适用于新教材2024版高考生物一轮总复习第10单元生物技术与工程第50讲基因工程的基本工具与操作程序课件新人教版

这是一份适用于新教材2024版高考生物一轮总复习第10单元生物技术与工程第50讲基因工程的基本工具与操作程序课件新人教版，共60页。PPT课件主要包含了素养目标，内容索引，强基础·增分策略，提能力·精准突破，练高考·衍生训练，特别提醒，2DNA连接酶，2实验步骤，一般要添加Mg2+，基因工程的核心内容等内容，欢迎下载使用。

1 强基础·增分策略
一、重组DNA技术的基本工具1.基因工程的概念理解
2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶(限制酶)
(3)基因进入受体细胞的载体
3.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理
旁栏边角(选择性必修3 P74“拓展应用1”)为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子?提示:细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA,是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,其DNA分子中或不具备这种限制酶的识别序列,或通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。
易错辨析(1)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　×　)(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　×　)(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(　×　)(4)E.cli DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。(　×　)(5)当作载体的质粒DNA分子上应至少含一个限制酶切割位点。(　√　)(6)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中,使之稳定存在并表达。(　√　)
二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取(1)筛选合适的目的基因①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变　受体细胞性状　或获得　预期表达产物　等的基因。主要是指　编码蛋白质　的基因。 ②筛选目的基因的方法:从相关的已知　结构和功能　清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 
(2)利用PCR获取和扩增　目的基因　 ①原理:　DNA半保留复制　。 ②条件:
③过程:PCR过程包括　变性　、复性和　延伸　三步。 
④结果:DNA分子以　指数形式　扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。⑤鉴定:常采用　琼脂糖凝胶电泳　来鉴定PCR的产物。 
2.基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中　稳定存在　,并且可以　遗传　给下一代。 ②使目的基因能够　表达　和发挥作用。 
(2)基因表达载体的组成
(3)基因表达载体的构建过程
提醒:若考虑两两相连,则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况:①目的基因与目的基因的连接;②目的基因与质粒的连接;③质粒与质粒的连接。需筛选出重组质粒。
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
延伸拓展甜玉米与普通玉米相比,甜玉米中可溶性糖向淀粉的转化较慢,含可溶性糖量高,汁多质脆,富含多种维生素。为了使甜玉米更有应用价值,科研人员通过转基因技术培育出了超量表达P蛋白转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中,所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图所示。(说明:强启动子是一段有特殊结构的DNA片段;BamHⅠ、HindⅢ、EcRⅠ、NtⅠ、SacⅠ代表不同的限制酶;T-DNA是农杆菌的Ti质粒上的DNA片段。)
(1)构建超量表达P基因载体,需选用________________限制酶的组合和DNA连接酶。 (2)为了特异性扩增P基因序列,一般要加入的原料为___________________,需根据_______________________设计特异性引物。 (3)经农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织,超量表达P基因会随T-DNA _____________________________,从而获得转基因植物细胞。继而进行植物组织培养,培养能中需加入________________进行筛选,筛选出的愈伤组织再分化形成丛芽,然后在________________培养基上形成根,最终获得多个玉米株系。发现某株系的P蛋白表达量较低,请对该现象作出合理的解释: ________________________________________________ 。 
BamHⅠ和SacⅠ
4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)
P基因两端的碱基序列
整合到玉米细胞染色体DNA上
该株系玉米中可能没有导入目的基因或目的基因未表达
旁栏边角(选择性必修3 P79 旁栏思考改编)PCR可以扩增mRNA吗?利用PCR扩增目的基因时,为什么要用2种不同的引物?提示:不可以,因为PCR是用DNA双链作模板的,不能直接用单链RNA进行PCR,必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再进行PCR。DNA是两条反向平行的双链,而复制时只能从固定的方向(模板链的3'端)开始,所以引物的碱基序列是不同的。
易错辨析(1)用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。(　×　)(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(　×　)(3)将目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。(　√　)(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　√　)(5)应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(　×　)(6)Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　√　)
2 提能力·精准突破
1.与DNA有关的几种酶的比较
2.图解限制酶的选择原则
考向1 结合基因工程工具酶的应用,考查生命观念1.某质粒分子其中一条链的部分核苷酸序列为-CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA-,限制酶EcRⅠ在单链上的识别序列为-GAATTC-。下列叙述正确的是(　　)A.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定位点断开DNAB.用EcRⅠ酶切割该质粒,至少会产生2个片段C.与其互补片段相比,该单链片段中A与T的和所占比例较大D.一个该质粒复制n次,得到的双链都是新合成的质粒有(2n-1)个答案:A
解析:限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,A项正确;质粒是环状的,该质粒只有一个EcRⅠ酶切割位点,用EcRⅠ酶切割该质粒,会产生1个片段,B项错误;与其互补片段相比,该单链片段中的A和T与互补链中的A和T碱基配对,是互补的,它们所占比例一样,C项错误;一个该质粒复制n次,含母链的质粒有2个,其余都是新合成的质粒,得到的双链都是新合成的质粒有(2n-2)个,D项错误。
考向2 结合基因工程载体的应用,考查生命观念2.下图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点,下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述,错误的是(　　)
A.若通过PCR技术提取该目的基因应该选用引物甲和引物丙B.构建基因表达载体,可选用BamHⅠ剪切C.构建基因表达载体时为了防止目的基因和质粒的自身环化,可以选用BclⅠ和HindⅢ剪切D.在导入目的基因的受体细胞中,四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因不能同时表达
答案:B解析:构建基因表达载体时,应至少保留一个完整的标记基因,便于目的基因的检测和筛选,图甲中BamHⅠ同时切割两种标记基因,不能选用BamHⅠ剪切,B项错误。
3.(2022聊城二模)将编码四种不同酶的基因OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR与叶绿体转运肽基因连接,搭载到农杆菌Ti质粒的T-DNA片段构建多基因表达载体,最终在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径,提高了水稻的产量。下列说法错误的是(　　)
A.可用分子杂交技术检测四个基因是否成功导入水稻B.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板C.应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的水稻细胞D.基因表达载体中的四个基因在水稻细胞核内进行转录
答案:B解析:OsGLO1基因的启动子和终止子的方向与其他基因不同,该基因转录的模板链也与其他基因不同,B项错误。
1.目的基因的获取方法(1)利用PCR获取和扩增目的基因。(2)人工合成目的基因①反转录法:主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:
②化学合成法:依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:
(3)从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA,以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
2.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
考向1结合基因工程的操作程序,考查科学思维1.(2022青岛期末)MAP30蛋白存在于苦瓜的果实和种子中。实验表明 MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能,近年来引起了人们的广泛关注。MAP30蛋白基因可作为基因工程中的目的基因,下列叙述错误的是(　　)A.可从苦瓜果实或种子中提取RNA,经逆转录法获取目的基因B.对 PCR 扩增后的产物,一般需要通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定C.检测MAP30蛋白基因是否成功表达,可用抗原—抗体杂交技术D.直接将 MAP30 蛋白基因导入马铃薯受体细胞,可获得转基因幼苗答案:D
解析:若要使目的基因在受体细胞中表达,需要构建基因表达载体,而不能直接将目的基因导入受体细胞,D项错误。
2.(2022威海期末)科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV-16L1蛋白基因,构建了含HPV-16L蛋白基因的表达载体pBI-L1,经根瘤农杆菌介导转化,获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器,生产出了纯度较高的HPV-16L1蛋白。下列说法错误的是(　　)A.构建表达载体pBI-L1时至少需要两种限制酶以防止目的基因与质粒反向连接B.采用根瘤农杆菌介导转化时可对烟草组织进行切割,以便于农杆菌入侵植物组织C.为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织,可向培养基中适当添加赤霉素D.可以用抗原—抗体杂交法检测再生植株是否表达出相应的HPV-16L1蛋白
答案:C解析:构建表达载体pBI-L1时至少需要两种限制酶以防止质粒的自身环化和目的基因与质粒反向连接,A项正确;对烟草组织进行切割,以便农杆菌细胞内的Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的烟草组织细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上,B项正确;为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织,可向培养基中适当添加生长素,C项错误;经培养可获得新性状的再生植株,检测再生植株是否表达出相应的HPV-16L1蛋白,可以用抗原—抗体杂交法,D项正确。
考向2 围绕PCR技术,考查科学思维3.农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环,并以此环为模板,利用PCR技术扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列,以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法错误的是(　　)
A.进行PCR扩增的依据是DNA分子双链复制的原理B.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶C.利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列D.通过与受体细胞的基因组序列比对,可确定T-DNA的插入位置
答案:B解析:PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理,A项正确;进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶,但不需要解旋酶,B项错误;DNA的两条链反向平行,子链从引物的3'端开始延伸,则利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列,C项正确;通过与受体细胞的基因组序列比对,即可确定T-DNA的插入位置,D项正确。
考向1围绕DNA的粗提取与鉴定,考查科学探究1.(2022日照期末)下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述,正确的是(　　)A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤,以保证提取的DNA量B.滤液中加入冷酒精后,用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加C.向含DNA的滤液中加入2 ml/L的NaCl溶液有利于去除杂质D.用二苯胺试剂鉴定DNA时,需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化答案:D
解析:洋葱研磨液用两层纱布过滤,以保证提取的DNA量,A项错误;DNA在冷酒精中的溶解度很低,蛋白质在冷酒精中的溶解度较高,故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理,提纯DNA,但提取量不变,B项错误;向含DNA的滤液中加入0.14 ml/L的NaCl溶液有利于去除杂质,C项错误;在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,用二苯胺试剂鉴定DNA时,需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化,D项正确。
题后点拨DNA的粗提取与鉴定实验中的注意事项
考向2 围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定,考查科学探究2.(2022济南学情检测)DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原理,分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是(　　)A.DNA片段相对分子质量越大,迁移就越慢B.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合,用于分离后DNA片段的检测C.拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提,再用体积分数为70%的冷酒精沉淀抽提DNA片段,从而提高回收率D.新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染
答案:C解析:DNA片段相对分子质量越大,迁移就越慢,相对分子质量越小,迁移速度越快,A项正确;为了便于对分离后的DNA片段进行检测,在凝胶制备中加入核酸染料,能够与DNA分子结合,B项正确;拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提,再用体积分数为95%的冷酒精沉淀抽提DNA片段,从而提高回收率,C项错误;新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染,使得样品中含有病毒,出现假阳性结果,D项正确。
3 练高考·衍生训练
角度1 基因工程的基本工具1.(2021全国高考乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题。(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　　　　　酶切割后的 DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　　　　。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　　　　　;质粒DNA分子上有　　　　　　　　　　　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是　　　　　　　　　　　　　　　。 (4)表达载体含有启动子,启动子是指 　　　　　　　　　。 
答案:(1)EcRⅠ、PstⅠ　EcRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcRⅤ(2)磷酸二酯键(3)自我复制　一个至多个限制酶切割位点　用含有该种抗生素的培养基培养宿主细胞,能存活的细胞含有质粒载体(4)一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位
角度衍生(1)[2019全国高考Ⅰ卷]生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是解旋酶。(　√　)(2)[2019全国高考Ⅰ卷]在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶。(　√　)(3)[2020浙江选考]用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后,出现3个条带,表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置。(　√　)
角度2 基因工程的操作程序2.(2021江苏高考)某小组为研究真菌基因m的功能,构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题。
(1)目的基因的扩增①提取真菌细胞　　　　,经逆转录获得cDNA,进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M,设计引物P2时,不能包含基因m终止密码子的编码序列,否则将导致　　　　　　　　。 ③热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是:先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有　　　　。 A.Taq酶最适催化温度范围为50~60 ℃B.与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物C.两条子链的合成一定都是从5'端向3'端延伸D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合,用特定DNA酶处理形成黏性末端,然后降温以促进　　　　　　　　,形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌,利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及　　　　　　酶等,完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A-m仍能被SmaⅠ切开,则SmaⅠ的酶切位点可能在　　　　　　　　　　　　。 (3)融合蛋白的表达①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母,将其作为受体菌,导入质粒A-m,然后涂布于无尿嘧啶的培养基上,筛选获得目的菌株,其机理是　　　　　　　　　　　　。 ②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签,说明　　　,后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。