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第3章 基因工程 微专题3 基因工程相关技术及过程分析课件PPT
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高中同步学案优化设计GAO ZHONG TONG BU XUE AN YOU HAU SHE JI第3章2023一、PCR技术1.PCR技术的原理与条件2.PCR技术的过程 典例1基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库包括 和 。 (2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是 。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。 (3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。 答案 (1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90 ℃以上 氢键 (3)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活解析 (1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的,而在体外利用PCR技术扩增目的基因时,则是通过加热至90 ℃以上进行解聚的,二者都破坏了碱基对中的氢键。(3)在PCR过程中,要加热至90 ℃以上,所以使用热稳定性高的Taq酶,而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。变式训练1 (多选)(2021江苏宜兴中学高二期中)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR的叙述正确的是( )A.为保证模板链与引物结合的效率,两种引物之间尽量避免存在互补序列B.引物与模板链结合后,引导子链从引物的5'端开始延伸C.两种引物上设计加入不同限制酶识别序列,主要目的是使目的基因定向插入运载体D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关答案 AC解析 引物自身不应存在互补序列,否则会出现引物与自身配对、引物跟引物配对情况,降低PCR的效率,A项正确;DNA复制时,引物先与模板链配对结合,然后在引物的3'端进行子链延伸,在引物的5'端不能进行子链延伸,B项错误;设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自身环化的现象,为了便于扩增的DNA片段与载体连接,常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别位点,主要目的是使目的基因能定向插入表达载体,避免目的基因自身环化,C项正确;复性所需温度与时长和引物有关,而延伸所需的温度、时长与引物无关,D项错误。变式训练2 (2021山东济宁高二期中)新冠疫情的快速控制,离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒(RNA病毒)的快速检测能力。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量,其原理是:在PCR反应体系中加入引物的同时,加入与某条模板链互补的荧光探针(被荧光标记的核苷酸链),当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如图1)。随着PCR的进行,荧光信号的强度也等比例增加,可通过荧光强度的变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图(如图2)。Ct值(循环阈值)的含义为:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。请回答下列问题。(1)上海团队是利用体外培养的人肝癌细胞分离出新型冠状病毒毒株的。体外培养人肝癌细胞时,应满足所需要的营养、 、温度、pH和渗透压、气体环境等条件。若使用合成培养基还需要添加血清,因为 。 (2)新冠病毒是一种单链RNA病毒,检测时取检测者的mRNA,在逆转录酶的作用下合成cDNA,再在反应体系中加入引物、 、4种脱氧核苷酸(dNTP)、缓冲体系、荧光标记的新冠病毒核酸探针。引物的作用是 。PCR每个循环包括 3个阶段。 (3)图2中“平台期”出现的最可能的原因是 。理论上,在检测过程中,有荧光标记的“杂交双链”出现,则说明检测结果呈 (填“阴”或“阳”)性,但为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊,Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越 。 答案 (1)无菌无毒的环境 人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚 (2)耐高温的DNA聚合酶 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 变性、复性、延伸 (3)反应体系中的原料(引物,探针)数量一定,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链”不再增加 阳 少解析 (1)利用动物细胞培养技术体外培养人肝癌细胞时,应满足细胞生长和增殖所需要的营养、温度、pH、气体环境和无菌无毒等条件。由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚,若使用合成培养基,还需要添加血清、血浆等一些天然成分。(2)荧光PCR法基本原理是:将新冠病毒mRNA逆转录为DNA,通过采用多重荧光RT—PCR技术,因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)、荧光标记的新冠病毒核酸探针、逆转录酶、引物、dNTP、缓冲体系。引物是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,作用是使热稳定DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR技术中的每个循环由变性、复性、延伸三个基本反应步骤构成。(3)分析荧光扩增曲线图,图中曲线通过荧光强度变化反映产物量的变化,因此曲线中“平台期”出现的最可能原因是试剂盒中的原料(引物、探针)数量一定,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链不再增加”;理论上,在检测过程中,有荧光标记的“杂交双链”出现,则说明检测结果呈阳性,为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊。由题可知Ct值越大,该反应管内的荧光信号到达设定阈值经历的循环数越大,即每次循环出现的荧光信号越少,每次循环出现的荧光信号越少,代表被检测样本中的病毒数目越少,患者危险性越小。二、认识“单酶切法”和“双酶分别切割法”构建基因表达载体时,可以釆用以下两种方法(如下图)。①单酶切法:用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段;②双酶分别切割法:用两种能产生相同末端DNA片段的限制酶切割。1.“单酶切法”和“双酶分别切割法”均能成功构建基因表达载体。2.与“单酶切法”相比,“双酶分别切割法”不要求载体和目的基因两侧具有同一种限制酶的识别序列,只要两种限制酶切割后形成的黏性末端是互补(相同)的即可。3.“单酶切法”和“双酶分别切割法”都不能避免载体和目的基因的自身环化,也不能避免载体与目的基因的反向连接。典例2(2021江苏南通三模)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,现可以用基因工程技术获取重组HSA(rHSA)。下图甲为获取的含有目的基因(HSA基因)的DNA片段,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶,图中箭头所指为三种限制酶的切点;图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图;图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请回答下列问题。(1)三种限制酶中能产生相同黏性末端的是 ;为了使目的基因与质粒定向连接,切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用 酶,所得重组质粒 (填“能”“不能”或“不一定能”)被BamHⅠ切割。 (2)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,这里所说的膜系统是指 。 (3)获取HSA基因还可以通过下列方式:首先采集人的血液,从中提取 合成总cDNA,然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。 (4)已知HSA基因一条链两端的碱基序列为:5'-CTTCGAAATTC-HSA基因—TCTCCCGATCGG-3'请根据其两端碱基序列设计一对引物,引物Ⅰ、Ⅱ分别是:磷酸端- -羟基端;磷酸端- -羟基端。1个DNA分子经PCR扩增,第n次时需要消耗引物Ⅰ 个。 答案 (1)BamHⅠ和Sau3AⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ 不一定能 (2)内质网膜、高尔基体膜 (3)mRNA (4)CTTCGAAATTC CCGATCGGGAGA(引物Ⅰ、Ⅱ顺序可换) 2n-1解析 (1)根据图乙分析可知,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamH Ⅰ三种限制酶,产生相同黏性末端的是BamHⅠ和Sau3AⅠ,其黏性末端为(-GATC-);为了防止目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的连接方向不确定等情况,应该选择不同的限制酶切割目的基因的两侧以及质粒,结合图甲和图丙分析,Sau3AⅠ会破坏目的基因,应该选择EcoRⅠ和BamHⅠ切割图甲所示DNA片段。结合以上分析以及Sau3AⅠ与BamHⅠ酶的识别序列可知,形成的重组质粒上肯定含有EcoRⅠ、Sau3AⅠ的识别位点,不一定含有BamHⅠ的识别位点,所以所得重组质粒不一定能被BamHⅠ切割。(2)人体合成的初始HSA多肽,需要经过内质网的加工修饰,以及高尔基体的进一步加工、分类和包装,才可具有生物学活性,故需要膜系统:内质网膜和高尔基体膜。(3)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。首先采集人的血液,从中提取mRNA合成总cDNA,然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因,其特点是不含启动子(和终止子)、内含子等。(4)PCR技术是以从生物材料中提取的DNA作为模板,利用引物寻找HSA基因的位置并进行扩增。故引物是基因两端的碱基序列。根据题意可知,引物Ⅰ为磷酸端-CTTCGAAATTC-羟基端;引物Ⅱ为磷酸端-CCGATCGGGAGA-羟基端(引物Ⅰ和引物Ⅱ顺序可互换)。1个DNA分子经PCR扩增,第n次时将具有DNA分子数为2n;第n-1次时将具有DNA分子数为2n-1;故第n次比第n-1次增加的DNA分子数为2n-2n-1=2n-1,故需要引物Ⅰ的个数为2n-1。变式训练3 棉蚜是棉花的主要害虫之一。雪花莲凝集素(GNA)与尾穗苋凝集素(ACA)具有良好抗蚜虫效果。研究人员将GNA基因与ACA基因连接成融合基因GA,并构建双抗虫基因的重组表达载体转入棉花,过程如下图。下列叙述错误的是( )A.构建植物表达载体,应选用BsaB Ⅰ、Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ酶切B.KpnⅠ、XhoⅠ双酶切可确保融合基因与载体的正确连接C.用农杆菌转化法将目的基因转入棉花愈伤组织需无菌操作D.可用DNA分子杂交或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达答案 D解析 分析题图,用KpnⅠ与BsaBⅠ酶切可获得GNA基因,用BsaBⅠ与XhoⅠ酶切可获得ACA基因;GNA基因与ACA基因都具有BsaBⅠ酶切产生的相同末端,二者可用同一种DNA连接酶连接成融合基因GA;载体与融合基因GA都具有XhoⅠ酶切产生的相同末端及KpnⅠ酶切产生的相同末端,可用相应的DNA连接酶连接融合基因GA与载体以构建植物表达载体,A项正确;KpnⅠ、XhoⅠ双酶切可使确保融合基因与载体产生相同的末端以确保二者的正确连接,B项正确;用农杆菌转化法将目的基因转入棉花愈伤组织需无菌操作以防止杂菌污染干扰实验,C项正确;用DNA分子杂交技术检测是否插入了目的基因,抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达,D项错误。变式训练4 人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主,接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。(1)血源性“乙型肝炎疫苗”是取用乙肝病毒感染者的血液,用高速离心提纯血液中的乙肝病毒,之后再灭活,制成乙肝疫苗。乙肝病毒结构中的 成分是激发免疫反应的抗原。 (2)下图为“乙肝基因工程疫苗”的生产和使用过程,质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal,从而使菌落显现出蓝色,若无该基因,菌落则成白色。图中过程①有两种限制酶选择方案,它们分别是 或 。 (3)获取目的基因的方法除了图中用酶切的方法从细胞中分离以外,还可以通过 来获得。据图可知,该目的基因的具体功能是 。 (4)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌,可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入 和 ,培养一段时间挑选出 色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 答案 (1)蛋白质 (2)只用BamHⅠ 同时用EcoR Ⅰ和BamHⅠ (3)化学方法人工合成(PCR技术扩增) 指导乙肝病毒蛋白质外壳的合成 (4)青霉素 X-gal 白解析 (1)乙肝病毒结构包括核酸和蛋白质外壳,其中蛋白质外壳是激发免疫的抗原。(2)根据图解可知,含有目的基因的外源DNA和载体上都有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅤ的识别序列和切割位点,用EcoRⅤ切割会破坏目的基因,因此图中过程①有两种限制酶选择方案,它们分别是只用BamHⅠ或同时用EcoRⅠ和BamHⅠ。(3)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。根据图中④目的基因最终产生乙肝病毒外壳进行接种,说明该目的基因具体功能是指导合成乙肝病毒蛋白。(4)用限制酶BamHⅠ切割时破坏了lacZ基因,但没有破坏青霉素抗性基因,因此为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌,可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X-gal,根据题干信息“质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal,从而使菌落显现出蓝色,若无该基因,菌落则成白色”可知,培养一段时间挑选出白色的菌落进一步培养获得大量目的菌。三、基因工程中基因的表达及遗传特点1.载体中有限制酶酶切位点,供目的基因插入其中。携带目的基因的载体进入受体细胞以后,能够在细胞内进行自我复制,或者整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制、表达。2.目的基因插入的位置不同,可能遵循孟德尔遗传定律,也可能不遵循孟德尔遗传定律。典例3(2020山东)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻,实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑,从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需的酶是 ,重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。 (2)根据启动子的作用推测,Wx基因启动子序列的改变影响了 ,从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填“发生”或“不发生”)改变,原因是 。 (3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经 过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是 。 (4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示,据图推测糯性最强的品系为 ,原因是 。 答案 (1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶 转化 (2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (4)品系3 品系3的WxmRNA最少,控制合成的直链淀粉合成酶最少,直链淀粉合成量最少,糯性最强解析 (1)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开;DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合,从而改变了Wx基因的转录水平,使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知,基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑,由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子,所以与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录,需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合,故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板,根据题图分析可知,4个品系中品系3的WxmRNA量最低,控制合成的直链淀粉合成酶最少,直链淀粉合成量最少,糯性最强。变式训练5 某一品系的棉花野生型植株既不抗虫也不抗除草剂,下图为构建转基因植株M(抗虫、抗除草剂)的过程示意图,下列叙述错误的是( )A.采用Ti质粒作为载体的优势是其具备控制质粒转移的T-DNA片段B.应用CaCl2处理农杆菌能使重组质粒更容易进入其中C.过程⑤可能依次经历了愈伤组织→胚状体→完整植株的过程D.基因A、B可能插入到细胞M的染色体上,但不可能同时存在于同一条染色体上答案 D解析 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上,因此采用Ti质粒作为载体的优势是其具备控制质粒转移的T-DNA片段,A项正确;应用CaCl2处理农杆菌能使其成为感受态,使重组质粒更容易进入其中,B项正确;过程⑤为植物组织培养的过程,依次经历了愈伤组织→胚状体→完整植株的过程,C项正确;基因A、B可能插入到细胞M的染色体上,且是随机插入,所以两个基因可能分别插入到两条非同源染色体上或一对同源染色体上,也可能同时存在于同一条染色体上,D项错误。变式训练6 (2021福建莆田二中高二月考)下图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。请回答下列问题。(1)A→B利用的技术称为 ,该技术所需的条件有模板、 、 、 。 (2)图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程,该过程为构建 ,目的是 。该过程中,要将目的基因插入Ti质粒的 中。 (3)上述流程示意图中,将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是 法,该方法一般 (填“适宜”或“不适宜”)用于将目的基因导入单子叶植物。 (4)鉴定抗虫基因在G体内是否表达,在个体水平上需要做 实验。如果抗虫基因导入成功,且与某条染色体的DNA整合起来,该转基因抗虫棉可视为杂合子,将该转基因抗虫棉自交一代,预计后代中抗虫植株占 。 答案 (1)PCR DNA聚合酶(Taq酶) 引物 四种脱氧核糖核苷酸 (2)基因表达载体 使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用 T-DNA (3)农杆菌转化 不适宜 (4)抗虫接种 3/4解析 (1)A→B利用的技术称为PCR,利用PCR技术扩增目的基因的条件:模板DNA、原料(四种脱氧核糖核苷酸)、引物、热稳定性DNA聚合酶(Taq酶),其中②过程需要热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)才能完成。(2)图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程,该过程为构建基因表达载体(重组DNA),其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用,需要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中。(3)上述流程示意图中,将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是农杆菌转化法,由于农杆菌对大多数的单子叶植物没有感染作用,所以该方法一般不适宜用于将目的基因导入单子叶植物。(4)欲确定抗虫基因是否整合在G的染色体DNA上,可以用DNA分子杂交的方法进行检测。在个体水平上,可用植株G的叶子喂食虫子,即抗虫性接种实验,观察其抗虫的能力。如果抗虫基因导入成功,且已经整合到宿主细胞一条染色体的DNA上,则该转基因抗虫棉可视为杂合子Gg,将该转基因抗虫棉自交一代,根据基因分离定律,预计后代中抗虫植株占3/4。
高中同步学案优化设计GAO ZHONG TONG BU XUE AN YOU HAU SHE JI第3章2023一、PCR技术1.PCR技术的原理与条件2.PCR技术的过程 典例1基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库包括 和 。 (2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是 。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。 (3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。 答案 (1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90 ℃以上 氢键 (3)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活解析 (1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的,而在体外利用PCR技术扩增目的基因时,则是通过加热至90 ℃以上进行解聚的,二者都破坏了碱基对中的氢键。(3)在PCR过程中,要加热至90 ℃以上,所以使用热稳定性高的Taq酶,而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。变式训练1 (多选)(2021江苏宜兴中学高二期中)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR的叙述正确的是( )A.为保证模板链与引物结合的效率,两种引物之间尽量避免存在互补序列B.引物与模板链结合后,引导子链从引物的5'端开始延伸C.两种引物上设计加入不同限制酶识别序列,主要目的是使目的基因定向插入运载体D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关答案 AC解析 引物自身不应存在互补序列,否则会出现引物与自身配对、引物跟引物配对情况,降低PCR的效率,A项正确;DNA复制时,引物先与模板链配对结合,然后在引物的3'端进行子链延伸,在引物的5'端不能进行子链延伸,B项错误;设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自身环化的现象,为了便于扩增的DNA片段与载体连接,常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别位点,主要目的是使目的基因能定向插入表达载体,避免目的基因自身环化,C项正确;复性所需温度与时长和引物有关,而延伸所需的温度、时长与引物无关,D项错误。变式训练2 (2021山东济宁高二期中)新冠疫情的快速控制,离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒(RNA病毒)的快速检测能力。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量,其原理是:在PCR反应体系中加入引物的同时,加入与某条模板链互补的荧光探针(被荧光标记的核苷酸链),当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如图1)。随着PCR的进行,荧光信号的强度也等比例增加,可通过荧光强度的变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图(如图2)。Ct值(循环阈值)的含义为:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。请回答下列问题。(1)上海团队是利用体外培养的人肝癌细胞分离出新型冠状病毒毒株的。体外培养人肝癌细胞时,应满足所需要的营养、 、温度、pH和渗透压、气体环境等条件。若使用合成培养基还需要添加血清,因为 。 (2)新冠病毒是一种单链RNA病毒,检测时取检测者的mRNA,在逆转录酶的作用下合成cDNA,再在反应体系中加入引物、 、4种脱氧核苷酸(dNTP)、缓冲体系、荧光标记的新冠病毒核酸探针。引物的作用是 。PCR每个循环包括 3个阶段。 (3)图2中“平台期”出现的最可能的原因是 。理论上,在检测过程中,有荧光标记的“杂交双链”出现,则说明检测结果呈 (填“阴”或“阳”)性,但为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊,Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越 。 答案 (1)无菌无毒的环境 人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚 (2)耐高温的DNA聚合酶 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 变性、复性、延伸 (3)反应体系中的原料(引物,探针)数量一定,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链”不再增加 阳 少解析 (1)利用动物细胞培养技术体外培养人肝癌细胞时,应满足细胞生长和增殖所需要的营养、温度、pH、气体环境和无菌无毒等条件。由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚,若使用合成培养基,还需要添加血清、血浆等一些天然成分。(2)荧光PCR法基本原理是:将新冠病毒mRNA逆转录为DNA,通过采用多重荧光RT—PCR技术,因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)、荧光标记的新冠病毒核酸探针、逆转录酶、引物、dNTP、缓冲体系。引物是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,作用是使热稳定DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR技术中的每个循环由变性、复性、延伸三个基本反应步骤构成。(3)分析荧光扩增曲线图,图中曲线通过荧光强度变化反映产物量的变化,因此曲线中“平台期”出现的最可能原因是试剂盒中的原料(引物、探针)数量一定,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链不再增加”;理论上,在检测过程中,有荧光标记的“杂交双链”出现,则说明检测结果呈阳性,为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊。由题可知Ct值越大,该反应管内的荧光信号到达设定阈值经历的循环数越大,即每次循环出现的荧光信号越少,每次循环出现的荧光信号越少,代表被检测样本中的病毒数目越少,患者危险性越小。二、认识“单酶切法”和“双酶分别切割法”构建基因表达载体时,可以釆用以下两种方法(如下图)。①单酶切法:用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段;②双酶分别切割法:用两种能产生相同末端DNA片段的限制酶切割。1.“单酶切法”和“双酶分别切割法”均能成功构建基因表达载体。2.与“单酶切法”相比,“双酶分别切割法”不要求载体和目的基因两侧具有同一种限制酶的识别序列,只要两种限制酶切割后形成的黏性末端是互补(相同)的即可。3.“单酶切法”和“双酶分别切割法”都不能避免载体和目的基因的自身环化,也不能避免载体与目的基因的反向连接。典例2(2021江苏南通三模)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,现可以用基因工程技术获取重组HSA(rHSA)。下图甲为获取的含有目的基因(HSA基因)的DNA片段,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶,图中箭头所指为三种限制酶的切点;图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图;图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请回答下列问题。(1)三种限制酶中能产生相同黏性末端的是 ;为了使目的基因与质粒定向连接,切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用 酶,所得重组质粒 (填“能”“不能”或“不一定能”)被BamHⅠ切割。 (2)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,这里所说的膜系统是指 。 (3)获取HSA基因还可以通过下列方式:首先采集人的血液,从中提取 合成总cDNA,然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。 (4)已知HSA基因一条链两端的碱基序列为:5'-CTTCGAAATTC-HSA基因—TCTCCCGATCGG-3'请根据其两端碱基序列设计一对引物,引物Ⅰ、Ⅱ分别是:磷酸端- -羟基端;磷酸端- -羟基端。1个DNA分子经PCR扩增,第n次时需要消耗引物Ⅰ 个。 答案 (1)BamHⅠ和Sau3AⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ 不一定能 (2)内质网膜、高尔基体膜 (3)mRNA (4)CTTCGAAATTC CCGATCGGGAGA(引物Ⅰ、Ⅱ顺序可换) 2n-1解析 (1)根据图乙分析可知,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamH Ⅰ三种限制酶,产生相同黏性末端的是BamHⅠ和Sau3AⅠ,其黏性末端为(-GATC-);为了防止目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的连接方向不确定等情况,应该选择不同的限制酶切割目的基因的两侧以及质粒,结合图甲和图丙分析,Sau3AⅠ会破坏目的基因,应该选择EcoRⅠ和BamHⅠ切割图甲所示DNA片段。结合以上分析以及Sau3AⅠ与BamHⅠ酶的识别序列可知,形成的重组质粒上肯定含有EcoRⅠ、Sau3AⅠ的识别位点,不一定含有BamHⅠ的识别位点,所以所得重组质粒不一定能被BamHⅠ切割。(2)人体合成的初始HSA多肽,需要经过内质网的加工修饰,以及高尔基体的进一步加工、分类和包装,才可具有生物学活性,故需要膜系统:内质网膜和高尔基体膜。(3)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。首先采集人的血液,从中提取mRNA合成总cDNA,然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因,其特点是不含启动子(和终止子)、内含子等。(4)PCR技术是以从生物材料中提取的DNA作为模板,利用引物寻找HSA基因的位置并进行扩增。故引物是基因两端的碱基序列。根据题意可知,引物Ⅰ为磷酸端-CTTCGAAATTC-羟基端;引物Ⅱ为磷酸端-CCGATCGGGAGA-羟基端(引物Ⅰ和引物Ⅱ顺序可互换)。1个DNA分子经PCR扩增,第n次时将具有DNA分子数为2n;第n-1次时将具有DNA分子数为2n-1;故第n次比第n-1次增加的DNA分子数为2n-2n-1=2n-1,故需要引物Ⅰ的个数为2n-1。变式训练3 棉蚜是棉花的主要害虫之一。雪花莲凝集素(GNA)与尾穗苋凝集素(ACA)具有良好抗蚜虫效果。研究人员将GNA基因与ACA基因连接成融合基因GA,并构建双抗虫基因的重组表达载体转入棉花,过程如下图。下列叙述错误的是( )A.构建植物表达载体,应选用BsaB Ⅰ、Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ酶切B.KpnⅠ、XhoⅠ双酶切可确保融合基因与载体的正确连接C.用农杆菌转化法将目的基因转入棉花愈伤组织需无菌操作D.可用DNA分子杂交或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达答案 D解析 分析题图,用KpnⅠ与BsaBⅠ酶切可获得GNA基因,用BsaBⅠ与XhoⅠ酶切可获得ACA基因;GNA基因与ACA基因都具有BsaBⅠ酶切产生的相同末端,二者可用同一种DNA连接酶连接成融合基因GA;载体与融合基因GA都具有XhoⅠ酶切产生的相同末端及KpnⅠ酶切产生的相同末端,可用相应的DNA连接酶连接融合基因GA与载体以构建植物表达载体,A项正确;KpnⅠ、XhoⅠ双酶切可使确保融合基因与载体产生相同的末端以确保二者的正确连接,B项正确;用农杆菌转化法将目的基因转入棉花愈伤组织需无菌操作以防止杂菌污染干扰实验,C项正确;用DNA分子杂交技术检测是否插入了目的基因,抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达,D项错误。变式训练4 人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主,接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。(1)血源性“乙型肝炎疫苗”是取用乙肝病毒感染者的血液,用高速离心提纯血液中的乙肝病毒,之后再灭活,制成乙肝疫苗。乙肝病毒结构中的 成分是激发免疫反应的抗原。 (2)下图为“乙肝基因工程疫苗”的生产和使用过程,质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal,从而使菌落显现出蓝色,若无该基因,菌落则成白色。图中过程①有两种限制酶选择方案,它们分别是 或 。 (3)获取目的基因的方法除了图中用酶切的方法从细胞中分离以外,还可以通过 来获得。据图可知,该目的基因的具体功能是 。 (4)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌,可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入 和 ,培养一段时间挑选出 色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 答案 (1)蛋白质 (2)只用BamHⅠ 同时用EcoR Ⅰ和BamHⅠ (3)化学方法人工合成(PCR技术扩增) 指导乙肝病毒蛋白质外壳的合成 (4)青霉素 X-gal 白解析 (1)乙肝病毒结构包括核酸和蛋白质外壳,其中蛋白质外壳是激发免疫的抗原。(2)根据图解可知,含有目的基因的外源DNA和载体上都有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅤ的识别序列和切割位点,用EcoRⅤ切割会破坏目的基因,因此图中过程①有两种限制酶选择方案,它们分别是只用BamHⅠ或同时用EcoRⅠ和BamHⅠ。(3)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。根据图中④目的基因最终产生乙肝病毒外壳进行接种,说明该目的基因具体功能是指导合成乙肝病毒蛋白。(4)用限制酶BamHⅠ切割时破坏了lacZ基因,但没有破坏青霉素抗性基因,因此为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌,可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X-gal,根据题干信息“质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal,从而使菌落显现出蓝色,若无该基因,菌落则成白色”可知,培养一段时间挑选出白色的菌落进一步培养获得大量目的菌。三、基因工程中基因的表达及遗传特点1.载体中有限制酶酶切位点,供目的基因插入其中。携带目的基因的载体进入受体细胞以后,能够在细胞内进行自我复制,或者整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制、表达。2.目的基因插入的位置不同,可能遵循孟德尔遗传定律,也可能不遵循孟德尔遗传定律。典例3(2020山东)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻,实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑,从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需的酶是 ,重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。 (2)根据启动子的作用推测,Wx基因启动子序列的改变影响了 ,从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填“发生”或“不发生”)改变,原因是 。 (3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经 过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是 。 (4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示,据图推测糯性最强的品系为 ,原因是 。 答案 (1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶 转化 (2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (4)品系3 品系3的WxmRNA最少,控制合成的直链淀粉合成酶最少,直链淀粉合成量最少,糯性最强解析 (1)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开;DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合,从而改变了Wx基因的转录水平,使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知,基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑,由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子,所以与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录,需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合,故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板,根据题图分析可知,4个品系中品系3的WxmRNA量最低,控制合成的直链淀粉合成酶最少,直链淀粉合成量最少,糯性最强。变式训练5 某一品系的棉花野生型植株既不抗虫也不抗除草剂,下图为构建转基因植株M(抗虫、抗除草剂)的过程示意图,下列叙述错误的是( )A.采用Ti质粒作为载体的优势是其具备控制质粒转移的T-DNA片段B.应用CaCl2处理农杆菌能使重组质粒更容易进入其中C.过程⑤可能依次经历了愈伤组织→胚状体→完整植株的过程D.基因A、B可能插入到细胞M的染色体上,但不可能同时存在于同一条染色体上答案 D解析 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上,因此采用Ti质粒作为载体的优势是其具备控制质粒转移的T-DNA片段,A项正确;应用CaCl2处理农杆菌能使其成为感受态,使重组质粒更容易进入其中,B项正确;过程⑤为植物组织培养的过程,依次经历了愈伤组织→胚状体→完整植株的过程,C项正确;基因A、B可能插入到细胞M的染色体上,且是随机插入,所以两个基因可能分别插入到两条非同源染色体上或一对同源染色体上,也可能同时存在于同一条染色体上,D项错误。变式训练6 (2021福建莆田二中高二月考)下图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。请回答下列问题。(1)A→B利用的技术称为 ,该技术所需的条件有模板、 、 、 。 (2)图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程,该过程为构建 ,目的是 。该过程中,要将目的基因插入Ti质粒的 中。 (3)上述流程示意图中,将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是 法,该方法一般 (填“适宜”或“不适宜”)用于将目的基因导入单子叶植物。 (4)鉴定抗虫基因在G体内是否表达,在个体水平上需要做 实验。如果抗虫基因导入成功,且与某条染色体的DNA整合起来,该转基因抗虫棉可视为杂合子,将该转基因抗虫棉自交一代,预计后代中抗虫植株占 。 答案 (1)PCR DNA聚合酶(Taq酶) 引物 四种脱氧核糖核苷酸 (2)基因表达载体 使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用 T-DNA (3)农杆菌转化 不适宜 (4)抗虫接种 3/4解析 (1)A→B利用的技术称为PCR,利用PCR技术扩增目的基因的条件:模板DNA、原料(四种脱氧核糖核苷酸)、引物、热稳定性DNA聚合酶(Taq酶),其中②过程需要热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)才能完成。(2)图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程,该过程为构建基因表达载体(重组DNA),其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用,需要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中。(3)上述流程示意图中,将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是农杆菌转化法,由于农杆菌对大多数的单子叶植物没有感染作用,所以该方法一般不适宜用于将目的基因导入单子叶植物。(4)欲确定抗虫基因是否整合在G的染色体DNA上,可以用DNA分子杂交的方法进行检测。在个体水平上,可用植株G的叶子喂食虫子,即抗虫性接种实验,观察其抗虫的能力。如果抗虫基因导入成功,且已经整合到宿主细胞一条染色体的DNA上,则该转基因抗虫棉可视为杂合子Gg,将该转基因抗虫棉自交一代,根据基因分离定律,预计后代中抗虫植株占3/4。
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