生物北师大版 (2019)第二节 基因工程的基本工具教学演示课件ppt

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一、限制性内切核酸酶可以特异性切割DNA分子1.限制性内切核酸酶主要存在于微生物中。2.限制性内切核酸酶的功能:通常特异性识别4~8个碱基对,一般为反向重复序列,并在其中的特定位置进行切割。
3.限制酶的切割方式(1)EcRⅠ能识别5'-GAATTC-3'这样的序列,并且在G和A之间进行序列切割。EcRⅠ交错切割DNA,形成两条单链末端,它们之间正好是互补配对的,称为黏性末端,如图Z3-2-1所示。
(2)EcRⅤ可以识别5'-GATATC-3'这样的序列,在T和A之间的对称线处切割,产生的末端称为平末端,如图Z3-2-2所示。
二、DNA连接酶可以将DNA片段连接在一起1.作用:连接DNA片段,在两条DNA链之间催化形成磷酸二酯键。2.DNA连接酶发挥作用的条件(1)在一条DNA链的3'-末端具有一个游离的羟基(—OH),在另一条DNA链的5'-末端具有一个磷酸基团(—P)。(2)被连接的DNA分子必须是双螺旋的一部分。
三、载体是DNA分子的运载工具1.载体的三个特性(1)载体必须含有一个复制起点,能够独立于宿主染色体进行自主复制。(2)载体要含有用于筛选的标记基因,如抗药性,以便于鉴定含有载体的细胞。(3)载体要含有一个或多个限制性内切核酸酶的识别切割位点,从而便于DNA片段插入载体的特定位点。2.常见的载体(1)最常用的载体是质粒,天然质粒经过人工改造后,更加适合运载外源DNA。(2)其他载体:噬菌体载体、病毒载体、人工染色体等。
四、外源DNA与载体结合的模拟实验1.目的要求(1)模拟限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体进行外源DNA切割、连接。(2)阐明限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体的功能。2.实验原理限制性内切核酸酶能够特异性识别并切割DNA分子,外源DNA片段根据碱基互补配对的原则与切割后的载体分子进行重组。3.材料用具:(略)
4.方法步骤(1)用剪刀分别将虚线方框内的外源DNA和质粒载体DNA剪下。(2)用胶带将pUC18质粒首尾相接,连成环状。(3)用剪刀模拟限制性内切核酸酶EcRⅠ的作用,在特定部位剪切外源DNA和质粒载体DNA。(4)用胶带模拟DNA连接酶连接相应的部位。
【预习检测】 1.判断正误。(1)限制酶只能用于切割目的基因。(　　)(2)限制酶切割DNA分子具有特异性。(　　)　(3)限制酶切割DNA后可产生黏性末端或平末端。(　　)(4)DNA连接酶通过形成氢键将DNA片段连接起来。(　　)(5)DNA连接酶能将单链DNA分子进行连接。(　　)　(6)质粒是小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体。(　　)(7)载体的作用是将外源DNA送入受体细胞。(　　)　(8)限制酶通常识别4~8个碱基对,一般为反向重复序列。(　　)
2.下列有关基因工程中限制性内切核酸酶的叙述,错误的是(　　)。A.一种限制性内切核酸酶只能识别特定的碱基序列B.限制性内切核酸酶的活性受温度影响C.限制性内切核酸酶能识别和切割RNA D.限制性内切核酸酶可从原核生物中提取答案:C
3.下列关于限制酶识别序列和切开部位特点的叙述,错误的是(　　)。A.所识别的序列都可以找到一条中轴线B.中轴线两侧的双链DNA上的碱基对是反向重复序列C.只识别和切割特定的碱基序列D.在任何部位都能将DNA切开答案:D
4.若利用细菌大量生产人胰岛素,则下列叙述错误的是(　　)。A.需有适当载体将人胰岛素基因导入细菌B.需有适当的酶对载体与人胰岛素基因进行切割与连接C.重组后的DNA,可在细菌体内转录、翻译成人胰岛素D.人胰岛素基因与载体DNA混合后,只得到一种DNA分子(重组DNA)答案:D解析:将人胰岛素基因导入细菌需要载体,A项正确。将人胰岛素基因进行切割需要限制酶,将人胰岛素基因与载体连接需要DNA连接酶,B项正确。重组DNA在细菌体内可转录、翻译成人胰岛素,因为生物界共用一套遗传密码,C项正确。人胰岛素基因与载体DNA混合后,可能得到三种DNA分子,即外源DNA自连、重组DNA、载体DNA自连,D项错误。
5.图Z3-2-4表示两个核酸片段在适宜条件下,经X酶的催化作用发生的变化,则此酶是(　　)。
图Z3-2-4A.DNA连接酶　　 B.RNA聚合酶C.DNA聚合酶　D.限制酶答案:A
6.作为基因工程中的运载工具——载体,下列哪项不是其必须具备的?(　　)A.要含有一个或多个限制酶的识别切割位点,从而便于DNA片段插入载体的特定位点B.必须含有一个复制起点,能够独立于宿主染色体进行自主复制C.要含有用于筛选的标记基因,以便于鉴定含有载体的细胞D.都含青霉素抗性基因答案:D
【问题引领】1.限制酶虽然主要存在于原核生物中,但对原核生物自身DNA不会起到切割作用,为什么?提示:原核生物自身DNA上不存在限制酶的识别序列和切割位点。2.解旋酶和限制酶作用的位点一样吗?提示:不一样。解旋酶作用于互补配对的碱基之间的氢键,限制酶作用于两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。3.分析黏性末端和平末端是如何形成的。提示:限制酶交错切割DNA,就形成黏性末端。在识别序列的对称线处切割,就产生平末端。
【归纳提升】1.限制酶的作用特点(1)限制酶能识别特定的碱基序列,并把特定位点的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,一种限制酶只能识别特定的碱基序列,但并不一定只识别一种碱基序列。(2)限制酶是一类酶,不是一种酶,具有专一性,不同种类的限制酶的识别序列和切割位点不同,具有专一性,但不同限制酶切割后可能形成相同的黏性末端或平末端。
2.比较DNA酶、解旋酶、限制酶
【典型例题】下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点,由此推断,下列说法正确的是(　　)。　
注Y=C或T,R=A或G。
A.限制酶切割后不一定形成黏性末端B.限制酶的切割位点一定在识别序列的内部C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D.一种限制酶只能识别一种碱基序列答案:A解析:SmaⅠ切割后产生的是平末端,A项正确。Sau3A Ⅰ的切割位点在识别序列的外部,B项错误。BamH Ⅰ与Sau3AⅠ切割后能形成相同的黏性末端,C项错误。Hind Ⅱ能识别四种不同的碱基序列,D项错误。
【变式训练】 1.下表所示为几种限制酶的识别序列及切割位点,下列相关叙述错误的是(　　)。
A.限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键B.BamHⅠ切割的序列能被BclⅠ切割C.BclⅠ切割的序列能被Sau3AⅠ切割D.以上信息说明限制酶具有特异性和专一性
答案:B解析:由题表可知,BamHⅠ的识别序列为GGATCC,且在GG之间进行切割;BclⅠ的识别序列为TGATCA,且在TG之间进行切割;Sau3AⅠ的识别序列为GATC,且在G前面进行切割。限制酶的作用部位是DNA上的磷酸二酯键,A项正确。BamHⅠ切割的序列与BclⅠ切割的序列不同,所以BamHⅠ切割的序列不能被BclⅠ 切割,B项错误。BclⅠ的识别序列中包含Sau3AⅠ 的识别序列,而且两者切割位点相同,因此BclⅠ切割的序列能被Sau3AⅠ切割,C项正确。限制酶具有特异性和专一性,D项正确。
2.图Z3-2-5中黏性末端是由同一种限制酶切割而成的是(　　)。
图Z3-2-5A.①②　　　　　　B.③④C.②④D.②③答案:C
【问题引领】1.DNA连接酶通过形成哪种结构把两个DNA片段连接起来?提示:DNA连接酶通过形成磷酸二酯键将两个DNA片段连接起来。2.在基因工程中,DNA连接酶的连接对象是什么?提示:是外源基因(目的基因)和载体。3.能被DNA连接酶连接的DNA应符合什么条件?提示:(1)在一条DNA链的3'-末端具有一个游离的羟基,在另一条DNA链的5'-末端具有一个磷酸基团。(2)被连接的DNA分子必须是双螺旋的一部分。
【归纳提升】1.DNA连接酶的作用特点(1)基因工程中,DNA连接酶主要是将具有相同末端的目的基因和载体连接在一起,组成重组DNA分子。(2)DNA连接酶连接的DNA片段应符合以下要求:在一条DNA链的3'-末端具有一个游离的羟基,在另一条DNA链的5'-末端具有一个磷酸基团;被连接的DNA分子必须是双螺旋的一部分。
(3)催化形成的化学键是磷酸二酯键。连接示意图如图Z3-2-6所示。
2.DNA聚合酶与DNA连接酶的比较
【典型例题】下列有关DNA连接酶的说法,正确的是(　　)。A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段连接起来B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样,能连接单链DNA片段C.DNA 连接酶只能把目的基因与载体连接起来,不能把载体与载体连接起来D.DNA连接酶是把一条DNA链的3'-末端与另一条DNA链的3'-末端连接形成磷酸二酯键答案:A
解析:DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,限制酶可以特异性切割DNA分子,而DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段连接起来,A项正确。DNA连接酶连接的是双链DNA片段,而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上,B项错误。DNA连接酶能把两个具有相同末端的DNA片段连接起来,既可以把目的基因与载体连接起来,也可以把载体与载体连接起来,C项错误。DNA连接酶通过将一条DNA链的3'-末端游离的羟基与另一条DNA链的5'-末端的磷酸基团连接形成磷酸二酯键,D项错误。
【变式训练】 1.下列关于DNA连接酶的叙述,错误的是(　　)。　A.可以催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接B.可以催化相同平末端的DNA片段之间的连接C.可以催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成D.可以催化两个DNA片段的脱氧核糖与磷酸基团之间磷酸二酯键的形成答案:C
2.基因工程离不开DNA连接酶,下列有关叙述错误的是(　　)。A.DNA连接酶起作用时不需要模板B.DNA连接酶就是基因工程中的“分子黏合剂”,能连接任意DNA片段C.DNA连接酶封闭的是双螺旋DNA分子的缺口D.DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子答案:B
【问题引领】1.质粒为什么能充当“分子运输车”?提示:质粒是最常用的载体,其具备三个特性。(1)质粒上有复制起点,能够独立于宿主染色体进行自主复制。(2)质粒上含有用于筛选的标记基因,便于鉴定含有载体的细胞。(3)质粒上含有一个或多个限制酶的识别切割位点,便于DNA片段插入特定位点。
2.为什么基因工程中用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的?提示:一般来说,天然质粒往往不能满足人类的所有要求,因此人们根据不同的目的和需求,对某些天然的质粒进行人工改造。天然质粒经过人工改造后,更加适合运载外源DNA。它们一般非常小,在大肠杆菌内能自主复制,形成多个拷贝,带有某种抗性基因,能在细胞之间自由穿梭。
【归纳提升】1.载体的作用(1)用它作为运载工具,将外源DNA片段送入受体细胞。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。2.作为载体的三个特性及原因
【典型例题】图Z3-2-7是某质粒的结构示意图(a、b、c代表外源DNA片段可能的插入位点)。下表是外源DNA片段插入某位点后含重组质粒的细菌在不同培养基上的生长情况。请根据表中提供的细菌的生长情况,推测①②③三种重组细菌的外源DNA片段插入位点,正确的一组是(　　)。
A.①是c;②是b;③是aB.①是a和b;②是a;③是bC.①是a和b;②是b;③是aD.①是c;②是a;③是b答案:A解析:①细菌在两种培养基上都能生长,说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都没有被破坏,外源DNA片段插入位点是c点。②细菌在含氨苄青霉素的培养基上能生长,在含四环素的培养基上不能生长,说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,四环素抗性基因被破坏了,外源DNA片段插入位点是b点。③细菌在含四环素的培养基上能生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能生长,说明氨苄青霉素抗性基因被破坏了,四环素抗性基因没有被破坏,外源DNA片段插入位点是a点。
【变式训练】 (不定项选择题)下列有关质粒的叙述,错误的是(　　)。　A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B.细菌质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子C.质粒只有在侵入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的答案:ACD
限制性内切核酸酶选择的部分原则
1.根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类(1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图甲可选择PstⅠ或PstⅠ和EcRⅠ。(2)不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,以防破坏目的基因,如图甲不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,最好使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲选择用Pst Ⅰ 和EcR Ⅰ 两种限制酶,但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点,且切割位点不在标记基因内部。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类(1)所选限制酶与切割目的基因的限制酶产生的黏性末端要相同。(2)质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,应至少含有一个完好的标记基因,如图乙中SmaⅠ会破坏标记基因。
下表为4种限制酶的识别序列及其切割位点,请回答下列相关问题。
(1)从表中4种酶的切割位点看,可以切出平末端的酶是　　　　。 (2)限制酶切割的DNA片段的“缝合”依靠的是　　　　酶,它的作用是形成磷酸二酯键;两条链之间的碱基对通过　　　　连接起来。 
(3)图Z3-2-9中的质粒分子可被表中限制酶　　　　切割。 
(4)在相关酶的作用下,图Z3-2-9中的甲与图Z3-2-10中的乙　　　　(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由:　　　　　　　　　　　　。 答案:(1)SmaⅠ(2)DNA连接　氢键(3)EcRⅠ　(4)能　二者具有相同的黏性末端解析:(1)由题表中4种限制酶的切割位点可知,SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段“缝合”时用DNA连接酶进行连接,形成磷酸二酯键;两条链之间的碱基根据碱基互补配对原则形成氢键。(3)由题图1可知,质粒分子可被限制酶EcRⅠ切割,切割后形成链状DNA。(4)由题图可知,甲和乙的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。