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高考生物二轮复习难点精讲精练专题13 基因工程（含解析）
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这是一份高考生物二轮复习难点精讲精练专题13 基因工程（含解析），共34页。
2020届高考生物难点及易错题精讲精练
专题13 基因工程
【难点精讲】
一、限制酶的选择
例题：（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接，理由是_______________________________________________________________________________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ，不能表达的原因是
______________________________________________________________。
图（c）
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和 ，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_________。
【答案】 （1）Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 （2）甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 （3）E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
【解析】 三种限制酶切割结果分析
表达载体与重组DNA分子分析
【难点突破】
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst Ⅰ因其会破坏标记基因而不宜选择。
③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
④所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
（3）参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）
变式训练1：（2019·湖北武汉市调研）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用高速离心法提纯血液中的乙肝病毒，之后再将其灭活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染风险。如图所示为乙肝基因工程疫苗的生产和使用过程（注：质粒中lacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X－gal，从而使菌落呈蓝色，若无该基因，则菌落呈白色）。请回答下列问题：
（1）过程①最好选用的限制酶方案可以是 。
A．EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ B．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ
C．EcoR Ⅴ和EcoR Ⅰ D．只用BamH Ⅰ
（2）由图中过程③可知，该目的基因的具体功能是
______________________________________________________________。
（3）若要迅速获取大量的目的基因，以提高重组质粒产生的效率，常用的技术是
（写中文全称）。图中过程②常需要用 处理，使大肠杆菌细胞转化为感受态细胞。
（4）为了筛选、获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入 ，培养一段时间挑选出呈 （填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养获得大量目的菌。
（5）用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因
________________________________________________________________。
【答案】 （1）B （2）指导合成乙肝病毒外壳蛋白 （3）多聚酶链式反应 Ca2＋ （4）青霉素和X－gal 白色 （5）研制血源性疫苗需灭活破坏乙肝病毒的核酸结构，灭活不成功则会导致接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不会引发病毒增殖和感染
【解析】 （1）分析题意可知，切割目的基因和运载体应用相同的限制酶，所用限制酶要保证目的基因的完整性，并且把目的基因插入质粒中，故选用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ（用一种限制酶切割时，目的基因和运载体可能会发生自身环化或随意连接）。（2）从过程③可知，目的基因在大肠杆菌体内可表达出乙肝病毒外壳，故该目的基因的功能是指导乙肝病毒外壳蛋白的合成。（3）获取大量目的基因通常采用PCR技术扩增，即多聚酶链式反应。将目的基因导入大肠杆菌细胞的方法通常是用Ca2＋处理细胞，使其变成易于接受外源DNA的感受态细胞。（4）筛选含重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X－gal，青霉素可以筛选出转入了含目的基因的重组质粒和正常质粒的大肠杆菌，由于重组质粒中lacZ基因被破坏，而lacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X－gal，使菌落呈蓝色，若无该基因，菌落呈白色，故挑选出白色菌落即可。（5）研制血源性疫苗需灭活破坏乙肝病毒的核酸结构，有可能由于意外因素导致其没有被灭活，导致乙肝病毒在宿主细胞内大量增殖，从而使接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不会引发病毒增殖和感染。
变式训练2：下列是基因工程的有关问题，请回答：
(1)限制性核酸内切酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是____________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是______________，和限制性核酸内切酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列____________(填“有”或“无”)专一性要求。
(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—。分析可知，最好选择限制酶________切割质粒，限制酶______切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是_______
______________________、_____________________________。
【答案】 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)DNA连接酶 无 (3)Ⅰ Ⅱ 限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏 目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列
【解析】 (1)限制性核酸内切酶(限制酶)能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，分别为黏性末端和平末端。
(2)目的基因和载体重组时需要DNA连接酶恢复所连接的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。多种限制酶切割，形成不同的切割位点，所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列没有专一性要求。
(3)由题干及图示可知，限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏，最好选择限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列，因此用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的DNA。
二、 标记基因的工作原理
例题：（2019·湖南长沙长郡中学月考）下图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
（1）过程①所用到的组织细胞是 ，过程④所用的酶是 。⑤过程常用 溶液处理大肠杆菌。
（2）经②过程得到的互补DNA片段，称为 。
（3）如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对图中质粒进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类 （填“相同”或“不同”），这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有 种和 种。
（4）如果只用限制酶Pst Ⅰ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后（受体大肠杆菌不含Ampr、Tetr），将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选 的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是 。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是_____________________________________________
_______________________________________________________________。
（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的_____________________________________________________
步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是
_______________________________________________________________。
【答案】 （1）人垂体组织细胞 DNA连接酶 CaCl2
（2）cDNA （3）相同 3 3 （4）含四环素抗性基因 完整的pBR322质粒（或含有Ampr、Tetr的质粒） 在丙中能存活，在乙中不能存活 （5）筛选含目的基因的受体细胞 磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基
【解析】 （1）过程①获得的是人生长激素mRNA，所以组织细胞取自人垂体组织细胞；过程④构建基因表达载体的酶是DNA连接酶；过程⑤将基因表达载体导入大肠杆菌前，常用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。（2）②过程是人的生长素mRNA逆转录形成cDNA的过程。（3）Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ三种酶的切点分别用1、2、3表示，一种酶酶切时，一共可以得到3种相同长度的片段；两种酶酶切时，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3－1六种片段；三种酶酶切时，可得到1－2，2－3，3－1三种片段，与前面重复，因此用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类相同。这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有3种和3种。（4）在甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中能生长的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的pBR322质粒或含有Ampr、Tetr的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的乙培养基上生长，但四环素抗性基因是完好的，则含有目的基因的大肠杆菌能在含有四环素的丙培养基上生长。（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞步骤。该基因工程中的pBR322质粒的化学本质是DNA，其彻底水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。
【难点突破】
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：
变式训练：（2016·全国卷Ⅰ，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有
_______________________________________________________________
（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________________________；
并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有 的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于__________________________________________________________。
【答案】 （1）能自我复制、具有标记基因
（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素
（3）受体细胞
【解析】 （1）作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和筛选；③具一个至多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。（2）在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。（3）噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。
三、 利用PCR技术扩增目的基因
例题：（2019·河北石家庄质检）资料一 PCR（聚合酶链式反应）三个基本反应步骤是模板DNA在体外加热至95 ℃时解旋成单链，温度降至55 ℃左右，引物与模板单链按碱基互补配对的原则结合，再调至72 ℃左右时，DNA聚合酶沿5′→3′（磷酸到五碳糖）的方向延伸引物合成互补链。三个步骤完成一次称一个循环。
资料二 图1显示了目的基因及限制酶切点，A、B、C、D是四种单链DNA片段；图2是质粒（显示限制酶切点和标记基因），一般来说，为了使切割后的目的基因与运载体结合，往往使用两种限制酶，同时还要破坏载体上的一个标记基因。
根据资料回答：
（1）若利用PCR技术增加目的基因的数量，所用的酶是 。由图1可知，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取 作为引物，该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生DNA片段 个。
（2）为了提高目的基因和质粒的重组成功率，同时有利于受体细胞的筛选，应该选择的限制酶是 。如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切割且每次机会相等，则形成的含有完整抗四环素基因的DNA片段有 种。
（3）DNA连接酶中既能连接黏性末端又能连接平末端的是 。将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是 。
（4）对基因组文库的描述，错误的是 。
A．含有某种生物的全部基因
B．基因中含有启动子和内含子
C．文库的基因是通过受体菌承载的
D．文库中的全部基因可以在物种间交流
【答案】 （1）Taq酶（或TaqDNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶） B和C 16
（2）Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ 1
（3）T4DNA连接酶 农杆菌转化法 （4）D
【解析】 （1）利用PCR技术扩增目的基因时，所使用的酶是Taq酶。DNA复制需要引物，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成总是从子链的5′端向3′端延伸，因此选用B、C单链DNA片段作为引物。该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生DNA片段24＝16（个）。（2）为了提高目的基因和质粒的重组成功率，同时有利于受体细胞的筛选，一般选用双酶切法，且选用的限制酶不能破坏目的基因，若选用限制酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ，则载体上的两个标记基因都会被破坏，因此应该选用的限制酶是Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ。如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切割且每次机会相等，则只有Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后会形成含有完整抗四环素基因的DNA片段。（3）T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。常采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。（4）基因组文库就是把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌群中。基因组文库含有某种生物的全部基因，基因中含有启动子和内含子，只有部分基因可以在物种间交流。
【难点突破】
PCR技术
（2）PCR反应过程
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解旋为单链
复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸
（3）结果： 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子 ，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
变式训练：.(2019·广东深圳调研)据报道，美国科研人员通过基因转移技术，从根本上治愈了实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病，这种技术把选定的X基因输入胰腺，这些基因随后得到整合并促使消化系统和其他类型的细胞制造胰岛素，请回答下列问题：
(1)在基因工程中，X基因称为________。利用PCR技术扩增X基因时，需要在反应体系中添加的有机物质是________、________、4种脱氧核糖核苷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程在PCR扩增仪中完成。
(2)将X基因导入小鼠体内之前，需要操作的核心步骤是________________，此步骤最常用的运载工具是________，所需要的酶是限制酶和________。
(3)X基因的检测可从分子水平和个体水平两方面进行，在分子水平上通常采用________技术检测X基因是否导入受体细胞，在个体水平上应检测______________________________________________。
【答案】 (1)目的基因 引物 模板DNA (2)基因表达载体的构建 质粒 DNA连接酶 (3)DNA分子杂交 实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病是否被根治
【解析】 (1)根据题意分析，研究人员通过基因转移技术，将选定的X基因输入胰腺，说明X基因是目的基因；利用PCR技术扩增目的基因时，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板DNA、4种脱氧核糖核苷酸等，还需要耐热的DNA聚合酶。(2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，该过程常用的运载体是质粒，需要先用限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来。(3)在分子水平上检测X基因是否导入受体细胞，可以利用DNA分子杂交技术；根据题干信息可知，X基因导入胰腺细胞后，可以治愈实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病，因此在个体水平上检测X基因是否导入受体细胞，应该检测实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病是否被根治。
【真题回顾】
1．（2017·江苏省高考真题）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过______________获得______________用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有___________（填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。
【答案】逆转录 cDNA 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 变性 引物与模板 GC含量高 ②③
【解析】
（1）PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，从而用于PCR扩增。
（2）构建重组质粒，首先用限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒，所以位于目的基因两端的引物中需要增加适量的限制酶位点。设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，不能与模板相连。
（3）图中步骤1、2、3分别表示变性、退火、延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）退火表示引物与模板链相连，若温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。由于G-C间三个氢键，A-T间两个键，所以G-C含量越高的引物，退火温度越高。
（5）PCR反应得不到任何扩增产物，可能是退火温度过高，导致引物与模板不能相连，或引物间相互配对，引物自连，不能与模板相连，可通过降低退火温度或重新设计引物进行改进。
2．（2019·全国高考真题）基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。
【答案】基因组文库 cDNA文库 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键 Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
【解析】
（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库(CDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。
（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。
（3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。
3．（2018·全国高考真题）某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_________。使用这两种酶进行酶切是为了保证_______________，也是为了保证__________________。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和_________过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_____________移入牛的____________中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的____________（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。
【答案】E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 转录 翻译 细胞核 去核卵母细胞 核DNA
【解析】
（1）要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5ˊ末端而获得的L1-GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。
（2）构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白（GFP）”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。
（3）若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。
（4）PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
4．（2016·天津高考真题）人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子 C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是____________。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是____________________________________。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。
【答案】（12分）（1）总RNA （或mRNA）
（2）B
（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化
（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工
（5）HSA
【解析】
（1）合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，然后通过逆转录过程获得。采用PCR技术扩增HSA时，母链的方向是3＇到5＇，子链的延伸方向是5＇到3＇，两条引物分别与模板链的5＇端互补配对结合，引导子链延伸，故两条引物延伸方向是相反的。
（2）根据启动子通常具有物种及组织特异性，在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA，需选择水稻胚乳细胞的启动子。
（3）农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引农杆菌向受伤组织集中转化。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中。水稻是单子叶植物，不能产生上述的酚类化合物，故在农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需要添加酚类化合物，吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因的转移。
（4）水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行加工才能形成正确的空间结构，获得的HAS才有活性，而大肠杆菌是原核生物，细胞中不具有膜结构的细胞器，无法对初始rHSA多肽进行加工。
（5）为证明rHSA具有医用价值，需确认rHSA与天然的HSA的生物学功能是否一致。
5．（2020·浙江省高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与泡菜制作有关的问题：
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。
（2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的粘性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。
【答案】果胶酶 细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质 喜好氧的 不耐酸的 稀释 涂布分离 酸碱指示剂 乙醇 过滤灭菌 染色法，渗透吸水或失水 化学合成 两种限制性核酸内切酶 扩增 细胞壁 胚胎发生
【解析】
（一）
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋酸杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。
（二）
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经过滤灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。可采用染色法、渗透吸水或失水的方法测定该原生质体的活性。
（2）可采用人工合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的粘性末端，需要选择使用两种限制性核酸内切酶，对质粒也进行相同的处理，为了提高目的基因和质粒重组的成功率，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过胚胎发生或器官发生的途径再生植株。
6．（2016·江苏省高考真题）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中______________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_______，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
【答案】（1）BclI和HindⅢ 连接 感受
（2）四环素 引物甲和引物丙
（3）都不能
（4）7
【解析】
（1）选择的限制酶在目的基因的两侧都应该有切割位点，又因为用BamHⅠ酶会将两个标记基因都破坏，所以构建基因表达载体时只能选择BclI和HindⅢ对质粒和目的基因进行切割，漏出两种不同的粘性末端，再利用DNA连接酶将两者定向连接。再将重组质粒导入感受态的大肠杆菌进行扩增。
（2）由于构建重组质粒的时候，氨苄青霉素抗性基因被破坏，而四环素的抗性基因没有被破坏，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。根据图2可知对目的基因进行扩增时的引物应该是引物甲和引物丙。
（3）根据表格中碱基分析，若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能切开。
（4）根据表格分析可知Sau3A I可以切割BclI和BamHⅠ的切割位点，所以若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
7．（2019·天津高考真题）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________。
A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建____________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程______________中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程__________________在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明_________________。
【答案】D 精子 cDNA ② ① BCD B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
【解析】
（1）通过题干信息可知，B基因可以在体细胞和精子中，说明含B基因的染色体未缺失，也没有发生基因突变，AC错误；基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶，不是DNA聚合酶，B错误；B基因在卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D正确；故选D。
（2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA，从而构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。
（3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程②表示用含有重组质粒的农杆菌转化水稻细胞的过程，该过程将其T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上。
（4）获得转基因植株，鉴定筛选方式有：①DNA分子杂交技术，即以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交，故A错误；B正确；②用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，即以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交，C正确；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，通过（2）可知B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因，即可通过Luc基因表达，检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，D正确；故选BCD。
（5）转基因植株含有促进B基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中B基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
8．（2017·全国高考真题）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子）可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________。
（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_______作为载体，其原因是_________。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________(答出两点即可)等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________。
【答案】基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A 噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 繁殖快、容易培养 蛋白A的抗体 DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物体
【解析】
（1）基因A的编码区中有内含子，在真核生物细胞内把内含子转录来的RNA切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后直接表达，所以翻译形成的蛋白质不是蛋白A。
（2）由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。
（3）大肠杆菌作为受体菌具有繁殖周期短、易培养、遗传物质较少等特点，转入的基因受大肠杆菌遗传物质影响较小，短期内容易得到较多的基因表达的产物。
（4）检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物转移到另一种生物个体。
9．（2019·江苏省高考真题）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。
（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。
【答案】平 胸腺嘧啶（T） DNA连接 B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 乙丙 目的基因反向连接
【解析】
（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）依题意并据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶（EcoRV酶）切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
10．（2019·海南省高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。
（3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。
【答案】mRNA 逆转录酶 PCR T-DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
【解析】
（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
【新题精练】
1．（2020·山东省高三二模）玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，低温会影响玉米的产量和品质。研究者将从微生物中获得的CSP（冷激蛋白）基因与玉米基因的ubi启动子相连后构建基因表达载体，并将其导入玉米细胞中，获得了具有低温耐受性的玉米植株，过程如图1所示。
（1）研究者提取玉米的DNA，利用PCR技术将ubi启动子扩增出来。该过程需设计合适的引物，引物设计时需已知___________，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需___________次扩增才能获得所需的ubi启动子。
（2）图1所示的流程图中，过程①需___________的催化，获得的ubi-CSP基因在构建基因表达载体时，在Ti质粒上的插部位为___________。过程②需要用CaCl2溶液处理农杆菌，其目的是___________。过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含___________的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经培育获得转基因玉米。
（3）研究者分别提取了野生型玉米及5株转基因玉米的染色体DNA，用限制酶处理后进行电泳。电泳后的DNA与基因探针进行杂交，得到图2所示放射性检测结果，该基因探针应为___________片段，实验结果表明___________。
（4）在个体水平上对转玉米植株进行___________实验，可检测CSP基因是否已在玉米中表达。
【答案】ubi两端的一段序列 3 限制酶和DNA连接酶 T-DNA内部（且不破坏hpt） 获得感受态细胞（或:使农杆菌处于易于吸收外源DNA的状态） 潮霉素 含放射性同位素标记的CSP基因 除植株3外，其他4株转基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中 低温耐受性
【解析】
（1）在利用PCR技术进行扩增时，需要事先设计引物，这里需要根据ubi启动子设计合适的引物，因此需已知ubi两端的一段序列，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需3次才能获得引物之间的核苷酸序列，即至少需3次扩增才能获得所需的ubi启动子。
（2）图1中，过程①为载体和目的基因相连的过程，因此需限制酶和DNA连接酶的催化从而实现连接，在获得ubi-CSP基因构表达载体时，需要将ubi-CSP基因插入T-DNA内部（且不破坏hpt），这样能保证T-DNA转移时携带目的基因与玉米的染色体DNA连接。过程②为导入受体细胞的过程，为了提高导入的成功率，通常用CaCl2溶液处理农杆菌，使其成为感受态细胞，因为处于感受态的农杆菌易于吸收外源DNA，过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含潮霉素的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经脱分化过程长成幼苗，从而获得了转基因玉米植株
（3）图2所示放射性检测结果，因此这里的基因探针为含放射性同位素标记的CSP基因片段，实验结果显示在第1、2、4、5株玉米中检测出目的基因的放射性，据此可知除植株3外，其他4株转基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中。
（4）在个体水平上，可以通过对转玉米植株进行低温耐受性实验，进而检测CSP基因是否在玉米中成功表达。
（2020·上海高三二模）pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落：而限制酶A、B、C、D在pIJ702上分别只有一处识别序列。以B和C切取的目的基因置换pIJ702上0．4kb（1kb=1000对碱基）的B/C片段，构成重组质粒，如图。
2．构成重组质粒时除了限制酶还需用到工具酶是_____________。上述基因工程中的受体细胞是_____________（硫链丝菌/链霉菌）细胞。
3．将上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在表中。
限制酶
pIJ702
重组质粒
A
5．7
1．6Kb，5．1Kb
D
5．7
2．2Kb，4．5Kb
由此判断目的基因内部是否含有限制酶A、D切割位点，其情况是目的基因中 。
A．只有A酶切割位点 B．只有D酶切割位点
C．两者都有切割位点 D．两者都没有切割位点
不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况如表所示。
固体培养基中硫链丝菌素浓度（ug/mL）
0
1
2
5
10
不含质粒的链霉菌生长状况
+++++
+++
+
-
-
“+”表示生长；“-”表示不生长
4．若要筛选接纳了pIJ702或重组质粒的链霉菌细胞，所需的硫链丝菌素最小浓度应为____________ug/mL（填写表3中给定浓度）；含有重组质粒的菌落呈____________（白/黑）色。
5．上述目的基因来源于原核生物，其蛋白质编码序列（即编码从起始密码子到终止密码子之间的序列）经测定为1256对碱基，试判断对这段序列的测定是否存在错误？并说明依据。____________。
【答案】
2． DNA连接酶 链霉菌
3．C
4． 5 白
5．错误，原核生物决定每个氨基酸的密码为三联密码，所以基因的编码碱基序列应为3的整数倍
【解析】
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2．构建重组质粒需要用限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，还需要使用DNA连接酶将相同的末端连接起来，所以构成重组质粒时除了限制酶还需用到工具酶是DNA连接酶。mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，分析示意图，目的基因是插入到了mel基因中，所以不能再使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，便于筛选，所以此时的受体细胞应该是链霉菌。
3．pIJ702经限制酶A或D切割，均获得5.7kb的片段，说明pIJ702上存在限制酶A、D各一个识别位点，重组质粒经限制酶A或D切割，均获得两种片段，说明pIJ702上存在限制酶A、D各两个识别位点，级目的基因内部含有限制酶A、D各一个切割位点，C正确。
故选C。
4．从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5ug/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5ug/mL；mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，由于mel基因被替换后，链霉菌菌落不能变黑，而成为白色。
5．原核生物的编码区是连续的，由于决定每个氨基酸的碱基序列为三个相连的碱基，所以基因的编码碱基序列应为3的整数倍，而基因中1256对碱基转录成的mRNA含有从起始密码到终止密码有1256个碱基，不能被3整除，故测序肯定错误。
（2020·上海高三二模）在天宫二号上进行的拟南芥培育实验中，为监控植物的开花过程，科研人员给拟南芥安装了“追踪器”，即利用控制植物开花基因相同的“启动子”（启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，决定基因的转录与否）带动绿色荧光蛋白（GFP）基因在微重力条件下表达并获得实时荧光图像。转基因拟南芥植物在构建过程中首先需分别构建植株A和植株B，安装“追踪器”和构建植株A过程如图1所示。
6．据图1分析，图中步骤①进行的切割，选择的限制酶是 。
A．EcoRⅠ酶 B．HindⅢ酶
C．EcoRⅠ酶和HindⅢ酶 D．HindⅢ酶和BamHⅠ酶
7．获得转基因拟南芥植株A的基因工程目的基因是___________；受体细胞是___________。基因工程步骤④是___________。
8．在步骤⑤中，让含重组Ti质粒1的农杆菌侵入拟南芥愈伤组织而非拟南芥叶肉细胞的主要原因是______________________；步骤⑥主要运用的技术是____________。
科研人员进一步构建植株B，构建过程如图2所示，图2中启动子序列与图1中相同。
9．已知步骤⑤为农杆菌转化法。因为Ti质粒既有在细菌中表达的基因，同时又有在高等植物中表达的基因，所以需要将重组质粒2与Ti质粒重组后，再导入受体细胞。下列关于所选Ti质粒的说法正确的是
A．Ti质粒本身应具有绿色荧光蛋白基因
B．Ti质粒本身应具有植物开花基因
C．Ti质粒为双链闭环DNA分子
D．Ti质粒的受体细胞应为农杆菌细胞
10．科研人员对重组质粒2直接进行基因测序，以筛选获得重组质粒2。除此方法外，利用图2所给信息，试举出其他筛选重组质粒2的方法。____________________________________。
11．科研人员成功获得植株A和植株B后，如何获得纯合转基因拟南芥植株?纯合转基因拟南芥植株有何优点?________________________________________________。
【答案】
6．D
7． 绿色荧光蛋白基因 拟南芥愈伤组织细胞 筛选含重组Ti质粒1的农杆菌
8． 愈伤组织的全能性较强，更容易组织培养成功，叶肉细胞高度分化 植物组织培养技术
9．CD
10．将重组质粒2导入大肠杆菌（其他合适的受体细胞也可），能在含氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含四环素或含卡那霉素的培养基中生长的为重组质粒2
11．科研人员成功获得植株A和植株B后，再通过杂交及纯合体筛选试验（经过纯合体筛选获得的植株亲本性状能够稳定遗传），进而获得纯合转基因拟南芥植株。
转基因拟南芥植株的优点：因为用相同的启动子，所以当要开花的时候，开花基因会表达，而荧光蛋白基因也会表达，科学家能够通过监控实时荧光图像，监控拟南芥植株的开花过程，操作方便，信息准确
【解析】
分析图1可知，①将目的基因导入质粒；②构建重组Ti质粒；③将重组Ti质粒导入农杆菌细胞；④筛选含重组Ti质粒1的农杆菌；⑤导入受体细胞（农杆菌转化法）；⑥植物组织培养。
6．分析图1可知，EcoRⅠ酶会破坏GFP基因，A、C错误；HindⅢ酶单独切割，不能获得启动子序列，B错误；要获得GFP基因和启动子序列，需要HindⅢ酶和BamHⅠ酶共同切割，D正确。
故选D。
7．根据图1分析可知，通过基因工程获得转基因拟南芥植株A的目的基因是，具有与植物开花基因相同“启动子”的绿色荧光蛋白基因；由⑤过程可知，受体细胞是拟南芥愈伤组织细胞；基因工程步骤④是筛选含重组Ti质粒1的农杆菌。
8．在步骤⑤中，以拟南芥的愈伤组织作受体细胞，是因为愈伤组织的全能性较强，更容易通过组织培养形成转基因植株，叶肉细胞高度分化，全能性不易表达；步骤⑥是将拟南芥愈伤组织通过再分化形成植株A，利用了植物组织培养技术。
9．A、由图1可知，绿色荧光蛋白基因位于质粒1上，Ti质粒本身不具有该基因，A错误；
B、由图2可知，植物开花基因为目的基因，Ti质粒本身不具有该基因，B错误；
C、Ti质粒是独立于细菌拟核之外的小型双链闭环DNA分子，C正确；
D、由过程③可知，Ti质粒的受体细胞应为农杆菌细胞，D正确。
故选CD。
10．当质粒2中插入启动子序列和开花基因后，Tcr基因和Kan基因被破坏，Ampr基因正常，所以可以将重组质粒2导入大肠杆菌，并分别在含氨苄青霉素、四环素、卡那霉素的培养基上培养大肠杆菌，筛选出能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素或含卡那霉素的培养基中生长的，即为重组质粒2。
11．将成功获得的植株A和植株B进行杂交，筛选出后代能够稳定遗传的亲本个体，进而获得纯合转基因拟南芥植株。因为荧光蛋白基因和开花基因用了相同的启动子，所以当拟南芥植株要开花时，荧光蛋白基因和开花基因会一起表达，科学家能够通过监控实时荧光图像，监控拟南芥植株的开花过程，操作方便，信息准确。
2020届高考生物难点及易错题精讲精练
专题13 基因工程
【难点精讲】
一、限制酶的选择
例题：（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接，理由是_______________________________________________________________________________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ，不能表达的原因是
______________________________________________________________。
图（c）
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和 ，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_________。
【答案】 （1）Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 （2）甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 （3）E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
【解析】 三种限制酶切割结果分析
表达载体与重组DNA分子分析
【难点突破】
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst Ⅰ因其会破坏标记基因而不宜选择。
③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
④所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
（3）参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）
变式训练1：（2019·湖北武汉市调研）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用高速离心法提纯血液中的乙肝病毒，之后再将其灭活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染风险。如图所示为乙肝基因工程疫苗的生产和使用过程（注：质粒中lacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X－gal，从而使菌落呈蓝色，若无该基因，则菌落呈白色）。请回答下列问题：
（1）过程①最好选用的限制酶方案可以是 。
A．EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ B．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ
C．EcoR Ⅴ和EcoR Ⅰ D．只用BamH Ⅰ
（2）由图中过程③可知，该目的基因的具体功能是
______________________________________________________________。
（3）若要迅速获取大量的目的基因，以提高重组质粒产生的效率，常用的技术是
（写中文全称）。图中过程②常需要用 处理，使大肠杆菌细胞转化为感受态细胞。
（4）为了筛选、获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入 ，培养一段时间挑选出呈 （填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养获得大量目的菌。
（5）用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因
________________________________________________________________。
【答案】 （1）B （2）指导合成乙肝病毒外壳蛋白 （3）多聚酶链式反应 Ca2＋ （4）青霉素和X－gal 白色 （5）研制血源性疫苗需灭活破坏乙肝病毒的核酸结构，灭活不成功则会导致接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不会引发病毒增殖和感染
【解析】 （1）分析题意可知，切割目的基因和运载体应用相同的限制酶，所用限制酶要保证目的基因的完整性，并且把目的基因插入质粒中，故选用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ（用一种限制酶切割时，目的基因和运载体可能会发生自身环化或随意连接）。（2）从过程③可知，目的基因在大肠杆菌体内可表达出乙肝病毒外壳，故该目的基因的功能是指导乙肝病毒外壳蛋白的合成。（3）获取大量目的基因通常采用PCR技术扩增，即多聚酶链式反应。将目的基因导入大肠杆菌细胞的方法通常是用Ca2＋处理细胞，使其变成易于接受外源DNA的感受态细胞。（4）筛选含重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X－gal，青霉素可以筛选出转入了含目的基因的重组质粒和正常质粒的大肠杆菌，由于重组质粒中lacZ基因被破坏，而lacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X－gal，使菌落呈蓝色，若无该基因，菌落呈白色，故挑选出白色菌落即可。（5）研制血源性疫苗需灭活破坏乙肝病毒的核酸结构，有可能由于意外因素导致其没有被灭活，导致乙肝病毒在宿主细胞内大量增殖，从而使接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不会引发病毒增殖和感染。
变式训练2：下列是基因工程的有关问题，请回答：
(1)限制性核酸内切酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是____________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是______________，和限制性核酸内切酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列____________(填“有”或“无”)专一性要求。
(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—。分析可知，最好选择限制酶________切割质粒，限制酶______切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是_______
______________________、_____________________________。
【答案】 (1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)DNA连接酶 无 (3)Ⅰ Ⅱ 限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏 目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列
【解析】 (1)限制性核酸内切酶(限制酶)能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，分别为黏性末端和平末端。
(2)目的基因和载体重组时需要DNA连接酶恢复所连接的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。多种限制酶切割，形成不同的切割位点，所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列没有专一性要求。
(3)由题干及图示可知，限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏，最好选择限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列，因此用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的DNA。
二、 标记基因的工作原理
例题：（2019·湖南长沙长郡中学月考）下图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
（1）过程①所用到的组织细胞是 ，过程④所用的酶是 。⑤过程常用 溶液处理大肠杆菌。
（2）经②过程得到的互补DNA片段，称为 。
（3）如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对图中质粒进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类 （填“相同”或“不同”），这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有 种和 种。
（4）如果只用限制酶Pst Ⅰ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后（受体大肠杆菌不含Ampr、Tetr），将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选 的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是 。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是_____________________________________________
_______________________________________________________________。
（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的_____________________________________________________
步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是
_______________________________________________________________。
【答案】 （1）人垂体组织细胞 DNA连接酶 CaCl2
（2）cDNA （3）相同 3 3 （4）含四环素抗性基因 完整的pBR322质粒（或含有Ampr、Tetr的质粒） 在丙中能存活，在乙中不能存活 （5）筛选含目的基因的受体细胞 磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基
【解析】 （1）过程①获得的是人生长激素mRNA，所以组织细胞取自人垂体组织细胞；过程④构建基因表达载体的酶是DNA连接酶；过程⑤将基因表达载体导入大肠杆菌前，常用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。（2）②过程是人的生长素mRNA逆转录形成cDNA的过程。（3）Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ三种酶的切点分别用1、2、3表示，一种酶酶切时，一共可以得到3种相同长度的片段；两种酶酶切时，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3－1六种片段；三种酶酶切时，可得到1－2，2－3，3－1三种片段，与前面重复，因此用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类相同。这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有3种和3种。（4）在甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中能生长的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的pBR322质粒或含有Ampr、Tetr的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的乙培养基上生长，但四环素抗性基因是完好的，则含有目的基因的大肠杆菌能在含有四环素的丙培养基上生长。（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞步骤。该基因工程中的pBR322质粒的化学本质是DNA，其彻底水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。
【难点突破】
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：
变式训练：（2016·全国卷Ⅰ，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有
_______________________________________________________________
（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________________________；
并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有 的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于__________________________________________________________。
【答案】 （1）能自我复制、具有标记基因
（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素
（3）受体细胞
【解析】 （1）作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和筛选；③具一个至多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。（2）在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。（3）噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。
三、 利用PCR技术扩增目的基因
例题：（2019·河北石家庄质检）资料一 PCR（聚合酶链式反应）三个基本反应步骤是模板DNA在体外加热至95 ℃时解旋成单链，温度降至55 ℃左右，引物与模板单链按碱基互补配对的原则结合，再调至72 ℃左右时，DNA聚合酶沿5′→3′（磷酸到五碳糖）的方向延伸引物合成互补链。三个步骤完成一次称一个循环。
资料二 图1显示了目的基因及限制酶切点，A、B、C、D是四种单链DNA片段；图2是质粒（显示限制酶切点和标记基因），一般来说，为了使切割后的目的基因与运载体结合，往往使用两种限制酶，同时还要破坏载体上的一个标记基因。
根据资料回答：
（1）若利用PCR技术增加目的基因的数量，所用的酶是 。由图1可知，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取 作为引物，该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生DNA片段 个。
（2）为了提高目的基因和质粒的重组成功率，同时有利于受体细胞的筛选，应该选择的限制酶是 。如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切割且每次机会相等，则形成的含有完整抗四环素基因的DNA片段有 种。
（3）DNA连接酶中既能连接黏性末端又能连接平末端的是 。将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是 。
（4）对基因组文库的描述，错误的是 。
A．含有某种生物的全部基因
B．基因中含有启动子和内含子
C．文库的基因是通过受体菌承载的
D．文库中的全部基因可以在物种间交流
【答案】 （1）Taq酶（或TaqDNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶） B和C 16
（2）Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ 1
（3）T4DNA连接酶 农杆菌转化法 （4）D
【解析】 （1）利用PCR技术扩增目的基因时，所使用的酶是Taq酶。DNA复制需要引物，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成总是从子链的5′端向3′端延伸，因此选用B、C单链DNA片段作为引物。该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生DNA片段24＝16（个）。（2）为了提高目的基因和质粒的重组成功率，同时有利于受体细胞的筛选，一般选用双酶切法，且选用的限制酶不能破坏目的基因，若选用限制酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ，则载体上的两个标记基因都会被破坏，因此应该选用的限制酶是Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ。如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切割且每次机会相等，则只有Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后会形成含有完整抗四环素基因的DNA片段。（3）T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。常采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。（4）基因组文库就是把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌群中。基因组文库含有某种生物的全部基因，基因中含有启动子和内含子，只有部分基因可以在物种间交流。
【难点突破】
PCR技术
（2）PCR反应过程
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解旋为单链
复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸
（3）结果： 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子 ，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
变式训练：.(2019·广东深圳调研)据报道，美国科研人员通过基因转移技术，从根本上治愈了实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病，这种技术把选定的X基因输入胰腺，这些基因随后得到整合并促使消化系统和其他类型的细胞制造胰岛素，请回答下列问题：
(1)在基因工程中，X基因称为________。利用PCR技术扩增X基因时，需要在反应体系中添加的有机物质是________、________、4种脱氧核糖核苷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程在PCR扩增仪中完成。
(2)将X基因导入小鼠体内之前，需要操作的核心步骤是________________，此步骤最常用的运载工具是________，所需要的酶是限制酶和________。
(3)X基因的检测可从分子水平和个体水平两方面进行，在分子水平上通常采用________技术检测X基因是否导入受体细胞，在个体水平上应检测______________________________________________。
【答案】 (1)目的基因 引物 模板DNA (2)基因表达载体的构建 质粒 DNA连接酶 (3)DNA分子杂交 实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病是否被根治
【解析】 (1)根据题意分析，研究人员通过基因转移技术，将选定的X基因输入胰腺，说明X基因是目的基因；利用PCR技术扩增目的基因时，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板DNA、4种脱氧核糖核苷酸等，还需要耐热的DNA聚合酶。(2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，该过程常用的运载体是质粒，需要先用限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来。(3)在分子水平上检测X基因是否导入受体细胞，可以利用DNA分子杂交技术；根据题干信息可知，X基因导入胰腺细胞后，可以治愈实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病，因此在个体水平上检测X基因是否导入受体细胞，应该检测实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病是否被根治。
【真题回顾】
1．（2017·江苏省高考真题）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过______________获得______________用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有___________（填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。
【答案】逆转录 cDNA 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 变性 引物与模板 GC含量高 ②③
【解析】
（1）PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，从而用于PCR扩增。
（2）构建重组质粒，首先用限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒，所以位于目的基因两端的引物中需要增加适量的限制酶位点。设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，不能与模板相连。
（3）图中步骤1、2、3分别表示变性、退火、延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）退火表示引物与模板链相连，若温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。由于G-C间三个氢键，A-T间两个键，所以G-C含量越高的引物，退火温度越高。
（5）PCR反应得不到任何扩增产物，可能是退火温度过高，导致引物与模板不能相连，或引物间相互配对，引物自连，不能与模板相连，可通过降低退火温度或重新设计引物进行改进。
2．（2019·全国高考真题）基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。
【答案】基因组文库 cDNA文库 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键 Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
【解析】
（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库(CDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。
（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。
（3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。
3．（2018·全国高考真题）某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_________。使用这两种酶进行酶切是为了保证_______________，也是为了保证__________________。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和_________过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_____________移入牛的____________中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的____________（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。
【答案】E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 转录 翻译 细胞核 去核卵母细胞 核DNA
【解析】
（1）要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5ˊ末端而获得的L1-GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。
（2）构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白（GFP）”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。
（3）若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。
（4）PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
4．（2016·天津高考真题）人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子 C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是____________。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是____________________________________。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。
【答案】（12分）（1）总RNA （或mRNA）
（2）B
（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化
（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工
（5）HSA
【解析】
（1）合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，然后通过逆转录过程获得。采用PCR技术扩增HSA时，母链的方向是3＇到5＇，子链的延伸方向是5＇到3＇，两条引物分别与模板链的5＇端互补配对结合，引导子链延伸，故两条引物延伸方向是相反的。
（2）根据启动子通常具有物种及组织特异性，在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA，需选择水稻胚乳细胞的启动子。
（3）农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引农杆菌向受伤组织集中转化。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中。水稻是单子叶植物，不能产生上述的酚类化合物，故在农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需要添加酚类化合物，吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因的转移。
（4）水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行加工才能形成正确的空间结构，获得的HAS才有活性，而大肠杆菌是原核生物，细胞中不具有膜结构的细胞器，无法对初始rHSA多肽进行加工。
（5）为证明rHSA具有医用价值，需确认rHSA与天然的HSA的生物学功能是否一致。
5．（2020·浙江省高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与泡菜制作有关的问题：
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。
（2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的粘性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。
【答案】果胶酶 细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质 喜好氧的 不耐酸的 稀释 涂布分离 酸碱指示剂 乙醇 过滤灭菌 染色法，渗透吸水或失水 化学合成 两种限制性核酸内切酶 扩增 细胞壁 胚胎发生
【解析】
（一）
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋酸杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。
（二）
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经过滤灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。可采用染色法、渗透吸水或失水的方法测定该原生质体的活性。
（2）可采用人工合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的粘性末端，需要选择使用两种限制性核酸内切酶，对质粒也进行相同的处理，为了提高目的基因和质粒重组的成功率，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过胚胎发生或器官发生的途径再生植株。
6．（2016·江苏省高考真题）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中______________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_______，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
【答案】（1）BclI和HindⅢ 连接 感受
（2）四环素 引物甲和引物丙
（3）都不能
（4）7
【解析】
（1）选择的限制酶在目的基因的两侧都应该有切割位点，又因为用BamHⅠ酶会将两个标记基因都破坏，所以构建基因表达载体时只能选择BclI和HindⅢ对质粒和目的基因进行切割，漏出两种不同的粘性末端，再利用DNA连接酶将两者定向连接。再将重组质粒导入感受态的大肠杆菌进行扩增。
（2）由于构建重组质粒的时候，氨苄青霉素抗性基因被破坏，而四环素的抗性基因没有被破坏，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。根据图2可知对目的基因进行扩增时的引物应该是引物甲和引物丙。
（3）根据表格中碱基分析，若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能切开。
（4）根据表格分析可知Sau3A I可以切割BclI和BamHⅠ的切割位点，所以若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
7．（2019·天津高考真题）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________。
A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建____________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程______________中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程__________________在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明_________________。
【答案】D 精子 cDNA ② ① BCD B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
【解析】
（1）通过题干信息可知，B基因可以在体细胞和精子中，说明含B基因的染色体未缺失，也没有发生基因突变，AC错误；基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶，不是DNA聚合酶，B错误；B基因在卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D正确；故选D。
（2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA，从而构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。
（3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程②表示用含有重组质粒的农杆菌转化水稻细胞的过程，该过程将其T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上。
（4）获得转基因植株，鉴定筛选方式有：①DNA分子杂交技术，即以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交，故A错误；B正确；②用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，即以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交，C正确；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，通过（2）可知B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因，即可通过Luc基因表达，检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，D正确；故选BCD。
（5）转基因植株含有促进B基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中B基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
8．（2017·全国高考真题）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子）可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________。
（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_______作为载体，其原因是_________。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________(答出两点即可)等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________。
【答案】基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A 噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 繁殖快、容易培养 蛋白A的抗体 DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物体
【解析】
（1）基因A的编码区中有内含子，在真核生物细胞内把内含子转录来的RNA切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后直接表达，所以翻译形成的蛋白质不是蛋白A。
（2）由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。
（3）大肠杆菌作为受体菌具有繁殖周期短、易培养、遗传物质较少等特点，转入的基因受大肠杆菌遗传物质影响较小，短期内容易得到较多的基因表达的产物。
（4）检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物转移到另一种生物个体。
9．（2019·江苏省高考真题）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。
（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。
【答案】平 胸腺嘧啶（T） DNA连接 B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 乙丙 目的基因反向连接
【解析】
（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）依题意并据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶（EcoRV酶）切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
10．（2019·海南省高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。
（3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。
【答案】mRNA 逆转录酶 PCR T-DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
【解析】
（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
【新题精练】
1．（2020·山东省高三二模）玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，低温会影响玉米的产量和品质。研究者将从微生物中获得的CSP（冷激蛋白）基因与玉米基因的ubi启动子相连后构建基因表达载体，并将其导入玉米细胞中，获得了具有低温耐受性的玉米植株，过程如图1所示。
（1）研究者提取玉米的DNA，利用PCR技术将ubi启动子扩增出来。该过程需设计合适的引物，引物设计时需已知___________，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需___________次扩增才能获得所需的ubi启动子。
（2）图1所示的流程图中，过程①需___________的催化，获得的ubi-CSP基因在构建基因表达载体时，在Ti质粒上的插部位为___________。过程②需要用CaCl2溶液处理农杆菌，其目的是___________。过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含___________的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经培育获得转基因玉米。
（3）研究者分别提取了野生型玉米及5株转基因玉米的染色体DNA，用限制酶处理后进行电泳。电泳后的DNA与基因探针进行杂交，得到图2所示放射性检测结果，该基因探针应为___________片段，实验结果表明___________。
（4）在个体水平上对转玉米植株进行___________实验，可检测CSP基因是否已在玉米中表达。
【答案】ubi两端的一段序列 3 限制酶和DNA连接酶 T-DNA内部（且不破坏hpt） 获得感受态细胞（或:使农杆菌处于易于吸收外源DNA的状态） 潮霉素 含放射性同位素标记的CSP基因 除植株3外，其他4株转基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中 低温耐受性
【解析】
（1）在利用PCR技术进行扩增时，需要事先设计引物，这里需要根据ubi启动子设计合适的引物，因此需已知ubi两端的一段序列，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需3次才能获得引物之间的核苷酸序列，即至少需3次扩增才能获得所需的ubi启动子。
（2）图1中，过程①为载体和目的基因相连的过程，因此需限制酶和DNA连接酶的催化从而实现连接，在获得ubi-CSP基因构表达载体时，需要将ubi-CSP基因插入T-DNA内部（且不破坏hpt），这样能保证T-DNA转移时携带目的基因与玉米的染色体DNA连接。过程②为导入受体细胞的过程，为了提高导入的成功率，通常用CaCl2溶液处理农杆菌，使其成为感受态细胞，因为处于感受态的农杆菌易于吸收外源DNA，过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含潮霉素的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经脱分化过程长成幼苗，从而获得了转基因玉米植株
（3）图2所示放射性检测结果，因此这里的基因探针为含放射性同位素标记的CSP基因片段，实验结果显示在第1、2、4、5株玉米中检测出目的基因的放射性，据此可知除植株3外，其他4株转基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中。
（4）在个体水平上，可以通过对转玉米植株进行低温耐受性实验，进而检测CSP基因是否在玉米中成功表达。
（2020·上海高三二模）pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落：而限制酶A、B、C、D在pIJ702上分别只有一处识别序列。以B和C切取的目的基因置换pIJ702上0．4kb（1kb=1000对碱基）的B/C片段，构成重组质粒，如图。
2．构成重组质粒时除了限制酶还需用到工具酶是_____________。上述基因工程中的受体细胞是_____________（硫链丝菌/链霉菌）细胞。
3．将上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在表中。
限制酶
pIJ702
重组质粒
A
5．7
1．6Kb，5．1Kb
D
5．7
2．2Kb，4．5Kb
由此判断目的基因内部是否含有限制酶A、D切割位点，其情况是目的基因中 。
A．只有A酶切割位点 B．只有D酶切割位点
C．两者都有切割位点 D．两者都没有切割位点
不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况如表所示。
固体培养基中硫链丝菌素浓度（ug/mL）
0
1
2
5
10
不含质粒的链霉菌生长状况
+++++
+++
+
-
-
“+”表示生长；“-”表示不生长
4．若要筛选接纳了pIJ702或重组质粒的链霉菌细胞，所需的硫链丝菌素最小浓度应为____________ug/mL（填写表3中给定浓度）；含有重组质粒的菌落呈____________（白/黑）色。
5．上述目的基因来源于原核生物，其蛋白质编码序列（即编码从起始密码子到终止密码子之间的序列）经测定为1256对碱基，试判断对这段序列的测定是否存在错误？并说明依据。____________。
【答案】
2． DNA连接酶 链霉菌
3．C
4． 5 白
5．错误，原核生物决定每个氨基酸的密码为三联密码，所以基因的编码碱基序列应为3的整数倍
【解析】
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2．构建重组质粒需要用限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，还需要使用DNA连接酶将相同的末端连接起来，所以构成重组质粒时除了限制酶还需用到工具酶是DNA连接酶。mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，分析示意图，目的基因是插入到了mel基因中，所以不能再使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，便于筛选，所以此时的受体细胞应该是链霉菌。
3．pIJ702经限制酶A或D切割，均获得5.7kb的片段，说明pIJ702上存在限制酶A、D各一个识别位点，重组质粒经限制酶A或D切割，均获得两种片段，说明pIJ702上存在限制酶A、D各两个识别位点，级目的基因内部含有限制酶A、D各一个切割位点，C正确。
故选C。
4．从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5ug/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5ug/mL；mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，由于mel基因被替换后，链霉菌菌落不能变黑，而成为白色。
5．原核生物的编码区是连续的，由于决定每个氨基酸的碱基序列为三个相连的碱基，所以基因的编码碱基序列应为3的整数倍，而基因中1256对碱基转录成的mRNA含有从起始密码到终止密码有1256个碱基，不能被3整除，故测序肯定错误。
（2020·上海高三二模）在天宫二号上进行的拟南芥培育实验中，为监控植物的开花过程，科研人员给拟南芥安装了“追踪器”，即利用控制植物开花基因相同的“启动子”（启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，决定基因的转录与否）带动绿色荧光蛋白（GFP）基因在微重力条件下表达并获得实时荧光图像。转基因拟南芥植物在构建过程中首先需分别构建植株A和植株B，安装“追踪器”和构建植株A过程如图1所示。
6．据图1分析，图中步骤①进行的切割，选择的限制酶是 。
A．EcoRⅠ酶 B．HindⅢ酶
C．EcoRⅠ酶和HindⅢ酶 D．HindⅢ酶和BamHⅠ酶
7．获得转基因拟南芥植株A的基因工程目的基因是___________；受体细胞是___________。基因工程步骤④是___________。
8．在步骤⑤中，让含重组Ti质粒1的农杆菌侵入拟南芥愈伤组织而非拟南芥叶肉细胞的主要原因是______________________；步骤⑥主要运用的技术是____________。
科研人员进一步构建植株B，构建过程如图2所示，图2中启动子序列与图1中相同。
9．已知步骤⑤为农杆菌转化法。因为Ti质粒既有在细菌中表达的基因，同时又有在高等植物中表达的基因，所以需要将重组质粒2与Ti质粒重组后，再导入受体细胞。下列关于所选Ti质粒的说法正确的是
A．Ti质粒本身应具有绿色荧光蛋白基因
B．Ti质粒本身应具有植物开花基因
C．Ti质粒为双链闭环DNA分子
D．Ti质粒的受体细胞应为农杆菌细胞
10．科研人员对重组质粒2直接进行基因测序，以筛选获得重组质粒2。除此方法外，利用图2所给信息，试举出其他筛选重组质粒2的方法。____________________________________。
11．科研人员成功获得植株A和植株B后，如何获得纯合转基因拟南芥植株?纯合转基因拟南芥植株有何优点?________________________________________________。
【答案】
6．D
7． 绿色荧光蛋白基因 拟南芥愈伤组织细胞 筛选含重组Ti质粒1的农杆菌
8． 愈伤组织的全能性较强，更容易组织培养成功，叶肉细胞高度分化 植物组织培养技术
9．CD
10．将重组质粒2导入大肠杆菌（其他合适的受体细胞也可），能在含氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含四环素或含卡那霉素的培养基中生长的为重组质粒2
11．科研人员成功获得植株A和植株B后，再通过杂交及纯合体筛选试验（经过纯合体筛选获得的植株亲本性状能够稳定遗传），进而获得纯合转基因拟南芥植株。
转基因拟南芥植株的优点：因为用相同的启动子，所以当要开花的时候，开花基因会表达，而荧光蛋白基因也会表达，科学家能够通过监控实时荧光图像，监控拟南芥植株的开花过程，操作方便，信息准确
【解析】
分析图1可知，①将目的基因导入质粒；②构建重组Ti质粒；③将重组Ti质粒导入农杆菌细胞；④筛选含重组Ti质粒1的农杆菌；⑤导入受体细胞（农杆菌转化法）；⑥植物组织培养。
6．分析图1可知，EcoRⅠ酶会破坏GFP基因，A、C错误；HindⅢ酶单独切割，不能获得启动子序列，B错误；要获得GFP基因和启动子序列，需要HindⅢ酶和BamHⅠ酶共同切割，D正确。
故选D。
7．根据图1分析可知，通过基因工程获得转基因拟南芥植株A的目的基因是，具有与植物开花基因相同“启动子”的绿色荧光蛋白基因；由⑤过程可知，受体细胞是拟南芥愈伤组织细胞；基因工程步骤④是筛选含重组Ti质粒1的农杆菌。
8．在步骤⑤中，以拟南芥的愈伤组织作受体细胞，是因为愈伤组织的全能性较强，更容易通过组织培养形成转基因植株，叶肉细胞高度分化，全能性不易表达；步骤⑥是将拟南芥愈伤组织通过再分化形成植株A，利用了植物组织培养技术。
9．A、由图1可知，绿色荧光蛋白基因位于质粒1上，Ti质粒本身不具有该基因，A错误；
B、由图2可知，植物开花基因为目的基因，Ti质粒本身不具有该基因，B错误；
C、Ti质粒是独立于细菌拟核之外的小型双链闭环DNA分子，C正确；
D、由过程③可知，Ti质粒的受体细胞应为农杆菌细胞，D正确。
故选CD。
10．当质粒2中插入启动子序列和开花基因后，Tcr基因和Kan基因被破坏，Ampr基因正常，所以可以将重组质粒2导入大肠杆菌，并分别在含氨苄青霉素、四环素、卡那霉素的培养基上培养大肠杆菌，筛选出能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素或含卡那霉素的培养基中生长的，即为重组质粒2。
11．将成功获得的植株A和植株B进行杂交，筛选出后代能够稳定遗传的亲本个体，进而获得纯合转基因拟南芥植株。因为荧光蛋白基因和开花基因用了相同的启动子，所以当拟南芥植株要开花时，荧光蛋白基因和开花基因会一起表达，科学家能够通过监控实时荧光图像，监控拟南芥植株的开花过程，操作方便，信息准确。
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