2024年高考生物一轮复习（新人教版） 第10单元　解惑练4　PCR技术拓展应用

解惑练4　PCR技术拓展应用

应用1：反向PCR测定未知DNA区域

当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。

应用2：PCR定点突变技术

该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。

应用3：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR)

先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。

跟踪训练

1．如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是(　　)

A．用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序

B．用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序

C．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序

D．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序

答案　C

解析　直接选用引物①、④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物②和引物③可实现对已知的T－DNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T－DNA两侧的未知序列，C正确。

2．重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是(　　)

A．过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等

B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子

C．经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因

D．过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物

答案　B

解析　过程②为PCR反应，需要在添加了Mg2＋的缓冲液中才能进行，需要提供模板DNA、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等，A正确；两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故总共形成3种DNA分子，B错误；过程④获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；过程⑤是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D正确。

3．(2023·北京顺义区高三检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。下图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：

(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入______________________________；图甲所示的基因定点突变技术需要________次PCR；获得产物A需要的引物是____________。

(2)研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯化后，利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为____________，基因M1的长度为____________。

(3)通过图甲过程获得的基因M1仍需要大量扩增，此时选择的引物是______________，为了与图乙中的Ti质粒相连，还需要分别在它们的______端引入限制酶___________的识别序列。

(4)构建基因表达载体时，M1基因必需插入到Ti质粒的______________中，原因是________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________。

答案　(1)Taq DNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等　3　引物1和引物3　(2)0.23 kb　6.09 kb　(3)引物1和引物2　5′　HindⅢ、PstⅠ(顺序应与前面的引物对应)　(4)T－DNA　Ti质粒上的T－DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体上

解析　(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入TaqDNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等。从图甲可以看到，从加入引物到获得基因M1总共经历了3次PCR。产物A的两端互补的引物是引物1和3。(2)基因M上有3个酶切位点(箭头处)，完全酶切产生4个片段，分别为3.24 kb、2.8 kb、0.15 kb、0.13 kb，共6.32 kb，A片段酶切后产生2个片段，分别为2.8 kb、0.09 kb，B片段酶切后产生2个片段，分别为3.24 kb、0.05 kb，图中A片段和B片段的“……”是相同的，因此“……”处为0.05 kb，则基因M1的长度为2.8＋0.05＋3.24＝6.09(kb)，因此基因敲除片段的长度为6.32－6.09＝0.23 (kb)。(3)获得基因M1后，与M1两条链两端互补的引物是引物1和引物2。由于质粒上有三个酶切位点，切割后会出现不同的黏性末端，而基因M1两端没有能与黏性末端互补的序列，故需要分别在基因两条链的5′端引入限制酶的识别序列，根据基因M1插入质粒的位置可知，添加的是限制酶HindⅢ、PstⅠ的识别序列。

4．(2023·河北唐山一中高三模拟)“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2 h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光定量RT—PCR技术中的一种常用探针(如图1)，其5′端连接荧光基团(R)，3′端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题：

(1)结合图1和图2分析，“荧光RT—PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有______________酶、______________酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的____________、______________有关。

(2)根据Taqman探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据______________________。新冠病毒是冠状病毒大家庭中新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taqman探针时应筛选出该病毒特有的序列，以避免______________(填“假阴性”或“假阳性”)的出现。

(3)根据图1和图2，Taq DNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能___________________。

(4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与______________、______________有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如图3)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中________________等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。

(5)虽然荧光RT—PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有__________(填字母)。

a．通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足

b．在样本运输、检测中出现了损坏和污染

c．病毒相应关键序列发生了基因突变

答案　(1)逆转录　TaqDNA聚合　引物　Taqman探针　(2)新冠病毒RNA内部的一段序列(或新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列)　假阳性　(3)催化RNA(Taqman探针)的水解　(4)扩增次数　样品中病毒初始数量(或病毒样品模板RNA含量)　原料、引物和探针数量(或Taq DNA聚合酶活性)　(5)abc

解析　(1)图1和图2所示新冠检测的基本原理：将新冠病毒RNA逆转录为cDNA，因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有逆(反)转录酶、耐高温的DNA聚合酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。试剂盒中的引物和Taqman探针决定了这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和高灵敏性。(3)根据图1和图2可知，TaqDNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能催化RNA(Taqman探针)的水解，Taqman探针水解释放出游离R被仪器检测到。(4)在PCR扩增过程中，TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R，因此，扩增次数越多，样品中病毒初始数量(病毒样品模板RNA含量)越多，则被水解的探针越多，释放出游离的R越多，反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)也越强。由图3可知，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加，其原因最可能是试剂盒中原料、引物和探针数量(TaqDNA聚合酶活性)等有限。(5)荧光RT—PCR出现“假阴性”可能是通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足，使荧光信号强度(Rn)未达到或超过阈值而没有检测出；也可能是在样本运输、检测中出现了损坏和污染，导致新冠病毒核酸破坏而无法检测；还可能是病毒相应关键序列发生了基因突变，导致探针失效而无法检测，因此a、b、c正确。