还剩52页未读，
继续阅读
所属成套资源：2024届高考生物一轮总复习课件（52份）
成套系列资料，整套一键下载
2024届高考生物一轮总复习第十单元生物技术与工程第35讲基因工程及生物技术的安全性与伦理问题课件
展开
这是一份2024届高考生物一轮总复习第十单元生物技术与工程第35讲基因工程及生物技术的安全性与伦理问题课件，共60页。PPT课件主要包含了2DNA连接酶，3载体，3构建过程，续上表，答案C，2方法步骤，②DNA的电泳鉴定，答案A，答案D，答案B等内容，欢迎下载使用。
第35讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题【课标要求】 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。4.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。5.举例说出日常生活中的转基因产品及影响；中国禁止生殖性克隆人；举例说明生物武器对人类的威胁与伤害。6.活动：DNA的粗提取与鉴定。7.活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。8.活动：搜集文献资料，就“转基因食品是否安全”展开辩论。9.活动：搜集“转基因食品是否安全”及关于设计试管婴儿的资料。
考点一 重组DNA技术的基本工具与基本操作程序
一、重组DNA技术的基本工具1．基因工程的概念
2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。
提醒：①限制酶是一类酶，而不是一种酶。限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。②将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。③限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。④判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
提醒：与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
二、基因工程的基本操作程序1．目的基因的筛选与获取(1)目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。(2)筛选合适的目的基因。①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取方法：人工合成目的基因、利用PCR获取和扩增目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因。(4)利用PCR获取和扩增目的基因。①含义：一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。②原理：DNA半保留复制。③条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶等。
④过程：PCR过程包括变性、复性和延伸三步。
⑤结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)。⑥产物鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。
提醒：①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用。
提醒：启动子≠起始密码子；终止子≠终止密码子①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子均位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
3．将目的基因导入受体细胞(只有该步骤未涉及碱基互补配对现象)
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入非人工操作是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。(3)农杆菌特点。①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。(4)导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能集合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4．目的基因的检测与鉴定
1．基因工程的理论基础
2．限制酶的特点与使用(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(3)为了防止载体或目的基因的末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的末端。
3．标记基因的作用：可用于检测目的基因是否导入受体细胞
4．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
5．与DNA有关的几种酶的比较
6.PCR技术和DNA复制的比较
7．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
8.如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的大肠杆菌有三种：含环状目的基因的大肠杆菌、含重组质粒的大肠杆菌、含质粒的大肠杆菌。(3)筛选方法：将大肠杆菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的大肠杆菌和含质粒的大肠杆菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考向1 围绕基因工程的基本工具，考查科学思维1．(2022·揭阳普宁二中)2020年诺贝尔化学奖被授予“CRISPR/Cas9基因编辑技术”的发明者，以表彰他们在基因组编辑领域的贡献。CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如下图)。回答下列问题：
(1)CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是_________________________________________________________________________________________________________，Cas9蛋白催化断裂的化学键位于______________之间。若采用基因工程的方法获得Cas9蛋白，构建重组质粒需要的酶是__________________________。(2)一般来说，在使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和________(填“相同”或“不同”)的sgRNA进行基因的相关编辑。(3)若将CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是______________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)通过上述介绍，你认为CRISPR/Cas9基因编辑技术在_________________________________________________________________ (写出2点)等方面有广阔的应用前景。
解析：(1)据题意可知，CRISPR复合体中的sgRNA是一条单链向导RNA，主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA，该过程断裂的是位于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键。(2)不同基因的碱基序列不同，根据碱基互补配对原则，在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和不同的sgRNA进行基因的相关编辑。(3)CRISPR/Cas9基因编辑是对目标DNA位点的靶向编辑技术，特异性强，运用CRISPR/Ca9基因编辑技术培育转基因生物的明显优点是：避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
答案：(1)与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA 磷酸和脱氧核糖 限制酶和DNA连接酶(2)不同(3)避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题(4)基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能
考向2 结合PCR技术及其应用，考查科学思维2．(2022·辽宁东北育才学校)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。下图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列分析不正确的是( )
A．第一阶段过程中的产物是依赖引物1、引物2和引物3、引物4扩增的结果B．引物2和引物3上均含有与模板链不能互补的碱基C．PCR过程中需要先加热至90 ℃以上后再冷却至72 ℃左右D．第三阶段需要利用引物1和引物4获得目的基因
解析：由图可知，第一阶段过程中的产物是依赖引物1、引物2和引物3、引物4扩增的结果，A项正确；引物2和引物3分别与DNA的两条链互补，若引物2和引物3完全与模板互补，则引物2和引物3会发生互补，导致引物失效，所以引物2和引物3上均含有与模板链不能互补的碱基，B项正确；变性过程是双螺旋解开的过程，此过程中氢键断裂需通过先加热至90 ℃以上完成，然后再冷却至50 ℃左右使引物与模板形成氢键结合在一起，为子链的延伸做准备，C项错误；第三阶段是子链延伸的过程，根据引物延伸的方向与结合的模板链可知，第三阶段需要利用引物1和引物4延伸子链获得目的基因，D项正确。
3．(2022·浙江卷改编)截至2022年10月，我国在抗击新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻，尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。(1)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。(2)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是________________________________________________________________________________________________。
(3)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________________。
解析：(1)RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。(2)腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。
答案：(1)逆转录 核酸探针(2)抗原 载体 使腺病毒失去复制能力(3)脾 动物血清
考向3 结合基因工程的操作程序及其应用，考查科学探究4．(2022·浙江温州)土壤农杆菌介导转基因植物的培育过程中，为了便于受体细胞的筛选，常将土壤农杆菌中的Ti质粒进行改造，并加入卡那霉素抗性基因(KanR)和β半乳糖苷酶基因(lacZ′)，如图所示。β半乳糖苷酶能催化特殊物质Xgal发生显色反应而使固体培养基上含该基因的菌落呈蓝色，否则呈白色。
回答下列问题：(1)用BseYⅠ切割质粒和含有目的基因的DNA，在DNA连接酶的作用下__________(填“能”或“否”)形成重组质粒，理由是_______________________________________________________________________________________________。(2)为便于筛选，需将农杆菌接种在含______________、Xgal的LB培养基，以去除未转化的细胞，再选择______色菌落，即为所需菌落。这一过程中，切割含目的基因的DNA片段，应选择限制性内切核酸酶________，用于导入重组质粒的农杆菌本身________(填“含”或“不含”)lacZ′基因。(3)为提高重组质粒导入农杆菌的效率，除考虑导入方法、筛选条件、防止污染外，还需考虑的主要因素有___________________________________________________________________________________________________________ (答出2点即可)。
解析：(1)用同一种限制酶Bse YⅠ切割质粒和含有目的基因的DNA，两者含有互补的黏性末端，因此在DNA连接酶的作用下能形成重组质粒。(2)为便于筛选，需将农杆菌接种在含卡那霉素、Xgal的LB培养基。由图可知，这一过程中，切割含目的基因的DNA片段，应选择限制性内切核酸酶BglⅡ，因为该限制酶破坏了Ti质粒上的lacZ′基因，因此选择白色菌落，即为所需菌落。用于导入重组质粒的农杆菌本身不含lacZ′基因。
答案：(1)能 具有互补的黏性末端(2)卡那霉素 白色 BglⅡ 不含(3)农杆菌的感受态、数量(密度)；质粒的大小、质量、浓度、纯度；无机盐浓度
考点二 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定(1)原理。
(3)注意事项。①取材原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。②过滤含DNA的研磨液时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上而损失大量DNA。
提醒：鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验原理。①扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。②电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物鉴定：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
(2)方法步骤。①PCR实验操作步骤。
琼脂糖凝胶制备：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液(一般质量分数为0.8%～1.2%)凝胶板制备：将温热的琼脂糖溶液倒入模具，插入梳子形成加样孔，凝胶溶液完全凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内点样：加电泳缓冲液，然后用微量移液管将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液加入加样孔，一孔加标准参照物电泳：接通电源，设定好电压，一般为1～5 V/cm，进行电泳观察：在紫外灯下观察和照相
提醒：①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。③观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。④电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。⑤在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．比较DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同
2.归纳DNA粗提取中的注意事项(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为实验材料。(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，沿着一个方向搅拌，以免加剧DNA分子的断裂，导致不能形成絮状沉淀。(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入研磨液能防止DNA酶降解DNA；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。
考向1 结合DNA的粗提取和鉴定，考查科学探究1．(2022·广东大湾区联合模拟)在DNA指纹技术研究中认为，DNA中的高度重复序列具有高度可变性，但其高度重复序列中有一小段序列在所有个体中都一样，称为“核心序列”。下图是某刑事案例中女受害者、受害者体内精液和三位怀疑对象的DNA指纹图谱，请根据以上内容和指纹图谱回答下列问题：
(1)指纹图谱就是把“核心序列”串联起来作为探针，与不同个体的DNA进行__________________就会出现各自特有DNA指纹图谱。应用DNA指纹技术，首先需要用____________将待测的样品DNA切成片段，然后用电泳的方法将这些片段按大小分开。(2)提取动物细胞的DNA时需先破碎细胞，常用的方法是________________。为了纯化提取的DNA，可利用DNA在____________中溶解度的不同来去除杂质。在沸水浴的条件下，DNA遇____________会变成蓝色。(3)一滴血、精液或是一根头发中的DNA虽然含量很少，但仍可以进行DNA指纹鉴定，因为在鉴定之前可通过______________获得大量的相同DNA。从上图可以判断出怀疑对象中____________最可能是罪犯。
解析：(1)探针是把“核心序列”串联起来形成的DNA单链，若待测个体的DNA单链能与探针形成杂交条带，则说明受害者体内有待测个体的DNA，该方法称为DNA分子杂交；限制酶能破坏磷酸二酯键，使DNA断裂成小的片段。(2)动物细胞没有细胞壁，常用吸水涨破法破碎细胞；DNA在不同浓度的NaC1溶液中溶解度不同，可以利用此原理来去除杂质；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。(3)从受害者体内分离的精液样品与对象1的吻合度最高，因此对象1最可能是罪犯。
答案：(1)DNA分子杂交 限制酶(2)吸水涨破法 NaC1溶液 二苯胺(3)PCR技术 1
考向2 围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查社会责任2．(2022·福建龙岩一中)VNN1基因(1 542bp)与炎症相关性疾病有关，GFP基因(4 735bp)控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光。某研究小组进行鼠源GFPVNN1重组质粒的构建及其功能研究，回答下列问题：(1)为构建重组质粒，研究小组从数据库查找到VNN1的DNA序列，并设计引物。上游引物：5′AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC3′(下划线为HindⅢ酶切位点)，下游引物：5′GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA3′(下划线为Bam HⅠ酶切位点)，之后进行PCR扩增，PCR的原理是______________________。扩增后的VNN1基因要与含GFP基因的载体连接，需用____________________(填具体酶)切割VNN1基因和含GFP基因的载体，再用____________处理，构建重组质粒。
(2)GFP基因在重组质粒中的作用是________________________________________________________________________________________________________________。用之前相同的限制酶对GFPVNN1重组质粒切割后，进行电泳鉴定时得到如图1所示的部分条带，结果表明________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)IL6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活炎症反应。图2为GFPVNN1重组质粒对细胞分泌IL6的影响，由此说明________________；同时发现与正常组比较，空质粒转染组IL6的表达有轻微升高，造成这种现象的可能原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)首先需用HindⅢ酶和BamHⅠ酶切割VNN1基因和含GFP基因的载体，再用DNA连接酶处理，构建重组质粒。(2)用之前相同的限制酶对GFPVNN1重组质粒切割后，得到的条带中含有大小为1542bp的条带，即VNN1基因(1 542bp)，这说明VNN1基因已经插入到含GFP基因的载体中。(3)从柱状图中看出VNN1组中IL6的浓度增加，说明了VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子IL6；空质粒转染组IL6的表达有轻微升高，可能原因是操作过程中对细胞的损伤(或用到的化学试剂对细胞具有一定的毒性作用)，可以激活相应细胞分泌炎症因子IL6。
答案：(1)DNA双链复制 HindⅢ酶和BamHⅠ酶 DNA连接酶(2)鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来 VNN1基因已经插入到含GFP基因的载体中(3)VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子IL6操作过程中对细胞的损伤(或用到化学试剂对细胞具有一定的毒性作用)，可以激活相应细胞分泌炎症因子IL6
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用(1)在农牧业方面的应用。
从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种
由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响
(2)在医药卫生领域的应用。①对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物。②让哺乳动物批量生产药物。乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
提醒：乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，乳腺生物反应器需是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。③可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。器官移植：用转基因动物作器官移植的供体，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。④成果：生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
(3)在食品工业方面的应用。生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用转基因技术大量生产凝乳酶。
2．蛋白质工程——第二代基因工程，可生产自然界中不存在的蛋白质(1)概念：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(2)操作手段和结果。
(3)基本思路。预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质(4)蛋白质工程应用。①临床上：如研发出速效胰岛素类似物产品。②医药工业方面：如改变干扰素分子上的一个半胱氨酸，以延长干扰素的保存时间等。
③其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。④农业方面：改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用效率，增加粮食产量；设计优良微生物农药；等等。
1．蛋白质工程与基因工程的异同
2.乳腺生物反应器与工程菌的比较
考向1 结合基因工程的应用，考查社会责任1．(2022·辽宁沈阳二中)2020年8月16日，由我国军事医学研究院陈薇院士团队及康希诺生物联合申报的腺病毒载体新冠疫苗被授予专利权，这是我国首个新冠疫苗专利。全面接种新冠疫苗，建立免疫屏障，可有效防止新冠病毒大规模传染。请据题意并结合图1、图2回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，通过其表面的S蛋白与宿主细胞膜表面ACE2受体结合而完成感染。研制疫苗时，通过RTPCR(逆转录—聚合酶链式反应)获取S蛋白基因所需要的酶是______________________________________。据图1分析，应选择的引物是________，其作用是在酶的催化下能从引物的________端开始连接脱氧核苷酸。(2)PCR的产物一般通过________________来鉴定，结果如图2所示。1号泳道为标准(Marker)，2号泳道为阳性对照(提纯的S蛋白基因片段)，3号泳道为实验组。标准(Marker)的实质为不同__________的DNA片段混合物，3号泳道若有杂带出现原因一般可能是___________________________________________________________________________________________________________________________________(至少答出2点)。
(3)腺病毒是一种DNA病毒，该病毒基因组中表达出的E1区蛋白与腺病毒的复制有关而且对宿主细胞的毒性很强。为了提高疫苗的________，避免人体因重组腺病毒增殖而感染，科研中将____________构建的复制缺陷型腺病毒作为运载S蛋白基因的载体制备新冠疫苗。
解析：(1)通过RTPCR(逆转录—聚合酶链式反应)获取S蛋白基因，该技术需要先用逆转录酶催化RNA形成DNA、再利用PCR技术扩增目的基因，PCR技术中需要TaqDNA聚合酶。DNA中羟基端为3′端，游离磷酸端为5′端，且DNA复制时新合成的子链和模板链反向螺旋形成新的DNA，又因为DNA子链从5′端向3′端延伸，则据图1分析，选择的引物是Ⅱ、Ⅲ，引物可以使TaqDNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)鉴定通过PCR技术形成的DNA常用琼脂糖凝胶电泳法。标准(Marker)的实质为不同已知长度的DNA片段混合物，若实验的模板受到污染、引物
的特异性不强、退火温度偏低，则3号泳道会出现杂带。(3)由于该病毒基因组中表达出的E1区蛋白与腺病毒的复制有关而且对宿主细胞的毒性很强，因此为了提高疫苗的安全性，避免人体因重组腺病毒增殖而感染，可将腺病毒的DNA去除E1基因，构建复制缺陷型腺病毒作为运载S蛋白基因的载体制备新冠疫苗。
答案：(1)逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶 Ⅱ、Ⅲ 3′(2)琼脂糖凝胶电泳 已知长度 模板受到污染；引物的特异性不强；退火温度偏低(3)安全性 去除E1基因
考向2 结合蛋白质工程，考查科学思维2．(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________________________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有_____________________________________________________________________________、_______________________________________________________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是____________。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是________________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
答案：(1)氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性(2)从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA双链复制(3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间
考点四 生物技术的安全性与伦理问题
1．转基因产品的安全性(1)转基因成果。
(2)对转基因产品安全性的争论。①争论焦点：在转基因食品的安全性等方面发生激烈的争论。②正确态度：理性看待转基因技术要做到建立在完备的相关科学知识基础之上；看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响；要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。③我国方针：研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。
2．关注生殖性克隆人(1)生殖性克隆和治疗性克隆的比较。
(2)关于生殖性克隆人的争论。
(3)我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。(4)警惕用细胞研究和人类基因组编写计划等新技术研究生殖性克隆人。
3．禁止生物武器(1)生物武器种类。
(2)生物武器特点。①致病性强；传染性强；人易感。②较隐蔽：不易被发现；易传播(如气溶胶)，发病有潜伏期，污染面积大、危害时间长。③易得到：制备容易，花费小。④传染途径多，治疗困难。⑤受自然条件影响大。(3)散布途径：直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布。(4)禁止生物武器。中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
1．转基因生物的优缺点(1)优点：提高粮食产量；减少农药使用，从而减轻环境污染；节约生产成本，降低粮食售价；增加食物营养，提高附加价值；增加食物种类，提升食物品质；促进生产效率，带动相关产业发展。(2)缺点：可能产生新病毒和新的过敏原；可能产生抗除草剂的杂草；可能使疾病的传播跨越物种障碍；可能会损害农作物的生物多样性；可能干扰生态系统的稳定性。
2．试管婴儿和设计试管婴儿的比较
考向 结合生物技术的安全性和伦理问题，考查社会责任1．(2022·山东济南期末改编)20世纪70年代以后，一大批生物技术成果问世，对人类的生产和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大的作用，科学家甚至利用分子遗传学等知识和技术把改造生命的幻想变成现实。但生物技术的发展在造福人类的同时也可能带来潜在的危害。下列有关生物技术的安全性与伦理问题描述正确的是( )A．将目的基因导入叶绿体基因组可以有效地防止基因污染B．经济、文化和伦理道德观念的不同不会影响人们对转基因技术的看法C．生殖性克隆和治疗性克隆的结果本质是相同的，都会面临伦理问题D．人体不会对转基因技术制造的具有超强的传染性和致病性的新型病原体产生免疫反应
解析：因为叶绿体在细胞质里，受精卵中的叶绿体来自卵细胞，精子里没有，植物传粉只传精子，卵子不离开母本，所以将目的基因导入叶绿体基因组可以有效地防止基因污染，A项正确；经济、文化和伦理道德观念的不同会影响人们对转基因技术的看法，B项错误；生殖性克隆会面临伦理问题，C项错误；转基因技术制造的具有超强的传染性和致病性的新型病原体也会引起人体产生免疫反应，D项错误。
2．(2022·广东连州)下列关于转基因生物与安全性的叙述，正确的是( )A．转基因培育的植物，理论上目的基因只存在于特定的组织中B．转基因技术与植物体细胞杂交技术均可打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出杂种新物种C．种植转基因抗虫棉时，常间行种植普通棉花以供害虫取食，其主要目的是保护物种多样性D．转基因花粉中若有毒蛋白或过敏蛋白，则它有通过食物链传递而引发人类食品安全问题的可能
解析：转基因培育的植物，理论上目的基因存在于所有体细胞中，A项错误；转基因技术培育的物种和原来的非转基因生物属于同一物种，B项错误；种植转基因抗虫棉，常间行种植普通棉花是为了降低害虫的抗性基因进化的频率，C项错误。
高考真题体验1.(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A项正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B项错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C项正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D项正确。
2．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RTPCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是____________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的__________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是________。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明_________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明__________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)新冠病毒的遗传物质是RNA，而RTPCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(90～95 ℃)、复性(55～60 ℃)、延伸(70～75 ℃)，故其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为
阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
答案：(1)逆转录酶(反转录酶)(2)特异性核苷酸序列 退火(复性)(3)曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)
3．(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAGP和FLAGP△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________________________________________________________________________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAGP、FLAGP△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAGP和FLAGP△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是_______________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAGP，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAGP，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAGP的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAGP，出现杂交带；④⑤组使用FLAGP△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
答案：(1)两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对 5′端(2)在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变 在EcRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数(3)促进UBC与FLAGP的结合 P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列(4)药物A促进UBC与FLAGP的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的
4．(2022·广东卷)“绿水逶迤去，青山相向开”，大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是______________________________________，终止子的作用是____________________________________。(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是______________________________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于______________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
第35讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题【课标要求】 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。4.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。5.举例说出日常生活中的转基因产品及影响；中国禁止生殖性克隆人；举例说明生物武器对人类的威胁与伤害。6.活动：DNA的粗提取与鉴定。7.活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。8.活动：搜集文献资料，就“转基因食品是否安全”展开辩论。9.活动：搜集“转基因食品是否安全”及关于设计试管婴儿的资料。
考点一 重组DNA技术的基本工具与基本操作程序
一、重组DNA技术的基本工具1．基因工程的概念
2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。
提醒：①限制酶是一类酶，而不是一种酶。限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。②将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。③限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。④判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
提醒：与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
二、基因工程的基本操作程序1．目的基因的筛选与获取(1)目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。(2)筛选合适的目的基因。①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取方法：人工合成目的基因、利用PCR获取和扩增目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因。(4)利用PCR获取和扩增目的基因。①含义：一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。②原理：DNA半保留复制。③条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶等。
④过程：PCR过程包括变性、复性和延伸三步。
⑤结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)。⑥产物鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。
提醒：①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用。
提醒：启动子≠起始密码子；终止子≠终止密码子①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子均位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
3．将目的基因导入受体细胞(只有该步骤未涉及碱基互补配对现象)
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入非人工操作是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。(3)农杆菌特点。①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。(4)导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能集合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4．目的基因的检测与鉴定
1．基因工程的理论基础
2．限制酶的特点与使用(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(3)为了防止载体或目的基因的末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的末端。
3．标记基因的作用：可用于检测目的基因是否导入受体细胞
4．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
5．与DNA有关的几种酶的比较
6.PCR技术和DNA复制的比较
7．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
8.如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的大肠杆菌有三种：含环状目的基因的大肠杆菌、含重组质粒的大肠杆菌、含质粒的大肠杆菌。(3)筛选方法：将大肠杆菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的大肠杆菌和含质粒的大肠杆菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考向1 围绕基因工程的基本工具，考查科学思维1．(2022·揭阳普宁二中)2020年诺贝尔化学奖被授予“CRISPR/Cas9基因编辑技术”的发明者，以表彰他们在基因组编辑领域的贡献。CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如下图)。回答下列问题：
(1)CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是_________________________________________________________________________________________________________，Cas9蛋白催化断裂的化学键位于______________之间。若采用基因工程的方法获得Cas9蛋白，构建重组质粒需要的酶是__________________________。(2)一般来说，在使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和________(填“相同”或“不同”)的sgRNA进行基因的相关编辑。(3)若将CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是______________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)通过上述介绍，你认为CRISPR/Cas9基因编辑技术在_________________________________________________________________ (写出2点)等方面有广阔的应用前景。
解析：(1)据题意可知，CRISPR复合体中的sgRNA是一条单链向导RNA，主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA，该过程断裂的是位于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键。(2)不同基因的碱基序列不同，根据碱基互补配对原则，在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和不同的sgRNA进行基因的相关编辑。(3)CRISPR/Cas9基因编辑是对目标DNA位点的靶向编辑技术，特异性强，运用CRISPR/Ca9基因编辑技术培育转基因生物的明显优点是：避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
答案：(1)与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA 磷酸和脱氧核糖 限制酶和DNA连接酶(2)不同(3)避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题(4)基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能
考向2 结合PCR技术及其应用，考查科学思维2．(2022·辽宁东北育才学校)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。下图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列分析不正确的是( )
A．第一阶段过程中的产物是依赖引物1、引物2和引物3、引物4扩增的结果B．引物2和引物3上均含有与模板链不能互补的碱基C．PCR过程中需要先加热至90 ℃以上后再冷却至72 ℃左右D．第三阶段需要利用引物1和引物4获得目的基因
解析：由图可知，第一阶段过程中的产物是依赖引物1、引物2和引物3、引物4扩增的结果，A项正确；引物2和引物3分别与DNA的两条链互补，若引物2和引物3完全与模板互补，则引物2和引物3会发生互补，导致引物失效，所以引物2和引物3上均含有与模板链不能互补的碱基，B项正确；变性过程是双螺旋解开的过程，此过程中氢键断裂需通过先加热至90 ℃以上完成，然后再冷却至50 ℃左右使引物与模板形成氢键结合在一起，为子链的延伸做准备，C项错误；第三阶段是子链延伸的过程，根据引物延伸的方向与结合的模板链可知，第三阶段需要利用引物1和引物4延伸子链获得目的基因，D项正确。
3．(2022·浙江卷改编)截至2022年10月，我国在抗击新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻，尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。(1)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。(2)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是________________________________________________________________________________________________。
(3)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________________。
解析：(1)RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。(2)腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。
答案：(1)逆转录 核酸探针(2)抗原 载体 使腺病毒失去复制能力(3)脾 动物血清
考向3 结合基因工程的操作程序及其应用，考查科学探究4．(2022·浙江温州)土壤农杆菌介导转基因植物的培育过程中，为了便于受体细胞的筛选，常将土壤农杆菌中的Ti质粒进行改造，并加入卡那霉素抗性基因(KanR)和β半乳糖苷酶基因(lacZ′)，如图所示。β半乳糖苷酶能催化特殊物质Xgal发生显色反应而使固体培养基上含该基因的菌落呈蓝色，否则呈白色。
回答下列问题：(1)用BseYⅠ切割质粒和含有目的基因的DNA，在DNA连接酶的作用下__________(填“能”或“否”)形成重组质粒，理由是_______________________________________________________________________________________________。(2)为便于筛选，需将农杆菌接种在含______________、Xgal的LB培养基，以去除未转化的细胞，再选择______色菌落，即为所需菌落。这一过程中，切割含目的基因的DNA片段，应选择限制性内切核酸酶________，用于导入重组质粒的农杆菌本身________(填“含”或“不含”)lacZ′基因。(3)为提高重组质粒导入农杆菌的效率，除考虑导入方法、筛选条件、防止污染外，还需考虑的主要因素有___________________________________________________________________________________________________________ (答出2点即可)。
解析：(1)用同一种限制酶Bse YⅠ切割质粒和含有目的基因的DNA，两者含有互补的黏性末端，因此在DNA连接酶的作用下能形成重组质粒。(2)为便于筛选，需将农杆菌接种在含卡那霉素、Xgal的LB培养基。由图可知，这一过程中，切割含目的基因的DNA片段，应选择限制性内切核酸酶BglⅡ，因为该限制酶破坏了Ti质粒上的lacZ′基因，因此选择白色菌落，即为所需菌落。用于导入重组质粒的农杆菌本身不含lacZ′基因。
答案：(1)能 具有互补的黏性末端(2)卡那霉素 白色 BglⅡ 不含(3)农杆菌的感受态、数量(密度)；质粒的大小、质量、浓度、纯度；无机盐浓度
考点二 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定(1)原理。
(3)注意事项。①取材原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。②过滤含DNA的研磨液时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上而损失大量DNA。
提醒：鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验原理。①扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。②电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物鉴定：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
(2)方法步骤。①PCR实验操作步骤。
琼脂糖凝胶制备：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液(一般质量分数为0.8%～1.2%)凝胶板制备：将温热的琼脂糖溶液倒入模具，插入梳子形成加样孔，凝胶溶液完全凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内点样：加电泳缓冲液，然后用微量移液管将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液加入加样孔，一孔加标准参照物电泳：接通电源，设定好电压，一般为1～5 V/cm，进行电泳观察：在紫外灯下观察和照相
提醒：①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。③观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。④电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。⑤在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．比较DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同
2.归纳DNA粗提取中的注意事项(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为实验材料。(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，沿着一个方向搅拌，以免加剧DNA分子的断裂，导致不能形成絮状沉淀。(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入研磨液能防止DNA酶降解DNA；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。
考向1 结合DNA的粗提取和鉴定，考查科学探究1．(2022·广东大湾区联合模拟)在DNA指纹技术研究中认为，DNA中的高度重复序列具有高度可变性，但其高度重复序列中有一小段序列在所有个体中都一样，称为“核心序列”。下图是某刑事案例中女受害者、受害者体内精液和三位怀疑对象的DNA指纹图谱，请根据以上内容和指纹图谱回答下列问题：
(1)指纹图谱就是把“核心序列”串联起来作为探针，与不同个体的DNA进行__________________就会出现各自特有DNA指纹图谱。应用DNA指纹技术，首先需要用____________将待测的样品DNA切成片段，然后用电泳的方法将这些片段按大小分开。(2)提取动物细胞的DNA时需先破碎细胞，常用的方法是________________。为了纯化提取的DNA，可利用DNA在____________中溶解度的不同来去除杂质。在沸水浴的条件下，DNA遇____________会变成蓝色。(3)一滴血、精液或是一根头发中的DNA虽然含量很少，但仍可以进行DNA指纹鉴定，因为在鉴定之前可通过______________获得大量的相同DNA。从上图可以判断出怀疑对象中____________最可能是罪犯。
解析：(1)探针是把“核心序列”串联起来形成的DNA单链，若待测个体的DNA单链能与探针形成杂交条带，则说明受害者体内有待测个体的DNA，该方法称为DNA分子杂交；限制酶能破坏磷酸二酯键，使DNA断裂成小的片段。(2)动物细胞没有细胞壁，常用吸水涨破法破碎细胞；DNA在不同浓度的NaC1溶液中溶解度不同，可以利用此原理来去除杂质；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。(3)从受害者体内分离的精液样品与对象1的吻合度最高，因此对象1最可能是罪犯。
答案：(1)DNA分子杂交 限制酶(2)吸水涨破法 NaC1溶液 二苯胺(3)PCR技术 1
考向2 围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查社会责任2．(2022·福建龙岩一中)VNN1基因(1 542bp)与炎症相关性疾病有关，GFP基因(4 735bp)控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光。某研究小组进行鼠源GFPVNN1重组质粒的构建及其功能研究，回答下列问题：(1)为构建重组质粒，研究小组从数据库查找到VNN1的DNA序列，并设计引物。上游引物：5′AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC3′(下划线为HindⅢ酶切位点)，下游引物：5′GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA3′(下划线为Bam HⅠ酶切位点)，之后进行PCR扩增，PCR的原理是______________________。扩增后的VNN1基因要与含GFP基因的载体连接，需用____________________(填具体酶)切割VNN1基因和含GFP基因的载体，再用____________处理，构建重组质粒。
(2)GFP基因在重组质粒中的作用是________________________________________________________________________________________________________________。用之前相同的限制酶对GFPVNN1重组质粒切割后，进行电泳鉴定时得到如图1所示的部分条带，结果表明________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)IL6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活炎症反应。图2为GFPVNN1重组质粒对细胞分泌IL6的影响，由此说明________________；同时发现与正常组比较，空质粒转染组IL6的表达有轻微升高，造成这种现象的可能原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)首先需用HindⅢ酶和BamHⅠ酶切割VNN1基因和含GFP基因的载体，再用DNA连接酶处理，构建重组质粒。(2)用之前相同的限制酶对GFPVNN1重组质粒切割后，得到的条带中含有大小为1542bp的条带，即VNN1基因(1 542bp)，这说明VNN1基因已经插入到含GFP基因的载体中。(3)从柱状图中看出VNN1组中IL6的浓度增加，说明了VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子IL6；空质粒转染组IL6的表达有轻微升高，可能原因是操作过程中对细胞的损伤(或用到的化学试剂对细胞具有一定的毒性作用)，可以激活相应细胞分泌炎症因子IL6。
答案：(1)DNA双链复制 HindⅢ酶和BamHⅠ酶 DNA连接酶(2)鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来 VNN1基因已经插入到含GFP基因的载体中(3)VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子IL6操作过程中对细胞的损伤(或用到化学试剂对细胞具有一定的毒性作用)，可以激活相应细胞分泌炎症因子IL6
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用(1)在农牧业方面的应用。
从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种
由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响
(2)在医药卫生领域的应用。①对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物。②让哺乳动物批量生产药物。乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
提醒：乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，乳腺生物反应器需是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。③可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。器官移植：用转基因动物作器官移植的供体，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。④成果：生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
(3)在食品工业方面的应用。生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用转基因技术大量生产凝乳酶。
2．蛋白质工程——第二代基因工程，可生产自然界中不存在的蛋白质(1)概念：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(2)操作手段和结果。
(3)基本思路。预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质(4)蛋白质工程应用。①临床上：如研发出速效胰岛素类似物产品。②医药工业方面：如改变干扰素分子上的一个半胱氨酸，以延长干扰素的保存时间等。
③其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。④农业方面：改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用效率，增加粮食产量；设计优良微生物农药；等等。
1．蛋白质工程与基因工程的异同
2.乳腺生物反应器与工程菌的比较
考向1 结合基因工程的应用，考查社会责任1．(2022·辽宁沈阳二中)2020年8月16日，由我国军事医学研究院陈薇院士团队及康希诺生物联合申报的腺病毒载体新冠疫苗被授予专利权，这是我国首个新冠疫苗专利。全面接种新冠疫苗，建立免疫屏障，可有效防止新冠病毒大规模传染。请据题意并结合图1、图2回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，通过其表面的S蛋白与宿主细胞膜表面ACE2受体结合而完成感染。研制疫苗时，通过RTPCR(逆转录—聚合酶链式反应)获取S蛋白基因所需要的酶是______________________________________。据图1分析，应选择的引物是________，其作用是在酶的催化下能从引物的________端开始连接脱氧核苷酸。(2)PCR的产物一般通过________________来鉴定，结果如图2所示。1号泳道为标准(Marker)，2号泳道为阳性对照(提纯的S蛋白基因片段)，3号泳道为实验组。标准(Marker)的实质为不同__________的DNA片段混合物，3号泳道若有杂带出现原因一般可能是___________________________________________________________________________________________________________________________________(至少答出2点)。
(3)腺病毒是一种DNA病毒，该病毒基因组中表达出的E1区蛋白与腺病毒的复制有关而且对宿主细胞的毒性很强。为了提高疫苗的________，避免人体因重组腺病毒增殖而感染，科研中将____________构建的复制缺陷型腺病毒作为运载S蛋白基因的载体制备新冠疫苗。
解析：(1)通过RTPCR(逆转录—聚合酶链式反应)获取S蛋白基因，该技术需要先用逆转录酶催化RNA形成DNA、再利用PCR技术扩增目的基因，PCR技术中需要TaqDNA聚合酶。DNA中羟基端为3′端，游离磷酸端为5′端，且DNA复制时新合成的子链和模板链反向螺旋形成新的DNA，又因为DNA子链从5′端向3′端延伸，则据图1分析，选择的引物是Ⅱ、Ⅲ，引物可以使TaqDNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)鉴定通过PCR技术形成的DNA常用琼脂糖凝胶电泳法。标准(Marker)的实质为不同已知长度的DNA片段混合物，若实验的模板受到污染、引物
的特异性不强、退火温度偏低，则3号泳道会出现杂带。(3)由于该病毒基因组中表达出的E1区蛋白与腺病毒的复制有关而且对宿主细胞的毒性很强，因此为了提高疫苗的安全性，避免人体因重组腺病毒增殖而感染，可将腺病毒的DNA去除E1基因，构建复制缺陷型腺病毒作为运载S蛋白基因的载体制备新冠疫苗。
答案：(1)逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶 Ⅱ、Ⅲ 3′(2)琼脂糖凝胶电泳 已知长度 模板受到污染；引物的特异性不强；退火温度偏低(3)安全性 去除E1基因
考向2 结合蛋白质工程，考查科学思维2．(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________________________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有_____________________________________________________________________________、_______________________________________________________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是____________。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是________________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
答案：(1)氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性(2)从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA双链复制(3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间
考点四 生物技术的安全性与伦理问题
1．转基因产品的安全性(1)转基因成果。
(2)对转基因产品安全性的争论。①争论焦点：在转基因食品的安全性等方面发生激烈的争论。②正确态度：理性看待转基因技术要做到建立在完备的相关科学知识基础之上；看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响；要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。③我国方针：研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。
2．关注生殖性克隆人(1)生殖性克隆和治疗性克隆的比较。
(2)关于生殖性克隆人的争论。
(3)我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。(4)警惕用细胞研究和人类基因组编写计划等新技术研究生殖性克隆人。
3．禁止生物武器(1)生物武器种类。
(2)生物武器特点。①致病性强；传染性强；人易感。②较隐蔽：不易被发现；易传播(如气溶胶)，发病有潜伏期，污染面积大、危害时间长。③易得到：制备容易，花费小。④传染途径多，治疗困难。⑤受自然条件影响大。(3)散布途径：直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布。(4)禁止生物武器。中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
1．转基因生物的优缺点(1)优点：提高粮食产量；减少农药使用，从而减轻环境污染；节约生产成本，降低粮食售价；增加食物营养，提高附加价值；增加食物种类，提升食物品质；促进生产效率，带动相关产业发展。(2)缺点：可能产生新病毒和新的过敏原；可能产生抗除草剂的杂草；可能使疾病的传播跨越物种障碍；可能会损害农作物的生物多样性；可能干扰生态系统的稳定性。
2．试管婴儿和设计试管婴儿的比较
考向 结合生物技术的安全性和伦理问题，考查社会责任1．(2022·山东济南期末改编)20世纪70年代以后，一大批生物技术成果问世，对人类的生产和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大的作用，科学家甚至利用分子遗传学等知识和技术把改造生命的幻想变成现实。但生物技术的发展在造福人类的同时也可能带来潜在的危害。下列有关生物技术的安全性与伦理问题描述正确的是( )A．将目的基因导入叶绿体基因组可以有效地防止基因污染B．经济、文化和伦理道德观念的不同不会影响人们对转基因技术的看法C．生殖性克隆和治疗性克隆的结果本质是相同的，都会面临伦理问题D．人体不会对转基因技术制造的具有超强的传染性和致病性的新型病原体产生免疫反应
解析：因为叶绿体在细胞质里，受精卵中的叶绿体来自卵细胞，精子里没有，植物传粉只传精子，卵子不离开母本，所以将目的基因导入叶绿体基因组可以有效地防止基因污染，A项正确；经济、文化和伦理道德观念的不同会影响人们对转基因技术的看法，B项错误；生殖性克隆会面临伦理问题，C项错误；转基因技术制造的具有超强的传染性和致病性的新型病原体也会引起人体产生免疫反应，D项错误。
2．(2022·广东连州)下列关于转基因生物与安全性的叙述，正确的是( )A．转基因培育的植物，理论上目的基因只存在于特定的组织中B．转基因技术与植物体细胞杂交技术均可打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出杂种新物种C．种植转基因抗虫棉时，常间行种植普通棉花以供害虫取食，其主要目的是保护物种多样性D．转基因花粉中若有毒蛋白或过敏蛋白，则它有通过食物链传递而引发人类食品安全问题的可能
解析：转基因培育的植物，理论上目的基因存在于所有体细胞中，A项错误；转基因技术培育的物种和原来的非转基因生物属于同一物种，B项错误；种植转基因抗虫棉，常间行种植普通棉花是为了降低害虫的抗性基因进化的频率，C项错误。
高考真题体验1.(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A项正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B项错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C项正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D项正确。
2．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RTPCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是____________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的__________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是________。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明_________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明__________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)新冠病毒的遗传物质是RNA，而RTPCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(90～95 ℃)、复性(55～60 ℃)、延伸(70～75 ℃)，故其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为
阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
答案：(1)逆转录酶(反转录酶)(2)特异性核苷酸序列 退火(复性)(3)曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)
3．(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAGP和FLAGP△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________________________________________________________________________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAGP、FLAGP△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAGP和FLAGP△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是_______________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAGP，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAGP，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAGP的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAGP，出现杂交带；④⑤组使用FLAGP△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
答案：(1)两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对 5′端(2)在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变 在EcRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数(3)促进UBC与FLAGP的结合 P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列(4)药物A促进UBC与FLAGP的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的
4．(2022·广东卷)“绿水逶迤去，青山相向开”，大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是______________________________________，终止子的作用是____________________________________。(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是______________________________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于______________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
相关课件
备战2025届新高考生物一轮总复习第10单元生物技术与工程第54讲生物技术的安全性与伦理问题课件： 这是一份备战2025届新高考生物一轮总复习第10单元生物技术与工程第54讲生物技术的安全性与伦理问题课件，共35页。PPT课件主要包含了素养目标，转基因成果，氨基酸，生长迅速，营养品质优良，相应病毒，抗除草剂，耐储藏，经济发展水平，安全性等内容，欢迎下载使用。
备战高考生物一轮复习优质课件 第35讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题： 这是一份备战高考生物一轮复习优质课件 第35讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题，共60页。PPT课件主要包含了基因工程的概念，转基因，新的生物类型，分子水平，重组DNA技术，基因重组，②操作水平，⑤操作结果，①操作原理，DNA分子水平等内容，欢迎下载使用。
高中生物高考考点精讲16 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题（课件）： 这是一份高中生物高考考点精讲16 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题（课件），共26页。PPT课件主要包含了基因工程简介，一基因操作的工具，结果产生黏性末端，连接部位磷酸二酯键，第一步提取目的基因，人工合成法，内含子，外显子，过敏原，生物多样性等内容，欢迎下载使用。
