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高考生物一轮复习讲练 第10单元 第33讲 基因工程 (含解析)
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第33讲 基因工程
[考纲要求] 1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。5.实验：DNA的粗提取与鉴定。
1．基因工程的概念
(1)供体：提供目的基因。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内的表达。
(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
③形成末端类型
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
②类型
常用类型
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
③DNA连接酶和限制酶的关系
(3)载体
①条件
条件
适应性
稳定并能自我复制或整合到染色体DNA上
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
②种类
③作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
④特点：可在细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
教材拾遗 限制酶来源于原核生物而不切割自己的DNA的原因是限制酶具有特异性，原核生物的DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰(P4寻根问底拓展)。
1．判断关于基因工程中工具酶说法的正误
(1)限制酶只能用于切割目的基因( × )
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( × )
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来( × )
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
(5)限制酶可以识别和切割RNA( × )
2．判断关于基因工程中载体说法的正误
(1)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因( × )
(2)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶切割位点( √ )
(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体( √ )
(4)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( √ )
易错警示 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
(3)不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。
(4)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。
(5)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间。
考向一 工具酶的应用分析
下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图，据图分析：
(1)请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
提示 EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。
(2)以上实例说明限制酶有何特性？
提示 说明限制酶具有专一性。
(3)要将图1中的末端再连接起来，需要用哪类连接酶，若连接图2的末端呢？
提示 连接图1中的黏性末端既可用E·coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶，连接图2中的平末端只能用T4 DNA连接酶。
(4)已知某限制性核酸内切酶的识别序列和切割位点是—C↓AATTG—，该酶作用DNA后所得末端与图1所得末端用E·coli DNA连接酶能否连接起来？若能连接起来，能否再次被EcoRⅠ限制酶识别并切割呢？
提示 能；不能。
1．如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是( )
A．甲、乙、丙都属于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA连接酶的作用位点在乙图中b处
D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
答案 C
解析 由题图可知，甲、乙、丙都属于黏性末端，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，C错误；切割甲的限制酶的识别序列和甲、乙片段形成的重组DNA分子序列不同，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
2．下列是基因工程的有关问题，请回答：
(1)限制性核酸内切酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是____________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是______________，和限制性核酸内切酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列____________(填“有”或“无”)专一性要求。
(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—。分析可知，最好选择限制酶________切割质粒，限制酶______切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是__________________________________________、___________________________________。
答案 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)DNA连接酶 无 (3)Ⅰ Ⅱ 限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏 目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列
解析 (1)限制性核酸内切酶(限制酶)能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，分别为黏性末端和平末端。
(2)目的基因和载体重组时需要DNA连接酶恢复所连接的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。多种限制酶切割，形成不同的切割位点，所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列没有专一性要求。
(3)由题干及图示可知，限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏，最好选择限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列，因此用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的DNA。
考向二 载体的应用分析
3．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案 D
解析 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于细菌拟核DNA外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
4．如图所示为pBR322质粒，其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环素抗性基因)为标记基因，ori为复制原点，其他均为限制酶及其识别位点，并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的载体。回答下列相关问题：
(1)制备重组质粒，需要限制酶和____________酶。如制备重组质粒时，使用PvuⅠ切割该质粒，则检测目的基因是否导入受体细胞，需要在培养基中添加________。
(2)该质粒中的BamHⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为—G↓GATCC—，而Sau3AⅠ识别的核苷酸序列只有4个碱基。若BamHⅠ和Sau3AⅠ分别切割DNA所形成的DNA片段能拼接成一条DNA链，则Sau3AⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为______________。该拼接在一起的DNA片段，能否被BamH Ⅰ识别？____________。
(3)与图示质粒相比，完整的重组质粒中还应有__________________等三种特殊的DNA片段。
答案 (1)DNA连接 四环素 (2)—↓GATC— 不一定能 (3)启动子、终止子和目的基因
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。
②方法
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成
小贴士 启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
③构建过程
(3)将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
2．基因工程的应用
(1)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。
(2)动物基因工程：提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(3)基因工程药物
①方法：利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。
②成果：利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
(4)比较基因治疗与基因诊断
项目
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
3.蛋白质工程
(1)概念
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②手段：基因修饰或基因合成。
③目的：合成满足人类生产和生活需求的蛋白质。
(2)流程图
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
(4)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。
1．判断关于基因工程原理与操作说法的正误
(1)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( √ )
(2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体( × )
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达( √ )
(4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术( √ )
(5)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达
( × )
2．判断关于基因工程的应用及蛋白质工程说法的正误
(1)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( × )
(2)动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质，不一定是为了产生体型巨大的个体
( √ )
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用( × )
(4)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构( × )
(5)基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质( √ )
考向一 基因工程操作程序及应用
据图分析抗虫棉的培育过程
(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？切取目的基因与切割载体时只能使用同一种限制酶吗？
提示 目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性(或平) 末端。但如果用两种不同的限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。②为了避免目的基因和载体的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体各具有两个不同的末端。
(2)目的基因的插入位点是随意的吗？
提示 不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能。
(3)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
提示 采用的方法是农杆菌转化法；由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T-DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
(4)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？
提示 抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
5．(2019·黑龙江哈尔滨六中第二次月考)绿色荧光是由绿色荧光蛋白发出的，为了培育能发出绿色荧光的小鼠，人们设计了如下的流程：
(1)获取绿色荧光蛋白基因的常用方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和_______等。
(2)绿色荧光蛋白基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物一部分基因的文库称为____________。
(3)A过程是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和______________，它们作用的化学键是__________。
(4)B过程常用的是________________技术。
(5)通常采用______________________技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。
答案 (1)人工合成 (2)cDNA文库(或部分基因文库) (3)DNA连接酶 磷酸二酯键
(4)显微注射 (5)DNA分子杂交
解析 图中A表示基因表达载体的构建过程，B表示将目的基因导入受体细胞，C表示早期胚胎培养，D表示胚胎移植，E表示妊娠。(1)获取目的基因——绿色荧光蛋白基因的方法有从基因文库中获取和人工合成等。(2)基因文库分为基因组文库和部分基因文库，其中含有一种生物所有基因的文库称为基因组文库，含有一种生物的部分基因的文库称为部分基因文库，如cDNA文库。(3)A过程表示基因表达载体的构建，是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，它们作用的化学键是磷酸二酯键。(4)将目的基因导入动物细胞采用的最多也最有效的方法是显微注射技术。(5)检测外源基因是否插入了小鼠的基因组，通常采用DNA分子杂交技术，即用外源基因制作成的DNA探针与受体细胞的基因组进行杂交，观察是否出现杂交带。
6．烟草易受烟草花叶病毒(TMV)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染，研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草，操作流程如下图所示。请回答下列问题：
(1)过程①所用RNA可以从________________________中获取。
(2)过程②可以采用___________技术获得大量目的基因，该技术的实质是________________。
(3)过程④最常用的方法是__________，该方法中需将目的基因插入受体细胞的_________上。
(4)过程⑤所用到的培养基除了卡那霉素之外，还需要加入的特殊物质是____________。过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定，在分子水平上检验获得的烟草能否抗TMV感染的方法是__________________________。
答案 (1)绞股蓝细胞的细胞质基质
(2)PCR(或多聚酶链式反应) 双链DNA复制
(3)农杆菌转化法 染色体DNA
(4)植物激素(或生长素和细胞分裂素) 抗原—抗体杂交
7．(2019·福建三明一中高三开学考)如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答：
(1)能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？__________为什么？____________________。
(2)过程②必需的酶是________酶，过程③在体外需要的条件是__________，过程④在体外必需的酶是______酶。
(3)在利用A、B获得C的过程中，必须用______________切割A和B，使它们产生___________，再加入____________________，才可形成C。
(4)C的组成除必须含有________________、________________、复制原点外，还必须有________和__________。
(5)图中的D是基因工程中的受体细胞，为了使过程⑧更易进行，可用__________处理D。
答案 (1)不能 由于基因选择性表达，人的皮肤细胞中胰岛素基因不能表达，得不到胰岛素mRNA (2)逆转录 加热 热稳定DNA聚合(Taq) (3)同一种限制酶 相同的黏性末端 DNA连接酶 (4)目的基因 标记基因 启动子 终止子 (5)Ca2＋
解析 (1)由于基因选择性表达，人的皮肤细胞中胰岛素基因不表达，从皮肤细胞中无法获得胰岛素基因转录的mRNA。(2)过程②是逆(反)转录，需要逆转录酶。过程③是解旋，在体外需要的条件是加热。过程④是以DNA一条链为模板合成子代DNA，在体外必需的酶是Taq酶。(3)A、B分别是目的基因和质粒，C是重组质粒，此过程中，必须用同种限制酶切割A和B，使它们产生相同的黏性(或平)末端，再加入DNA连接酶，才可形成重组质粒。(4)重组质粒除必须含有目的基因、标记基因、复制原点外，还必须有启动子和终止子。(5)为了使受体细胞更容易吸收重组质粒，可用Ca2＋处理，使其处于感受态。
考向二 蛋白质工程
蛋白质工程与基因工程的比较
(1)区别
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
8．胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，并且要经过较长时间才能进入血液中，而进入血液的胰岛素又容易被分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：
(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是________________________________。
(2)人工合成的DNA与________结合后，被导入到______________________中才能得以表达。
(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有________、________和发酵工程。
(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)蛋白质的预期功能 (2)载体 大肠杆菌等受体细胞 (3)蛋白质工程 基因工程 (4)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成出新的胰岛素基因
解析 (1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素，即速效胰岛素的功能。(2)人工合成的目的基因与载体结合后，被导入受体细胞中才能得以表达。(3)利用蛋白质工程生产自然界中原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因即目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程将其导入受体细胞获得工程菌，再利用工程菌进行发酵，从而获取大量产品，因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)由新的蛋白质模型到构建新的基因，其基本设计思路是根据新的蛋白质中的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪直接合成新的基因。
9．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的______________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰__________基因或合成____________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________________和____________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物__________进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
解析 (1)蛋白质的功能与结构相关，若要改变蛋白质的功能，需要对其氨基酸序列或结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后，可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
1．实验原理
2．操作流程
—
↓
—
↓
—
↓
—
↓
—
1．DNA和蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度比较
项目
2 mol/L NaCl溶液
0.14 mol/L NaCl溶液
溶解规律
DNA
溶解
析出
蛋白质
部分发生盐析沉淀
溶解
NaCl溶液浓度从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大
2.DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤4次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
问题探究
下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
提示 不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol·L－1，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
(2)操作②中加入体积分数为95%的冷酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
提示 ②中加入体积分数为95%的冷酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时搅拌要沿一个方向，轻缓地进行。
(3)操作③中的黏稠物是如何获取的？加入2 mol/L NaCl的目的是什么？
提示 黏稠物是经过单层纱布过滤获得的； 加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
考向 DNA的粗提取与鉴定实验应用
10．下列关于DNA粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是( )
选项
试剂
操作
作用
A
柠檬酸钠溶液
与鸡血混合
防止血液凝固
B
蒸馏水
与鸡血细胞液混合
保持细胞形状
C
蒸馏水
加入到溶解有DNA的NaCl溶液中
析出蛋白质
D
冷却的酒精
加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中
产生特定的颜色反应
答案 A
解析 蒸馏水与鸡血细胞液混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B项错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C项错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D项错误。
11．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺试剂，混匀
加4 mL二苯胺试剂，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象
实验结论
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是__________________________________________________，同时说明DNA对高温有较强的____________。
(4)A试管在实验中的作用是____________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。
答案 (1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色 (2)溶液颜色基本不变 (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
解析 B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别某种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．目的基因的获取有从基因文库中获取和人工合成两类方法。
5．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
6．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
1．(2019·海南，31)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题：
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取____________作为模板，在______________催化下合成cDNA，再利用__________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经____________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)mRNA 逆转录酶 PCR
(2)TDNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上
(3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
解析 (1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
2．(2019·全国Ⅰ，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________________和______________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是____________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_____________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)基因组文库 cDNA文库
(2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析 (1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)PCR反应体系加入的聚合酶需耐高温，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
3．(2018·全国Ⅱ，38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证______________________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的___________移入牛的________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
答案 (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞 (4)核DNA
解析 (1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。
(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。
(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。
(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
4．(2017·全国Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_____________作为载体，其原因是______________________________________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
(3)繁殖快、容易培养
(4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析 (1)大肠杆菌是原核生物，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，所以将完整的基因A导入大肠杆菌后，无法表达出蛋白A。
(2)噬菌体是细菌病毒，专门寄生在细菌体内，而家蚕是动物，因此用家蚕作为表达基因A的受体，不选用噬菌体作为载体。
(3)原核生物常作为基因工程中的受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核生物是大肠杆菌。
(4)检测目的基因A是否翻译出蛋白A，方法是从转基因生物中提取蛋白A，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。
(5)艾弗里实验表明加热杀死的S型细菌的DNA可转入R型细菌中，这充分显示“DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体”，因此，为基因工程理论的建立提供了启示。
5．(2017·全国Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________________________________________________。
提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_______________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是___________________________________________。
答案 (1)嫩叶中基因表达强烈，相应的mRNA多(或嫩叶组织细胞易破碎) 防止提取的mRNA被RNA酶降解 (2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则合成cDNA (3)质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因便于筛选；质粒中含有复制原点等 (4)磷酸二酯键 (5)几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译
解析 (1)由于嫩叶中几丁质酶转录的mRNA较多，因此在进行基因工程操作时，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止提取的mRNA被RNA酶降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，原理是mRNA可根据碱基互补配对原则逆转录为cDNA。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因便于筛选；质粒中含有复制原点等。
(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)基因表达包括转录和翻译两个步骤，若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，其可能的原因是几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译。
一、选择题
1．下列有关基因工程中目的基因的叙述，正确是( )
A．用同种限制酶切割载体与含目的基因的DNA片段可获得相同黏性(或平)末端
B．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达
C．目的基因与载体结合的过程发生在细胞内
D．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变
答案 A
解析 用同种限制酶切割载体与含目的基因的DNA片段可获得相同黏性(或平)末端，A正确；目的基因进入受体细胞后不一定能成功实现表达，因此还需要进行检测和鉴定，B错误；目的基因与载体结合的过程发生在细胞外，C错误；目的基因导入受体细胞后，与受体细胞核DNA重组，即发生基因重组，D错误。
2．某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是( )
A．用限制酶HindⅢ和Pst Ⅰ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
答案 C
解析 质粒中含有限制酶HindⅢ和PstⅠ的切割位点，且各含一个，因此用这两种限制酶切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；由题图可知，限制酶AluⅠ的切割位点位于目的基因上，因此不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA，否则会破坏目的基因，B正确；用SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒会导致两个抗性基因均被破坏，因此构建重组DNA时，不能选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，C错误；构建基因表达载体时，应该选择HindⅢ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，这样会破坏质粒上的氯霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。
3．某科研小组将某细胞中的一种转运蛋白X的第158位的丝氨酸变成亮氨酸，第240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质不仅保留了转运功能，还具有催化活性。下列说法正确的是( )
A．应直接对转运蛋白X的氨基酸序列进行改造
B．该过程能定向地改造蛋白质的结构
C．经改造后的蛋白质不需要再进行功能鉴定
D．经改造后的基因在表达过程中不遵循中心法则
答案 B
解析 应直接对控制转运蛋白X合成的基因进行改造，A错误；该过程能按照人们的意愿定向地改造蛋白质的结构，B正确；经改造后的蛋白质仍需要再进行功能鉴定，C错误；经改造后的基因在表达过程中遵循中心法则，D错误。
4．如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制备“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法错误的是( )
A．制备“工程菌”时，将质粒A或重组质粒导入细菌B常用的方法是Ca2＋处理法
B．细菌B接种在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌
C．细菌B涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能够产生人的生长激素
答案 C
解析 将质粒A或重组质粒导入细菌B，常用Ca2＋处理细胞，使之变成感受态细胞，能够主动地从外源吸收DNA，A正确；根据题意，细菌B不含有质粒A及其上的基因，即没有抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因，质粒含抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，基因发生重组时抗四环素基因被破坏，保留抗氨苄青霉素基因，如果接种在含四环素的培养基上，能生长的只是导入了普通质粒的细菌，B正确；根据题意，细菌B不含有质粒A及其上的基因，质粒含抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，基因发生重组时抗四环素基因被破坏，保留抗氨苄青霉素基因，故在含氨苄青霉素的培养基上能生长的包括导入了重组质粒的细菌和导入了普通质粒的细菌，C错误；目的基因成功表达的标志是受体细胞能产生出人的生长激素，D正确。
二、非选择题
5．(2019·湖北华中师大第一附中期中)油菜籽中蛋白质和油脂的相对含量，与酶1和酶2对共同底物丙酮酸的竞争有关。酶1促进蛋白质的合成，酶2促进油脂的合成。通过生物工程技术对油菜进行改造，以得到含有基因A的油菜，流程图如下。请据图作答：
(1)上述过程中运用的生物工程技术有______________________________。
(2)通过从基因文库中获取、________________或人工化学合成等方法，都可获取目的基因A。
(3)过程④中要防止杂菌污染的原因是____________________。通过过程④得到的油菜植株中，所有细胞_________________(填“一定”“不一定”或“一定不”)含有基因A，原因是______________________________________________________。
(4)已知转录时基因A的模板链与酶1基因的模板链互补。相对普通油菜，含基因A的油菜籽粒油脂含量显著提高，其机理可能是基因A转录的mRNA与酶1基因转录的mRNA互补，阻碍了酶1基因的_____过程，降低了酶1含量，酶2对丙酮酸的竞争增强，促进了油脂合成。
答案 (1)转基因技术和植物组织培养技术 (2)利用PCR技术扩增 (3)杂菌会竞争培养基中的营养物质，还可能产生有毒有害物质 不一定 农杆菌不一定感染外植体的每个细胞，所以每个细胞的染色体不一定都整合了目的基因 (4)翻译
解析 (1)图中①和②是转基因的过程，③和④是植物组织培养成完整植株的过程。(2)获得目的基因的方法包括从基因文库中获取、PCR技术扩增、人工化学合成等方法。(3)培养基中的杂菌一方面会和培养物争夺营养，另一方面可能会产生一些有毒有害物质影响培养物的培养，因此整个过程要严格灭菌。农杆菌感染外植体的植物细胞时，有可能有的细胞没有被感染，因此不是每个细胞的染色体上都整合了目的基因。(4)基因表达包括转录和翻译两个阶段，翻译过程是以mRNA为模板合成蛋白质的过程。基因A转录的mRNA和酶1基因转录的mRNA互补，因此使酶1基因转录的mRNA无法进行翻译，使酶1不能合成，抑制了丙酮酸合成蛋白质的过程，促进了丙酮酸合成油脂的过程，使油菜中油脂含量升高。
6．(2020·福建三明一中高三开学考)如图表示从苏云金芽孢杆菌分离出来的杀虫晶体蛋白质基因及形成转基因抗虫棉的图解。请据图回答下面的问题：
(1)图中a过程要用到的酶是____________________________________。
(2)在进行图中b过程时，由我国科学家独创的十分简便经济的方法是____________________，此外，也经常采用_________法。若要培育转基因绵羊，则此过程要用______________的方法。
(3)为确定抗虫棉是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_____________________作探针进行分子杂交测试，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是________________________。
(4)活化的毒性物质应是一种____________分子，可以全部或部分嵌合于昆虫的细胞膜上，使细胞膜产生孔道，导致细胞由于渗透平衡的破坏而破裂。
答案 (1)限制性核酸内切酶 (2)花粉管通道法 农杆菌转化 显微注射 (3)杀虫晶体蛋白质基因(或目的基因) 让害虫吞食抗虫棉叶子，观察害虫的存活状态(或其他合理答案)
(4)多肽
解析 (1)图中a过程是提取目的基因，用到的酶是限制酶(限制性核酸内切酶)。(2)b过程是将目的基因导入受体细胞。花粉管通道法是我国科学家所创，此外农杆菌转化法、基因枪法也可将目的基因导入植物细胞，最常用的是农杆菌转化法。若以动物受精卵为受体细胞，则常用显微注射技术。(3)检测目的基因是否成功表达，可在分子水平检测，用杀虫晶体蛋白质基因(或目的基因)作探针，进行分子杂交。在个体水平上进行鉴定时，可以让害虫吞食抗虫棉叶子，观察害虫的存活状态。(4)活化的毒性物质是晶体蛋白在蛋白酶的作用下得到的，应该是多肽。
7．科学家成功制备出“嫁接”了人胰岛素基因的工程菌，它能大量合成人胰岛素，用来治疗糖尿病，使胰岛素的生产成本大大降低。回答相关问题：
(1)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有__________________、热稳定DNA聚合酶、引物和4种脱氧核糖核苷酸。已知DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，利用PCR技术以题图的DNA片段为模板扩增目的基因，需使用引物__________(从A、B、C、D四种单链片段中选择)。
(2)利用某人的胰岛B细胞为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是______________________________。
(3)人的基因中有内含子，转录后内含子对应的RNA序列会被切除，而大肠杆菌没有相应机制。故想让大肠杆菌表达出人胰岛素，应从____________________(填“cDNA文库”或“基因组文库”)中获得人胰岛素基因。
(4)分别从DNA重组和基因的表达角度分析基因工程能够成功的两个原因_______________、______________。
答案 (1)模板DNA B、C (2)cDNA文库中只含有胰岛B细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有这个人的全部基因 (3)cDNA文库 (4)不同生物的DNA分子的双螺旋结构相同 生物界共用一套遗传密码
解析 (1)PCR是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，它利用了DNA双链复制的原理。利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有模板DNA、热稳定DNA聚合酶、引物和4种脱氧核糖核苷酸。DNA复制时，子链总是从5′端向3′端方向延伸，而子链与模板链反向平行，所以利用PCR技术扩增目的基因时，可以从题图的A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C片段作为引物。(2)以某人的胰岛B细胞为材料，利用从该胰岛B细胞中提取的mRNA反转录产生的多种互补的cDNA片段构建的cDNA文库中，只含有胰岛B细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中则含有这个人的全部基因，所以cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少。(3)“cDNA文库”中的基因不含内含子，而“基因组文库”中的基因含内含子，因此若要让大肠杆菌表达出人胰岛素，应从cDNA文库中获得人胰岛素基因。(4)基因工程实现了不同物种间的基因重组，其原因是不同生物的DNA分子的双螺旋结构相同；导入的目的基因能够在转基因生物的细胞中表达，其原因是生物界共用一套遗传密码。
8．(2019·广东惠州第二次调研)回答下列与基因工程研究历程有关的问题：
(1)20世纪中叶，一系列基础理论研究取得了重大突破，如艾弗里等人通过肺炎双球菌的转化实验不仅证明了__________________，还证明了___________________。
(2)接下来，技术发明使基因工程的实施成为可能。
①如________________________的发现为DNA的切割、连接创造了条件；_________________为目的基因的体外大量扩增提供了可能。
②细菌中的质粒分松散型质粒和严谨型质粒。当宿主菌蛋白质合成停止时，严谨型质粒DNA复制随之停止，松散型质粒DNA复制仍可进行。通常选用松散型质粒作为基因工程载体，原因是__________________________。
(3)从哪种基因文库中获取的基因含有启动子？______________(填“基因组文库”“cDNA文库”或“基因组文库和cDNA文库”)。
(4)植物基因工程主要用于提高农作物的抗逆能力，如抗虫、抗病、抗干旱等，请写出一种常用的抗虫基因名称：____________________。
(5)培育转基因抗逆新品种时最好要将目的基因插入植物细胞染色体的DNA上，理由是___________________________________________________________。
答案 (1)生物的遗传物质是DNA DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
(2)①限制酶、DNA连接酶 PCR技术 ②目的基因容易复制(或目的基因的复制不容易受干扰) (3)基因组文库 (4)Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因，植物凝集素基因(答案合理即可) (5)使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达
解析 (1)艾弗里等人通过肺炎双球菌的转化实验证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，并表达特定的性状。(2)①DNA的切割、连接需要限制酶和DNA连接酶的催化，PCR技术为目的基因的体外大量扩增提供了可能。
②当宿主菌蛋白质合成停止时，严谨型质粒DNA复制随之停止，松散型质粒DNA复制仍可进行，因此选用松散型质粒作为基因工程载体，有利于目的基因在受体菌内的复制。(3)cDNA文库是通过提取细胞内的mRNA，经过反转录过程获得，mRNA不含有启动子对应的碱基序列，因此从cDNA文库中获得的基因不含有启动子，基因组文库具有该生物的全部基因，具有启动子。(4)用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。(5)培育转基因抗逆新品种时最好要将目的基因插入植物细胞染色体的DNA上，这样目的基因可以随着染色体DNA复制而复制，可以使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
9．鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌转化法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是______________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________________和____________________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti质粒内，每种限制酶有__________个切割位点，酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列__________(填“相同”或“不相同”)。
(2)步骤②所构建的基因表达载体中未标出的必需元件还有____________，步骤③中需先用____________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过__________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，可能的原因是______________________________。
答案 (1)鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 1 不相同 (2)复制原点 Ca2＋ (3)反(逆)转录 鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录或鸡干扰素的mRNA已经被水解
10．乙肝病毒是一种DNA病毒。中国的乙肝病毒携带者约占总人口的10%。我国科学家通过基因工程生产出乙型肝炎病毒疫苗，为预防乙肝提供了有力的保障。回答下列问题：
(1)乙肝病毒专一侵染肝细胞的原因是____________________________________________。
(2)乙肝病毒的基因组可编码的蛋白质及功能如下：Core蛋白是外壳蛋白；Pre－core与抑制宿主的免疫反应有关；X蛋白与病毒复制有关；S蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入细胞有关。通过基因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的____________________。
(3)通过基因工程生产乙肝疫苗的过程如图所示：
乙肝病毒有关基因细菌大量生产疫苗
a．若要获得大量的目的基因，可采用PCR技术进行体外扩增，该技术中使用的引物有________种，其作用是________________________。
b．在①②过程中需使用的工具酶是________________。②过程中常用的载体是________。
c．为提高②过程的转化效率，常采用的方法是_________________________________________
__________________。
(4)使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好，从细胞结构的角度分析，原因是________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)肝细胞表面有乙肝病毒的受体 (2)Core蛋白和S蛋白 (3)a.2 使热稳定的DNA聚合酶能够从引物的结合端开始连接脱氧核苷酸 b．限制酶和DNA连接酶 质粒 c．用Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌 (4)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰等处理
解析 (1)由于肝细胞表面有乙肝病毒的受体，所以乙肝病毒专一侵染肝细胞。
(2)根据题意分析，乙肝病毒作为抗原的部分应该是其外壳蛋白和包膜蛋白，即通过基因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的Core蛋白和S蛋白。
(3)a.PCR技术中，需要2种不同的引物，使热稳定DNA聚合酶能够从引物的结合端开始连接脱氧核苷酸。
b．在构建基因表达载体的过程中，需要使用的工具酶是限制酶和DNA连接酶，常用的载体是质粒。
c．为了提高将重组质粒导入细菌的转化效率，常用Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌，使之成为感受态细胞。
(4)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰等处理，因此使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好。
11．下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。
(1)图中实验材料A可以是__________等，研磨前加入的B应该是______________________。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后， 再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是____________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是_____________。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。
1
研磨液中
搅拌研磨后过滤
滤液E
2
2 mol/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液F
3
0.14 mol/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液G
4
冷却的体积分数为95%的酒精溶液中
搅拌后过滤
滤液H
(4)DNA鉴定的原理是_______________________________________________。
答案 (1)洋葱(或菜花) 洗涤剂和食盐 (2)使DNA溶解 使DNA析出 (3)H (4)在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
解析 (1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨。(2)DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质得到滤液D。向滤液D中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA的溶解度下降而沉淀析出，以便除去溶解在低盐溶液中的杂质。(3)DNA不溶于冷却的体积分数为95%的酒精，因此在4种滤液中滤液H含DNA最少。(4)DNA鉴定的原理是在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
第33讲 基因工程
[考纲要求] 1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。5.实验：DNA的粗提取与鉴定。
1．基因工程的概念
(1)供体：提供目的基因。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内的表达。
(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
③形成末端类型
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
②类型
常用类型
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
③DNA连接酶和限制酶的关系
(3)载体
①条件
条件
适应性
稳定并能自我复制或整合到染色体DNA上
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
②种类
③作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
④特点：可在细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
教材拾遗 限制酶来源于原核生物而不切割自己的DNA的原因是限制酶具有特异性，原核生物的DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰(P4寻根问底拓展)。
1．判断关于基因工程中工具酶说法的正误
(1)限制酶只能用于切割目的基因( × )
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( × )
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来( × )
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
(5)限制酶可以识别和切割RNA( × )
2．判断关于基因工程中载体说法的正误
(1)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因( × )
(2)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶切割位点( √ )
(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体( √ )
(4)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( √ )
易错警示 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
(3)不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。
(4)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。
(5)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间。
考向一 工具酶的应用分析
下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图，据图分析：
(1)请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
提示 EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。
(2)以上实例说明限制酶有何特性？
提示 说明限制酶具有专一性。
(3)要将图1中的末端再连接起来，需要用哪类连接酶，若连接图2的末端呢？
提示 连接图1中的黏性末端既可用E·coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶，连接图2中的平末端只能用T4 DNA连接酶。
(4)已知某限制性核酸内切酶的识别序列和切割位点是—C↓AATTG—，该酶作用DNA后所得末端与图1所得末端用E·coli DNA连接酶能否连接起来？若能连接起来，能否再次被EcoRⅠ限制酶识别并切割呢？
提示 能；不能。
1．如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是( )
A．甲、乙、丙都属于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA连接酶的作用位点在乙图中b处
D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
答案 C
解析 由题图可知，甲、乙、丙都属于黏性末端，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，C错误；切割甲的限制酶的识别序列和甲、乙片段形成的重组DNA分子序列不同，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
2．下列是基因工程的有关问题，请回答：
(1)限制性核酸内切酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是____________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是______________，和限制性核酸内切酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列____________(填“有”或“无”)专一性要求。
(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—。分析可知，最好选择限制酶________切割质粒，限制酶______切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是__________________________________________、___________________________________。
答案 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)DNA连接酶 无 (3)Ⅰ Ⅱ 限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏 目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列
解析 (1)限制性核酸内切酶(限制酶)能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，分别为黏性末端和平末端。
(2)目的基因和载体重组时需要DNA连接酶恢复所连接的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。多种限制酶切割，形成不同的切割位点，所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列没有专一性要求。
(3)由题干及图示可知，限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏，最好选择限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列，因此用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的DNA。
考向二 载体的应用分析
3．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案 D
解析 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于细菌拟核DNA外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
4．如图所示为pBR322质粒，其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环素抗性基因)为标记基因，ori为复制原点，其他均为限制酶及其识别位点，并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的载体。回答下列相关问题：
(1)制备重组质粒，需要限制酶和____________酶。如制备重组质粒时，使用PvuⅠ切割该质粒，则检测目的基因是否导入受体细胞，需要在培养基中添加________。
(2)该质粒中的BamHⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为—G↓GATCC—，而Sau3AⅠ识别的核苷酸序列只有4个碱基。若BamHⅠ和Sau3AⅠ分别切割DNA所形成的DNA片段能拼接成一条DNA链，则Sau3AⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为______________。该拼接在一起的DNA片段，能否被BamH Ⅰ识别？____________。
(3)与图示质粒相比，完整的重组质粒中还应有__________________等三种特殊的DNA片段。
答案 (1)DNA连接 四环素 (2)—↓GATC— 不一定能 (3)启动子、终止子和目的基因
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。
②方法
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成
小贴士 启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
③构建过程
(3)将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
2．基因工程的应用
(1)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。
(2)动物基因工程：提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(3)基因工程药物
①方法：利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。
②成果：利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
(4)比较基因治疗与基因诊断
项目
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
3.蛋白质工程
(1)概念
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②手段：基因修饰或基因合成。
③目的：合成满足人类生产和生活需求的蛋白质。
(2)流程图
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
(4)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。
1．判断关于基因工程原理与操作说法的正误
(1)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( √ )
(2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体( × )
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达( √ )
(4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术( √ )
(5)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达
( × )
2．判断关于基因工程的应用及蛋白质工程说法的正误
(1)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( × )
(2)动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质，不一定是为了产生体型巨大的个体
( √ )
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用( × )
(4)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构( × )
(5)基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质( √ )
考向一 基因工程操作程序及应用
据图分析抗虫棉的培育过程
(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？切取目的基因与切割载体时只能使用同一种限制酶吗？
提示 目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性(或平) 末端。但如果用两种不同的限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。②为了避免目的基因和载体的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体各具有两个不同的末端。
(2)目的基因的插入位点是随意的吗？
提示 不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能。
(3)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
提示 采用的方法是农杆菌转化法；由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T-DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
(4)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？
提示 抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
5．(2019·黑龙江哈尔滨六中第二次月考)绿色荧光是由绿色荧光蛋白发出的，为了培育能发出绿色荧光的小鼠，人们设计了如下的流程：
(1)获取绿色荧光蛋白基因的常用方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和_______等。
(2)绿色荧光蛋白基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物一部分基因的文库称为____________。
(3)A过程是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和______________，它们作用的化学键是__________。
(4)B过程常用的是________________技术。
(5)通常采用______________________技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。
答案 (1)人工合成 (2)cDNA文库(或部分基因文库) (3)DNA连接酶 磷酸二酯键
(4)显微注射 (5)DNA分子杂交
解析 图中A表示基因表达载体的构建过程，B表示将目的基因导入受体细胞，C表示早期胚胎培养，D表示胚胎移植，E表示妊娠。(1)获取目的基因——绿色荧光蛋白基因的方法有从基因文库中获取和人工合成等。(2)基因文库分为基因组文库和部分基因文库，其中含有一种生物所有基因的文库称为基因组文库，含有一种生物的部分基因的文库称为部分基因文库，如cDNA文库。(3)A过程表示基因表达载体的构建，是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，它们作用的化学键是磷酸二酯键。(4)将目的基因导入动物细胞采用的最多也最有效的方法是显微注射技术。(5)检测外源基因是否插入了小鼠的基因组，通常采用DNA分子杂交技术，即用外源基因制作成的DNA探针与受体细胞的基因组进行杂交，观察是否出现杂交带。
6．烟草易受烟草花叶病毒(TMV)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染，研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草，操作流程如下图所示。请回答下列问题：
(1)过程①所用RNA可以从________________________中获取。
(2)过程②可以采用___________技术获得大量目的基因，该技术的实质是________________。
(3)过程④最常用的方法是__________，该方法中需将目的基因插入受体细胞的_________上。
(4)过程⑤所用到的培养基除了卡那霉素之外，还需要加入的特殊物质是____________。过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定，在分子水平上检验获得的烟草能否抗TMV感染的方法是__________________________。
答案 (1)绞股蓝细胞的细胞质基质
(2)PCR(或多聚酶链式反应) 双链DNA复制
(3)农杆菌转化法 染色体DNA
(4)植物激素(或生长素和细胞分裂素) 抗原—抗体杂交
7．(2019·福建三明一中高三开学考)如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答：
(1)能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？__________为什么？____________________。
(2)过程②必需的酶是________酶，过程③在体外需要的条件是__________，过程④在体外必需的酶是______酶。
(3)在利用A、B获得C的过程中，必须用______________切割A和B，使它们产生___________，再加入____________________，才可形成C。
(4)C的组成除必须含有________________、________________、复制原点外，还必须有________和__________。
(5)图中的D是基因工程中的受体细胞，为了使过程⑧更易进行，可用__________处理D。
答案 (1)不能 由于基因选择性表达，人的皮肤细胞中胰岛素基因不能表达，得不到胰岛素mRNA (2)逆转录 加热 热稳定DNA聚合(Taq) (3)同一种限制酶 相同的黏性末端 DNA连接酶 (4)目的基因 标记基因 启动子 终止子 (5)Ca2＋
解析 (1)由于基因选择性表达，人的皮肤细胞中胰岛素基因不表达，从皮肤细胞中无法获得胰岛素基因转录的mRNA。(2)过程②是逆(反)转录，需要逆转录酶。过程③是解旋，在体外需要的条件是加热。过程④是以DNA一条链为模板合成子代DNA，在体外必需的酶是Taq酶。(3)A、B分别是目的基因和质粒，C是重组质粒，此过程中，必须用同种限制酶切割A和B，使它们产生相同的黏性(或平)末端，再加入DNA连接酶，才可形成重组质粒。(4)重组质粒除必须含有目的基因、标记基因、复制原点外，还必须有启动子和终止子。(5)为了使受体细胞更容易吸收重组质粒，可用Ca2＋处理，使其处于感受态。
考向二 蛋白质工程
蛋白质工程与基因工程的比较
(1)区别
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
8．胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，并且要经过较长时间才能进入血液中，而进入血液的胰岛素又容易被分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：
(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是________________________________。
(2)人工合成的DNA与________结合后，被导入到______________________中才能得以表达。
(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有________、________和发酵工程。
(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)蛋白质的预期功能 (2)载体 大肠杆菌等受体细胞 (3)蛋白质工程 基因工程 (4)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成出新的胰岛素基因
解析 (1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素，即速效胰岛素的功能。(2)人工合成的目的基因与载体结合后，被导入受体细胞中才能得以表达。(3)利用蛋白质工程生产自然界中原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因即目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程将其导入受体细胞获得工程菌，再利用工程菌进行发酵，从而获取大量产品，因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)由新的蛋白质模型到构建新的基因，其基本设计思路是根据新的蛋白质中的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪直接合成新的基因。
9．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的______________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰__________基因或合成____________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________________和____________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物__________进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
解析 (1)蛋白质的功能与结构相关，若要改变蛋白质的功能，需要对其氨基酸序列或结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后，可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
1．实验原理
2．操作流程
—
↓
—
↓
—
↓
—
↓
—
1．DNA和蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度比较
项目
2 mol/L NaCl溶液
0.14 mol/L NaCl溶液
溶解规律
DNA
溶解
析出
蛋白质
部分发生盐析沉淀
溶解
NaCl溶液浓度从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大
2.DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤4次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
问题探究
下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
提示 不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol·L－1，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
(2)操作②中加入体积分数为95%的冷酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
提示 ②中加入体积分数为95%的冷酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时搅拌要沿一个方向，轻缓地进行。
(3)操作③中的黏稠物是如何获取的？加入2 mol/L NaCl的目的是什么？
提示 黏稠物是经过单层纱布过滤获得的； 加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
考向 DNA的粗提取与鉴定实验应用
10．下列关于DNA粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是( )
选项
试剂
操作
作用
A
柠檬酸钠溶液
与鸡血混合
防止血液凝固
B
蒸馏水
与鸡血细胞液混合
保持细胞形状
C
蒸馏水
加入到溶解有DNA的NaCl溶液中
析出蛋白质
D
冷却的酒精
加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中
产生特定的颜色反应
答案 A
解析 蒸馏水与鸡血细胞液混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B项错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C项错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D项错误。
11．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺试剂，混匀
加4 mL二苯胺试剂，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象
实验结论
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是__________________________________________________，同时说明DNA对高温有较强的____________。
(4)A试管在实验中的作用是____________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。
答案 (1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色 (2)溶液颜色基本不变 (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
解析 B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别某种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．目的基因的获取有从基因文库中获取和人工合成两类方法。
5．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
6．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
1．(2019·海南，31)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题：
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取____________作为模板，在______________催化下合成cDNA，再利用__________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经____________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)mRNA 逆转录酶 PCR
(2)TDNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上
(3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
解析 (1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
2．(2019·全国Ⅰ，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________________和______________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是____________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_____________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)基因组文库 cDNA文库
(2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析 (1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)PCR反应体系加入的聚合酶需耐高温，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
3．(2018·全国Ⅱ，38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证______________________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的___________移入牛的________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
答案 (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞 (4)核DNA
解析 (1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。
(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。
(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。
(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
4．(2017·全国Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_____________作为载体，其原因是______________________________________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
(3)繁殖快、容易培养
(4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析 (1)大肠杆菌是原核生物，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，所以将完整的基因A导入大肠杆菌后，无法表达出蛋白A。
(2)噬菌体是细菌病毒，专门寄生在细菌体内，而家蚕是动物，因此用家蚕作为表达基因A的受体，不选用噬菌体作为载体。
(3)原核生物常作为基因工程中的受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核生物是大肠杆菌。
(4)检测目的基因A是否翻译出蛋白A，方法是从转基因生物中提取蛋白A，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。
(5)艾弗里实验表明加热杀死的S型细菌的DNA可转入R型细菌中，这充分显示“DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体”，因此，为基因工程理论的建立提供了启示。
5．(2017·全国Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________________________________________________。
提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_______________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是___________________________________________。
答案 (1)嫩叶中基因表达强烈，相应的mRNA多(或嫩叶组织细胞易破碎) 防止提取的mRNA被RNA酶降解 (2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则合成cDNA (3)质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因便于筛选；质粒中含有复制原点等 (4)磷酸二酯键 (5)几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译
解析 (1)由于嫩叶中几丁质酶转录的mRNA较多，因此在进行基因工程操作时，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止提取的mRNA被RNA酶降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，原理是mRNA可根据碱基互补配对原则逆转录为cDNA。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因便于筛选；质粒中含有复制原点等。
(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)基因表达包括转录和翻译两个步骤，若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，其可能的原因是几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译。
一、选择题
1．下列有关基因工程中目的基因的叙述，正确是( )
A．用同种限制酶切割载体与含目的基因的DNA片段可获得相同黏性(或平)末端
B．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达
C．目的基因与载体结合的过程发生在细胞内
D．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变
答案 A
解析 用同种限制酶切割载体与含目的基因的DNA片段可获得相同黏性(或平)末端，A正确；目的基因进入受体细胞后不一定能成功实现表达，因此还需要进行检测和鉴定，B错误；目的基因与载体结合的过程发生在细胞外，C错误；目的基因导入受体细胞后，与受体细胞核DNA重组，即发生基因重组，D错误。
2．某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是( )
A．用限制酶HindⅢ和Pst Ⅰ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
答案 C
解析 质粒中含有限制酶HindⅢ和PstⅠ的切割位点，且各含一个，因此用这两种限制酶切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；由题图可知，限制酶AluⅠ的切割位点位于目的基因上，因此不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA，否则会破坏目的基因，B正确；用SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒会导致两个抗性基因均被破坏，因此构建重组DNA时，不能选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，C错误；构建基因表达载体时，应该选择HindⅢ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，这样会破坏质粒上的氯霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。
3．某科研小组将某细胞中的一种转运蛋白X的第158位的丝氨酸变成亮氨酸，第240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质不仅保留了转运功能，还具有催化活性。下列说法正确的是( )
A．应直接对转运蛋白X的氨基酸序列进行改造
B．该过程能定向地改造蛋白质的结构
C．经改造后的蛋白质不需要再进行功能鉴定
D．经改造后的基因在表达过程中不遵循中心法则
答案 B
解析 应直接对控制转运蛋白X合成的基因进行改造，A错误；该过程能按照人们的意愿定向地改造蛋白质的结构，B正确；经改造后的蛋白质仍需要再进行功能鉴定，C错误；经改造后的基因在表达过程中遵循中心法则，D错误。
4．如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制备“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法错误的是( )
A．制备“工程菌”时，将质粒A或重组质粒导入细菌B常用的方法是Ca2＋处理法
B．细菌B接种在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌
C．细菌B涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能够产生人的生长激素
答案 C
解析 将质粒A或重组质粒导入细菌B，常用Ca2＋处理细胞，使之变成感受态细胞，能够主动地从外源吸收DNA，A正确；根据题意，细菌B不含有质粒A及其上的基因，即没有抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因，质粒含抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，基因发生重组时抗四环素基因被破坏，保留抗氨苄青霉素基因，如果接种在含四环素的培养基上，能生长的只是导入了普通质粒的细菌，B正确；根据题意，细菌B不含有质粒A及其上的基因，质粒含抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，基因发生重组时抗四环素基因被破坏，保留抗氨苄青霉素基因，故在含氨苄青霉素的培养基上能生长的包括导入了重组质粒的细菌和导入了普通质粒的细菌，C错误；目的基因成功表达的标志是受体细胞能产生出人的生长激素，D正确。
二、非选择题
5．(2019·湖北华中师大第一附中期中)油菜籽中蛋白质和油脂的相对含量，与酶1和酶2对共同底物丙酮酸的竞争有关。酶1促进蛋白质的合成，酶2促进油脂的合成。通过生物工程技术对油菜进行改造，以得到含有基因A的油菜，流程图如下。请据图作答：
(1)上述过程中运用的生物工程技术有______________________________。
(2)通过从基因文库中获取、________________或人工化学合成等方法，都可获取目的基因A。
(3)过程④中要防止杂菌污染的原因是____________________。通过过程④得到的油菜植株中，所有细胞_________________(填“一定”“不一定”或“一定不”)含有基因A，原因是______________________________________________________。
(4)已知转录时基因A的模板链与酶1基因的模板链互补。相对普通油菜，含基因A的油菜籽粒油脂含量显著提高，其机理可能是基因A转录的mRNA与酶1基因转录的mRNA互补，阻碍了酶1基因的_____过程，降低了酶1含量，酶2对丙酮酸的竞争增强，促进了油脂合成。
答案 (1)转基因技术和植物组织培养技术 (2)利用PCR技术扩增 (3)杂菌会竞争培养基中的营养物质，还可能产生有毒有害物质 不一定 农杆菌不一定感染外植体的每个细胞，所以每个细胞的染色体不一定都整合了目的基因 (4)翻译
解析 (1)图中①和②是转基因的过程，③和④是植物组织培养成完整植株的过程。(2)获得目的基因的方法包括从基因文库中获取、PCR技术扩增、人工化学合成等方法。(3)培养基中的杂菌一方面会和培养物争夺营养，另一方面可能会产生一些有毒有害物质影响培养物的培养，因此整个过程要严格灭菌。农杆菌感染外植体的植物细胞时，有可能有的细胞没有被感染，因此不是每个细胞的染色体上都整合了目的基因。(4)基因表达包括转录和翻译两个阶段，翻译过程是以mRNA为模板合成蛋白质的过程。基因A转录的mRNA和酶1基因转录的mRNA互补，因此使酶1基因转录的mRNA无法进行翻译，使酶1不能合成，抑制了丙酮酸合成蛋白质的过程，促进了丙酮酸合成油脂的过程，使油菜中油脂含量升高。
6．(2020·福建三明一中高三开学考)如图表示从苏云金芽孢杆菌分离出来的杀虫晶体蛋白质基因及形成转基因抗虫棉的图解。请据图回答下面的问题：
(1)图中a过程要用到的酶是____________________________________。
(2)在进行图中b过程时，由我国科学家独创的十分简便经济的方法是____________________，此外，也经常采用_________法。若要培育转基因绵羊，则此过程要用______________的方法。
(3)为确定抗虫棉是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_____________________作探针进行分子杂交测试，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是________________________。
(4)活化的毒性物质应是一种____________分子，可以全部或部分嵌合于昆虫的细胞膜上，使细胞膜产生孔道，导致细胞由于渗透平衡的破坏而破裂。
答案 (1)限制性核酸内切酶 (2)花粉管通道法 农杆菌转化 显微注射 (3)杀虫晶体蛋白质基因(或目的基因) 让害虫吞食抗虫棉叶子，观察害虫的存活状态(或其他合理答案)
(4)多肽
解析 (1)图中a过程是提取目的基因，用到的酶是限制酶(限制性核酸内切酶)。(2)b过程是将目的基因导入受体细胞。花粉管通道法是我国科学家所创，此外农杆菌转化法、基因枪法也可将目的基因导入植物细胞，最常用的是农杆菌转化法。若以动物受精卵为受体细胞，则常用显微注射技术。(3)检测目的基因是否成功表达，可在分子水平检测，用杀虫晶体蛋白质基因(或目的基因)作探针，进行分子杂交。在个体水平上进行鉴定时，可以让害虫吞食抗虫棉叶子，观察害虫的存活状态。(4)活化的毒性物质是晶体蛋白在蛋白酶的作用下得到的，应该是多肽。
7．科学家成功制备出“嫁接”了人胰岛素基因的工程菌，它能大量合成人胰岛素，用来治疗糖尿病，使胰岛素的生产成本大大降低。回答相关问题：
(1)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有__________________、热稳定DNA聚合酶、引物和4种脱氧核糖核苷酸。已知DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，利用PCR技术以题图的DNA片段为模板扩增目的基因，需使用引物__________(从A、B、C、D四种单链片段中选择)。
(2)利用某人的胰岛B细胞为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是______________________________。
(3)人的基因中有内含子，转录后内含子对应的RNA序列会被切除，而大肠杆菌没有相应机制。故想让大肠杆菌表达出人胰岛素，应从____________________(填“cDNA文库”或“基因组文库”)中获得人胰岛素基因。
(4)分别从DNA重组和基因的表达角度分析基因工程能够成功的两个原因_______________、______________。
答案 (1)模板DNA B、C (2)cDNA文库中只含有胰岛B细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有这个人的全部基因 (3)cDNA文库 (4)不同生物的DNA分子的双螺旋结构相同 生物界共用一套遗传密码
解析 (1)PCR是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，它利用了DNA双链复制的原理。利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有模板DNA、热稳定DNA聚合酶、引物和4种脱氧核糖核苷酸。DNA复制时，子链总是从5′端向3′端方向延伸，而子链与模板链反向平行，所以利用PCR技术扩增目的基因时，可以从题图的A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C片段作为引物。(2)以某人的胰岛B细胞为材料，利用从该胰岛B细胞中提取的mRNA反转录产生的多种互补的cDNA片段构建的cDNA文库中，只含有胰岛B细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中则含有这个人的全部基因，所以cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少。(3)“cDNA文库”中的基因不含内含子，而“基因组文库”中的基因含内含子，因此若要让大肠杆菌表达出人胰岛素，应从cDNA文库中获得人胰岛素基因。(4)基因工程实现了不同物种间的基因重组，其原因是不同生物的DNA分子的双螺旋结构相同；导入的目的基因能够在转基因生物的细胞中表达，其原因是生物界共用一套遗传密码。
8．(2019·广东惠州第二次调研)回答下列与基因工程研究历程有关的问题：
(1)20世纪中叶，一系列基础理论研究取得了重大突破，如艾弗里等人通过肺炎双球菌的转化实验不仅证明了__________________，还证明了___________________。
(2)接下来，技术发明使基因工程的实施成为可能。
①如________________________的发现为DNA的切割、连接创造了条件；_________________为目的基因的体外大量扩增提供了可能。
②细菌中的质粒分松散型质粒和严谨型质粒。当宿主菌蛋白质合成停止时，严谨型质粒DNA复制随之停止，松散型质粒DNA复制仍可进行。通常选用松散型质粒作为基因工程载体，原因是__________________________。
(3)从哪种基因文库中获取的基因含有启动子？______________(填“基因组文库”“cDNA文库”或“基因组文库和cDNA文库”)。
(4)植物基因工程主要用于提高农作物的抗逆能力，如抗虫、抗病、抗干旱等，请写出一种常用的抗虫基因名称：____________________。
(5)培育转基因抗逆新品种时最好要将目的基因插入植物细胞染色体的DNA上，理由是___________________________________________________________。
答案 (1)生物的遗传物质是DNA DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
(2)①限制酶、DNA连接酶 PCR技术 ②目的基因容易复制(或目的基因的复制不容易受干扰) (3)基因组文库 (4)Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因，植物凝集素基因(答案合理即可) (5)使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达
解析 (1)艾弗里等人通过肺炎双球菌的转化实验证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，并表达特定的性状。(2)①DNA的切割、连接需要限制酶和DNA连接酶的催化，PCR技术为目的基因的体外大量扩增提供了可能。
②当宿主菌蛋白质合成停止时，严谨型质粒DNA复制随之停止，松散型质粒DNA复制仍可进行，因此选用松散型质粒作为基因工程载体，有利于目的基因在受体菌内的复制。(3)cDNA文库是通过提取细胞内的mRNA，经过反转录过程获得，mRNA不含有启动子对应的碱基序列，因此从cDNA文库中获得的基因不含有启动子，基因组文库具有该生物的全部基因，具有启动子。(4)用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。(5)培育转基因抗逆新品种时最好要将目的基因插入植物细胞染色体的DNA上，这样目的基因可以随着染色体DNA复制而复制，可以使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
9．鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌转化法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是______________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________________和____________________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti质粒内，每种限制酶有__________个切割位点，酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列__________(填“相同”或“不相同”)。
(2)步骤②所构建的基因表达载体中未标出的必需元件还有____________，步骤③中需先用____________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过__________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，可能的原因是______________________________。
答案 (1)鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 1 不相同 (2)复制原点 Ca2＋ (3)反(逆)转录 鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录或鸡干扰素的mRNA已经被水解
10．乙肝病毒是一种DNA病毒。中国的乙肝病毒携带者约占总人口的10%。我国科学家通过基因工程生产出乙型肝炎病毒疫苗，为预防乙肝提供了有力的保障。回答下列问题：
(1)乙肝病毒专一侵染肝细胞的原因是____________________________________________。
(2)乙肝病毒的基因组可编码的蛋白质及功能如下：Core蛋白是外壳蛋白；Pre－core与抑制宿主的免疫反应有关；X蛋白与病毒复制有关；S蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入细胞有关。通过基因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的____________________。
(3)通过基因工程生产乙肝疫苗的过程如图所示：
乙肝病毒有关基因细菌大量生产疫苗
a．若要获得大量的目的基因，可采用PCR技术进行体外扩增，该技术中使用的引物有________种，其作用是________________________。
b．在①②过程中需使用的工具酶是________________。②过程中常用的载体是________。
c．为提高②过程的转化效率，常采用的方法是_________________________________________
__________________。
(4)使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好，从细胞结构的角度分析，原因是________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)肝细胞表面有乙肝病毒的受体 (2)Core蛋白和S蛋白 (3)a.2 使热稳定的DNA聚合酶能够从引物的结合端开始连接脱氧核苷酸 b．限制酶和DNA连接酶 质粒 c．用Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌 (4)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰等处理
解析 (1)由于肝细胞表面有乙肝病毒的受体，所以乙肝病毒专一侵染肝细胞。
(2)根据题意分析，乙肝病毒作为抗原的部分应该是其外壳蛋白和包膜蛋白，即通过基因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的Core蛋白和S蛋白。
(3)a.PCR技术中，需要2种不同的引物，使热稳定DNA聚合酶能够从引物的结合端开始连接脱氧核苷酸。
b．在构建基因表达载体的过程中，需要使用的工具酶是限制酶和DNA连接酶，常用的载体是质粒。
c．为了提高将重组质粒导入细菌的转化效率，常用Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌，使之成为感受态细胞。
(4)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰等处理，因此使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好。
11．下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。
(1)图中实验材料A可以是__________等，研磨前加入的B应该是______________________。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后， 再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是____________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是_____________。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。
1
研磨液中
搅拌研磨后过滤
滤液E
2
2 mol/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液F
3
0.14 mol/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液G
4
冷却的体积分数为95%的酒精溶液中
搅拌后过滤
滤液H
(4)DNA鉴定的原理是_______________________________________________。
答案 (1)洋葱(或菜花) 洗涤剂和食盐 (2)使DNA溶解 使DNA析出 (3)H (4)在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
解析 (1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨。(2)DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质得到滤液D。向滤液D中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA的溶解度下降而沉淀析出，以便除去溶解在低盐溶液中的杂质。(3)DNA不溶于冷却的体积分数为95%的酒精，因此在4种滤液中滤液H含DNA最少。(4)DNA鉴定的原理是在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
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高考生物一轮复习讲练 第10单元 第36讲 生态工程 (含解析)： 这是一份高考生物一轮复习讲练 第10单元 第36讲 生态工程 (含解析)，共16页。
