据图回答该转基因番茄具有抗软化、保鲜时间长的原理是_______________
____________________________________________________________________
(2)为培育抗软化番茄，应采用 技术将抗PG基因进行体外扩增。在该技术的反应体系中除模板、引物、原料外，还需要加入 ，这个基因的表达需要 等不可缺少的调控组件。
(3)将抗PG基因插入Ti质粒的 上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功导入，在个体生物学水平上应检测__________________________________________________。
(4)为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入 (填“细胞核”或“细胞质”)。
答案 (1)抗PG基因能阻止PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG
(2)PCR(多聚酶链式反应) 热稳定DNA聚合酶(Taq酶) 启动子、终止子
(3)T－DNA 转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短 (4)细胞质
5.(2019·四川遂宁一诊)我国一科研团队将小麦液泡膜Na＋/K＋逆向转运蛋白基因(TaNHX2基因)转移到水稻细胞内，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：
(1)为保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的 。
A.复制原点 B.启动子 C.标记基因
(2)水稻的转化过程为：将水稻幼胚接种到诱导培养基上，经过 过程，培养出愈伤组织，然后用 法，将目的基因和相关功能片段整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，最后诱导愈伤组织形成水稻植株。
(3)为验证外源基因整合到水稻基因组后是否转录，可从转基因植株的细胞中提取所有mRNA并反转录成 ，再以反转录产物为模板，利用TaNHX2基因特异引物，通过 方法进行基因扩增。若以根细胞为材料扩增结果为阳性(有产物生成)，以叶细胞为材料扩增结果为阴性(无产物生成)，则说明___________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
(4)将生长至4叶期的转基因幼苗转入高浓度的NaCl溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照。培养30天后观察现象，若 则说明转基因植株获得了耐盐特性。
答案 (1)B (2)脱分化 农杆菌转化法 (3)cDNA(互补DNA) PCR 目的基因(TaNHX2基因)仅在根细胞中转录，未在叶细胞中转录 (4)转基因植株存活率高于非转基因植株(转基因植株叶片不变黄，非转基因植株叶片变黄，其他答案合理即可)
6.(2019·山东潍坊模拟)人参是珍贵的药用植物，研究人员运用转基因技术构建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞表达系统，为珍贵药用植物与疫苗联合应用开辟了新思路，其构建过程如图所示，图中SmaⅠ、SatⅠ、EcRⅤ为限制酶。请回答相关问题：
(1)②的构建过程除限制酶外还需要 酶；想要从②中重新获得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcRV或Sma Ⅰ，原因是_______________________
_____________________________________________________________________。
(2)将重组质粒转入农杆菌常用 处理细胞；要使目的基因成功整合到人参细胞的染色体上，该过程所采用的质粒应含有 。
(3)分析图可知，②中应含有的标记基因是________________________________；
过程⑤的目的是____________________________________________________。
(4)该疫苗进入机体后可刺激机体产生能与乙肝病毒特异性结合的 ，同时还能产生 使机体长期对乙脏病毒具有免疫力。
答案 (1)DNA连接 两平末端连接后的重组序列不能再被EcRⅤ和Sma Ⅰ识别(重组质粒无这种限制酶的识别序列)
(2)钙离子 T－DNA
(3)氨苄青霉素抗性基因 筛选出含有HBsAg基因的人参细胞
(4)抗体 记忆细胞
7.(2019·广东模拟)烟草易受烟草花叶病毒(TMV)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染，研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草，操作流程如下图所示。请回答下列问题：
(1)过程①所用RNA可以从 中获取。
(2)过程②可以采用 技术获得大量目的基因，该技术的实质是________________________________________________________________________。
(3)过程④最常用的方法是 ，该方法中需将目的基因插入受体细胞的 上。
(4)过程⑤所用到的培养基除了卡那霉素之外，还需要加注的特殊物质是 。过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定，在分子水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是 。
答案 (1)绞股蓝细胞的细胞质基质 (2)PCR(或多聚酶链式反应) DNA复制 (3)农杆菌转化法 染色体DNA (4)植物激素(或生长素和细胞分裂素) 抗原—抗体杂交
8.(2019·广东佛山质检)油菜籽中蛋白质和油脂的相对含量，与酶1和酶2对共同底物丙酮酸的竞争有关。 酶1促进蛋白质的合成，酶2促进油脂的合成。通过生物工程技术对油菜进行改造，以得到含有基因A的油菜，流程图如下。请据图作答：
(1)上述改造过程中运用的生物工程技术是 。
(2)通过 、 或人工化学合成等方法，都可获取目的基因A。过程①中的处理方法为_____________________________________________________。
(3)过程④中要防止杂菌污染的原因是 。通过过程④得到的油菜植株中，所有细胞 (填“一定”“不一定”或“一定不”)含有基因A。
(4)已知转录时基因A的模板链与酶1基因的模板链互补。相对普通油菜，含基因A的油菜籽粒油脂含量显著提高，请分析其机理： __________________________
___________________________________________________________________。
答案 (1)基因工程、植物组织培养 (2)从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 Ca2＋处理法 (3)杂菌会竞争培养基中的营养物质，还可能产生有毒有害物质 不一定 (4)基因A转录的mRNA与酶1基因转录的mRNA互补，阻碍了酶1基因的mRNA翻译，降低了酶1含量，酶2对丙酮酸的竞争增强，促进了油脂合成
最新考纲
全国卷考情
1.基因工程的诞生(Ⅰ)
2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)
3.基因工程的应用(Ⅱ)
4.蛋白质工程(Ⅰ)
5.实验：DNA的粗提取与鉴定
2018·全国卷Ⅰ(38)、
2018·全国卷Ⅱ(38)、
2017·全国卷Ⅰ(37)、
2017·全国卷Ⅱ(37)、
2017·全国卷Ⅲ(37)、
2016·全国卷Ⅰ(40)、
2016·全国卷Ⅲ(40)
常用类型
E·cli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
只“缝合”黏性末端
“缝合”黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
基因文库类型
基因组文库
部分基因文库(cDNA文库)
构建基因文库的过程
其他区别
①含某种生物全部基因
②有启动子、有内含子
③部分可与其他生物基因交流
①含该种生物“部分”基因
②无启动子，无内含子
③均可与其他生物基因交流
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
项目
蛋白质工程
基因工程
实质
定向改造或生产人类所需蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果
生产自然界中没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现
过程
说明
图解
变性
加热至90～95 ℃，DNA解链为单链
复性
冷却至55～60 ℃，两种引物结合到互补DNA链
延伸
加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成
物质的量浓度为2 ml/L NaCl溶液
物质的量浓度为0.14 ml/L NaCl溶液
溶解规律
DNA
溶解
析出
蛋白质
部分发生盐析沉淀
溶解
NaCl溶液浓度从2 ml/L降低过程中溶解度逐渐增大
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 ml/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 ml/L，使DNA析出
用纱布过滤4次
①过滤血细胞破裂流，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 ml/L的NaCl充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 ml/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 ml/L的NaCl溶液
用NaCl
①加2 ml/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 ml/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 ml/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 ml/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
细胞内DNA复制
体外DNA扩增(PCR)
解旋
边解旋边复制
高温解旋，双链完全分开
酶
解旋酶、DNA聚合酶
热稳定DNA聚合酶
引物
RNA
DNA、RNA
温度
体内温和条件
高温
能量
ATP
不加
循环次数
生物体自身控制
30多次
相同点
提供DNA模板；4种脱氧核苷酸为原料；子链延伸的方向都是从5′到3′端
答卷采样
错因分析
考虑问题不全面，没有认真分析题中的图示质粒。
正确答案：启动子和终止子
思维定热势，理解错误，误认为构建重组质粒时只能使用同一种限制酶切割。
正确答案是：能，可以防止止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
混淆DNA聚合酶与DNA连接酶
正确答案：DNA连接酶
答题不严密，必须强调蔗糖为唯一碳源
正确答案：蔗糖为唯一含碳营养物质