专题16 基因工程-【新题速递】2022届江苏高三生物模拟试卷分类汇编（4月刊）

这是一份专题16 基因工程-【新题速递】2022届江苏高三生物模拟试卷分类汇编（4月刊），共61页。

专题16 基因工程
(2022届江苏省连云港市高三二模) 为探究长日照植物在太空微重力环境下的开花情况，科学家预先将拟南芥的开花基因用绿色荧光蛋白基因标记并将其种子送入“天宫实验室”，进行跟踪观察。下列说法错误的是（ ）
A. 该实验的自变量是日照长短和微重力环境，需要地面同步实验作对照
B. 通过实时荧光图像技术能够在分子水平检测开花基因在微重力下的表达动态
C. 拟南芥是双子叶植物，可以用农杆菌转化法将荧光蛋白导入其种子细胞
D. 太空微重力环境下拟南芥中的生长素不能极性运输，根失去向地生长特性
【答案】ACD
【解析】
【分析】1、单一变量原则即控制唯一变量而排除其他因素的干扰，从而验证唯一变量的作用。
2、荧光显微成像是生命科学领域观察生物体结构的经典方法。这其中，用荧光探针标记，检测和分析单个分子的单分子荧光成像技术，能够帮助科学家们在不破坏生命体正常生理状态的情况下，清晰地观察到单个分子的活动。
3、农杆菌转化法是基因工程中的一种方法，适用于大多数双子叶植物和裸子植物。农杆菌转化法的过程是：目的基因的获取—作为载体的农杆菌转化—农杆菌与植株共培养—转化植株的筛选—转化植株的鉴定。
4、生长素的极性运输不受重力的影响。
【详解】A、该实验的自变量是微重力环境，日照长短是无关变量，在“天宫实验室”和地面实验室里，除了微重力这个自变量之外，其他条件如果相同且适宜，则可以在地面同步实验作对照，A错误；
B、荧光成像的理论基础是，荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度，在一定的范围内与荧光素的量成线性关系。利用特殊的显微镜，就可以利用荧光显微成像来观察荧光图像，即用荧光探针标记，检测和分析单个分子的单分子荧光成像技术，能够帮助科学家们在不破坏生命体正常生理状态的情况下，清晰地观察到单个分子的活动，就能够实现在分子水平检测开花基因在微重力下的表达动态，B正确；
C、农杆菌转化法是基因工程中的一种方法，适用于大多数双子叶植物和裸子植物。农杆菌转化法的过程是：目的基因的获取—作为载体的农杆菌转化—农杆菌与植株共培养—转化植株的筛选—转化植株的鉴定。农杆菌转化法是导入目的基因的一种方法，因此不能用农杆菌转化法将荧光蛋白导入其种子细胞，C错误；
D、生长素的极性运输不受重力的影响，太空微重力环境下，拟南芥中的生长素可以进行极性运输；在太空的微重力条件下，根失去向地生长特性，是因为在太空的微重力条件下，生长素不能横向运输，当根横放时，近地侧和远地侧的生长素含量基本一致，根不会向地生长，D错误。
故选ACD。
(2022届江苏省连云港市高三二模)酯酶结合荧光分析法可对有机磷和氨基甲酸酯类农药进行检测，某研究院利用转基因技术获得一种催化效率高、农药敏感性强的微生物酯酶。

（1）人工合成酯酶基因后通过PCR技术可实现扩增，为该过程提供能量的是______________；还需要设计两种引物，设计引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的______________开始连接脱氧核苷酸。为方便构建重组质粒，需要在引物的5’端设计______________酶的识别序列。某质粒图谱和目的基因的序列如图所示，应选择引物______________（填数字）。（①-④中加粗表示识别序列前的保护碱基，增强上述酶与目的基因的结合。）
①5’-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3’
②5’-CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3’
③5’-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3’
④5’-CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3’
（2）若提取高产酯酶野生菌的基因组DNA，用设计的引物和合适的条件进行PCR，其产物可用______________鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能原因是：______________。解决措施：在目的基因的______________（填“内部”或“上、下游”）重新设计引物进行PCR。
限制酶
识别序列与切割位点
限制酶
识别序列与切割位点
PstⅠ
5’-CTGCA↓G-3’
NdeⅡ
5’-↓GATC-3’
HindⅢ
5’-A↓AGCTT-3’
EcoRⅠ
5’-G↓AATTC-3’
DpnⅡ
5’-↓GATC-3’
AluⅠ
5’-AG↓CT-3’

（3）将PCR产物和质粒用限制酶酶切，酶切产物纯化后，用______________连接，连接产物导入大肠杆菌前需用______________处理大肠杆菌，使其处于感受态。
（4）将目的蛋白与某些标签融合表达形成含标签的融合蛋白，实现增溶、防降解、促进分泌、便于纯化和检测等功能。6×His-Tag（组氨酸标签）含有的咪唑基团选择性地结合在已固定于层析介质的Ni2+、Co2+等金属离子上。高浓度的咪唑缓冲液可以竞争性洗脱结合在介质上的His标签蛋白。据此推测，6×His-Tag的作用之一是______________。
【答案】（1） ①. 4种dNTP ②. 3’端 ③. 限制（性内切核酸） ④. ①③
（2） ①. （琼脂糖凝胶）电泳 ②. 在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短 ③. 上、下游
（3） ①. DNA连接酶 ②. Ca2+（氯化钙溶液）
（4）便于纯化目的蛋白
【解析】
【分析】聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR是利用DNA在体外摄氏95°C高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
【小问1详解】
PCR扩增中提供能量的是dNTP，设计引物的作用是使DNA聚合酶能从引物的3’段开始连接脱氧核苷酸，因为子链的延伸方向是从5’到3’。为方便构建重组质粒，需要在引物的5’端设计限制酶的识别序列，用同种酶切后具有相同的黏性末端，便于连接，子链的延伸方向是从5’到3’，故母链中CTTCTTGTGTTCGACTAG—5’，对应子链为GAAGAACACAAGCTGATC—3’，再加限制酶在5’端加上，故选①③。
【小问2详解】
PCR扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定，若有目的基因以外的杂带存在，可能是在基因组DNA中有其他引物结合的位点或引物特异性不强或引物过短，可通过在目的基因上、下游重新设计引物进行PCR。
【小问3详解】
将PCR产物和质粒用限制酶酶切，酶切产物纯化后，用DNA连接酶，连接产物导入大肠杆菌前需用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于感受态。
【小问4详解】
分析题干信息可知，6×His-Tag可与目的基因形成表达产物融合蛋白（含标签），便于检测，故作用之一是便于纯化目的蛋白。
【点睛】该题考查PCR的相关知识，要求学生能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。
(2022届江苏省南京市、盐城市高三二模)目前人胰岛素是通过基因工程生产的，其纯度高、副作用少，利用大肠杆菌可实现人胰岛素的大规模生产。已知限制性核酸内切酶BamHI与MboI的识别序列和切割位点分别为－G↓GATCC－和－↓GATC－，图1为目的基因与pBR322质粒形成重组质粒的2种情况，图2为抗药性筛选流程。（注：BamHI、Pst I、MboI为限制酶，ori为复制原点，Amp为氨苄青霉素抗性基因，Tet为四环素抗性基因。上标“r”代表抗性；“s”代表敏感）。

（1）获取人的胰岛素基因时，先从胰岛B细胞获取胰岛素基因的mRNA，再通过_________过程获得cDNA，此方法获得的基因与细胞内的胰岛素基因相比在结构上缺少_________等序列。
（2）通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增。实时荧光定量PCR（qPCR）实现了PCR从定性到定量的飞跃。TaqMan探针是qPCR技术中一种常用探针，下图3为TaqMan荧光探针及其作用原理示意图。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时该探针能被Taq酶切割降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增1个DNA分子，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为a，加入b个模板DNA分子（目的基因），通过qPCR进行扩增。反应体系中荧光信号强度（Rn）与扩增次数（n）之间的关系为：Rn＝_________。

（3）据图1中的信息，若胰岛素基因与质粒分别使用MboI和BamHI不同的限制酶切开，插在质粒pBR322的BamHI位点处，在形成重组质粒之后，再重新切下目的基因最好使用_________酶；用限制酶BamHI处理质粒pBR322后得到的分子中共有_________个游离的磷酸基团。
（4）抗药性筛选法实施的前提条件是载体DNA携带抗生素的抗性基因。如果采用图2抗药性筛选流程，则可筛选出的含重组质粒的大肠杆菌的表现型是_________。
（5）除抗药性筛选法外，显色筛选也是常用的方法。很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ'标记基因（图4中甲），其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物（X—gal）水解成蓝色产物。若重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18同时携带Amp'和LacZ'两个标记基因，据图4分析，若想筛选出重组质粒，配制的固体培养基的成分中，除营养物质和琼脂外还需含有_________，经转化、扩增、涂布，图4乙中含重组质粒的是_________（白色/蓝色）菌落。
（6）某研究人员测定受体大肠杆菌的某段基因序列，经测定其蛋白质编码序列（即编码从起始密码子到终止密码子之间的序列）为3002对碱基，请判断对这段序列的测定_________（选填“是”或“否”）存在错误。
【答案】（1） ①. 逆转录 ②. 内含子
（2）ab×（2n-1）
（3） ①. MboI ②. 2
（4）AmprTets，即在含Amp的培养基上能存活，含Tet的培养基上死亡
（5） ①. Amp和X-gal ②. 白色 （6）是
【解析】
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
如果要获取目的基因，可以采取的方法通常包括从细胞中分离和通过化学方法人工合成。如果要想获取人的胰岛素基因，只能用化学方法人工合成，具体的做法是从人体胰岛B细胞中获取胰岛素mRNA，再通过逆转录过程即可获得目的基因。此方法获得的基因与细胞内的胰岛素基因相比在结构上缺少内含子等序列。
【小问2详解】
根据题干信息可知，“荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步”，因此计算时需要去除原来亲代的DNA分子，若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为a，加入的目的基因为b个，反应体系中荧光信号强度（Rn）与扩增次数（n）之间的关系为Rn=ab×（2n-1）。
【小问3详解】
若人胰岛素目的基因与质粒分别使用MboI和BamHⅠ不同的限制酶切开，插在质粒pBR322的BamHⅠ位点处，在形成重组质粒之后，可用MboI限制酶切目的基因，因为BamHI限制酶的识别序列消失了。用限制酶BamHI处理质粒pBR322后环状质粒变为条状，形成2个游离的磷酸基团。
【小问4详解】
由题图可知，插入的目的基因破坏了Tet基因，如果采用图2抗药性筛选流程，则可筛选出的含重组质粒的大肠杆菌在含Amp的培养基上能存活，含Tet的培养基上死亡，即AmprTets。
【小问5详解】
据图4分析，若想筛选出重组质粒，配制的固体培养基上，需含有Amp和X-gal，经转化、扩增、涂布，图4中含重组质粒的是白色菌落。
【小问6详解】
若某段大肠杆菌的基因序列蛋白质编码序列为3002对碱基，则该测定有错误，原因为：原核生物决定每个氨基酸的碱基序列为三联密码，基因的编码碱基序列应为3的整数倍，而3002不是3的整数倍。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生运用所学基础知识，结合所学知识解决相关的生物学问题的能力。
(2022届江苏省如皋市高三一模)24. 科学家将人的生长激素基因与pBR322质粒进行重组，得到的重组质粒导入奶牛受精卵，使其发育为转基因奶牛。pBR322质粒含氨苄青霉素抗性基因（Apt）和四环素抗性基因（Tcr），含5个限制酶切点（PstI、EcoRI、HindIII、BamHI和SalI），如图甲所示。重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组DNA分子导入大肠杆菌并在含抗生素的培养基上培养，观察大肠杆菌的生长、繁殖情况以进行判断，如图乙所示。请回答下列问题：


（1）获取人生长激素基因可以采用逆转录法合成，该过程中所用的mRNA是从______细胞中获得的。以mRNA为模板获取DNA的过程中，需要用到的酶有______。该过程中除需要酶、原料外，还需要加入适量的______。
（2）如果用某种限制酶切割质粒和人的生长激素基因，形成重组质粒，再将重组质粒导入大肠杆菌中，若受体菌在A培养基中不能形成菌落，在B培养基中能形成菌落。则使用的限制酶可能是______，即目的基因插入了______基因中。
（3）为了利用转基因奶牛生产人生长激素，最好让目基因在______细胞中进行表达，在构建基因表达载体时，需要对______进行改造。
（4）将重组DNA分子转入奶牛中的常用方法是______，检测转基因奶牛能否产生人生长激素常用的方法是______。
（5）如果要加速转基因奶牛的繁育速度，采用核移植技术比杂交技术更好，这是因为杂交技术容易造成______。
【答案】（1） ①. 垂体 ②. 逆转录酶、DNA聚合酶 ③. ATP
（2） ①. PstI ②. 氨苄青霉素抗性
（3） ①. 乳腺 ②. 启动子
（4） ①. 显微注射法 ②. 抗原-抗体杂交技术 （5）性状分离
【解析】
【分析】1、逆转录是以mRNA为模板先合成单链DNA，再以该单链DNA为模板在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
生长激素是由垂体分泌的，故若要通过逆转录法合成生长激素基因，需要从垂体细胞中提取mRNA；mRNA→cDNA属于逆转录过程，该过程需要逆转录酶，cDNA复制成为双链DNA的过程需要DNA聚合酶的催化；该过程除需要酶、原料外，还需要加入适量的能量（ATP）等。
【小问2详解】
据图可知，A培养基中含有氨苄青霉素，B培养基中含有四环素，若受体菌在A培养基中不能形成菌落，在B培养基中能形成菌落，说明氨苄青霉素抗性基因被破坏而四环素抗性基因保持完整，即目的基因插入了氨苄青霉素抗性基因（Apt）中；结合题图可推测所用限制酶是PstI。
【小问3详解】
从乳汁中提取目标产品相对方便，为了利用转基因奶牛生产人生长激素，最好让目基因在乳腺细胞中表达；启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动基因的转录，故在构建基因表达载体时，需要对启动子进行改造。
【小问4详解】
将重组DNA分子转入奶牛（动物细胞）中的常用方法是显微注射法；生长激素属于蛋白质类，检测转基因奶牛能否产生人生长激素常用的方法是抗原-抗体杂交法。
【小问5详解】
核移植属于无性繁殖，能较大程度的保存核供体的优良性状，而杂交技术容易发生性状分离。
【点睛】本题主要考查基因工程，意在考查学生对知识的理解和记忆能力以及识图、图文转化的能力。准确判断题图信息是解题关键。
(2022届江苏省苏锡常镇四市高三一模)23. 科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如下图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题。

限制酶
识别序列
ClaⅠ
5′AT↓CGAT3′
BamHⅠ
5′G↓GATCC3′
HindⅢ
5′A↓AGCTT3′
EcoRⅠ
5′G↓AATTC3′
KpnⅠ
5′GGTAC↓C3′
SacⅠ
5′GAGCT↓C3′

（1）以RNA为模板，通过RT-PCR技术可获取P基因。进行RT–PCR时一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）而不是脱氧核苷酸，其原因是_______________，同时需加入的酶有_______________。为了特异性扩增P基因序列，需根据_______________设计特异性引物。
（2）在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是_______________和_______________，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T-DNA的_______________特性，最终使P基因_______________。
（3）将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入_______________，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。
（4）对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有_______________。
【答案】（1） ①. dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料(或脱氧核苷酸只能作为原料而不能提供能量) ②. 逆转录酶和 Tag酶 ③. P基因两端的碱基序列
（2） ①. BamHI ②. Sac I ③. 可转移 ④. 整合到玉米细胞染色体上
（3）潮霉素 （4）基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但P基因保持沉默，不能有效表达
【解析】
【分析】1、PCR反应进行的条件：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
2、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。
【小问1详解】
多聚酶链式反应简称PCR技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异DNA片段的技术，需要能量和原料等，dNTP（dATP， dTTP， dGTP， dCTP） 能为子链延伸过程提供能量和原料，因此进行RT–PCR时一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）。以RNA为模板获取P基因属于逆转录过程，需要逆转录酶，PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶，即Tag酶。引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，为了特异性扩增P基因序列，需根据P基因两端的碱基序列设计特异性引物。
【小问2详解】
在构建基因表达载体时，要想使P基因在玉米植株中超量表达，切割目的基因时需要把强启动子和P基因连在一起切割下来，因此需要用到BamHI切割，另一种酶可以用KpnⅠ或者SacⅠ，在质粒中，KpnⅠ识别序列在BamHI识别序列的左侧，终止子在右侧，如果用KpnⅠ切割，目的基因和质粒连接后，目的基因不在启动子和终止子之间，将来无法转录，因此在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是BamHI和Sac I。T-DNA是Ti质粒上的一个片段。利用农杆菌等微生物可将人工合成的目的基因（P基因）片段通过T-DNA载体转移到受体植物（玉米细胞）的基因组中，是基因工程的重要技术手段。
【小问3详解】
据图可知，利用Ti质粒的T-DNA可将目的基因（P基因）转移到玉米细胞，T-DNA中含有标记基因潮霉素抗性基因，标记基因的作用检测受体细胞中是否含有目的基因，因此培养基中需加入潮霉素，能在此环境中生存的玉米即为转基因玉米。
【小问4详解】
基因能控制蛋白质的合成，该过程包括转录和翻译。些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达等。
【点睛】本题考查PCR技术和基因工程的相关知识，意在考查学生能从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论的能力。
(2022届江苏省苏州市高新区一中高三一模)24. 中国甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因（PDC）密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员构建了质粒A和质粒G（如图1、图2所示），利用酵母菌进行了相关实验探究。

（1）启动子位于基因首端，是__________的位点，启动子区域还存在着许多调控蛋白的结合位点，可影响基因的转录水平。PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在__________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行_________。
（2）利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导代谢缺陷型酵母菌，用不含______的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H。质粒G上的AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，因此需获得待测蛋白与AD蛋白的融合蛋白用于后续筛选。科研人员从中国甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种_________与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点_______。（填序号1～5）作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
（3）重组酵母Y187与Y1H能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图3阐述作出该推测的理由________。
（4）筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于___________工程，该工程的起点是____________。
【答案】 ①. RNA聚合酶识别和结合 ②. DNA连接酶 ③. PCR ④. 尿嘧啶 ⑤. cDNA ⑥. 2 ⑦. 接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性 ⑧. 蛋白质 ⑨. 预期蛋白质的功能
【解析】
【分析】1、基因工程的工具：限制酶、DNA连接酶。
2、基因工程的步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，直接决定转录起始。该操作为目的基因和运载体的酶切和连接，限制酶切割后需要在DNA连接酶的作用下连接；已知接头片段连接在PDC基因的上游，且已知序列信息，则可以按照PDC基因启动子上游的接头片段与PDC基因编码序列设计引物进行PCR扩增。
（2）由质粒A的图谱可知带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则在选择培养基配制时不加尿嘧啶。从中国甜柿中提取的RNA可以通过逆转录形成各种cDNA，将各种cDNA片段与质粒G连接后导入酵母菌，插入时不能破坏其他蛋白质基因的表达，而且需要插入到启动子和终止子之间才能保证表达，因此选择2作为cDNA的插入位点。
（3）依据题干，重组酵母Y187与Y1H接合子应同时含有质粒A、质粒G，则接合子有质粒A为含有PDC基因、金担子素抗性基因的质粒；质粒G为可正常表达AD蛋白、待测蛋白的质粒，接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，则AD蛋白携带的待测蛋白靠近PDC基因启动子，激活PDC基因的转录，并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性。
（4）筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于蛋白质工程，蛋白质工程的设计流程为预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找出相对应的脱氧核苷酸序列（基因），所以起点是预期蛋白质的功能。
【点睛】本题考查到了基因工程的细节内容，不仅要有基础知识的储备，还要有获取信息的能力和表达分析能力。题目作答过程中一定要根据题意来回答，不能抛开题目。
(2022届江苏省新高考基地学校高三模拟联考)24. 甜玉米与普通玉米相比，甜玉米中可溶性糖向淀粉的转化较慢含可溶性糖量高，汁多质脆，富含多种维生素。为了使甜玉米更富有生产应用价值，科研人员通过转基因技术培育出了超量表达P蛋白转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示，P蛋白在玉米株系的表达量如图2所示。回答下列问题：

（1）强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用________酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。TDNA在该实验中的作用是________。
（2）将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入________进行筛选，筛选出的愈伤组织________形成丛芽，最终获得多个玉米株系a1、a2、a3、a4。通过对a1、a2、a3、a4四株甜玉米株系的蛋白质表达量进行测定结果如图2，其中a4株系P蛋白表达量较低的原因可能是________。

（3） 科研人员将野生型玉米和a1株系玉米在甲、乙两种条件下进行种植，一段时间后，测量地上部分鲜重，获得相对生物量如图3所示。实验中的自变量是__________________。根据实验结果，从光合作用的角度分析其原因是________。
（4）为了进一步提高甜玉米中淀粉的含量，科研人员提出通过降低淀粉酶合成有关基因的表达实现生产目标。研究人员研究发现吗啉反义寡核苷酸是一种RNA剪接抑制剂，将其注入植物细胞内会使基因表达受阻，科研人员将吗啉反义寡核苷酸导入玉米的受精卵中起到明显效果。针对它的具体作用，科研人员提出以下假说：
假说1：导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪。
假说2：导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。

为了验证上述假说，分别从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取________，逆转录形成cDNA。若假说1成立，使用右图所示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为________（填字母）。
A． 实验组有目的条带　 B． 实验组无目的条带
C． 对照组有目的条带　 D． 对照组无目的条带
若要证明假说2成立，需要选择如图所示引物________进行PCR。
【答案】 ①. RNA聚合酶 ②. BamHⅠ和SacⅠ ③. 将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上 ④. 潮霉素 ⑤. 再分化 ⑥. a4株系玉米中可能没有导入目的基因或目的基因未表达 ⑦. CO2浓度和植株类型 ⑧. 干旱条件下，a1株系转基因玉米CO2的利用率更高，光合效率更高 ⑨. 总RNA ⑩. AD ⑪. 3和4
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）RNA聚合酶与DNA的启动子结合，驱动基因的转录。首先P基因和Ti质粒需要相同的限制酶切位点，其次，BamHⅠ后面有强启动子不能丢弃，EcoRⅠ和NOtI限制酶会破坏目的基因，因此选择BamHⅠ和SacⅠ限制酶的组合。T-DNA是可转移的DNA，T-DNA可将强启动子和X基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上，随着玉米染色体DNA的复制而复制，从而使目的基因在受体细胞中稳定的保存。
（2）农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，重组质粒中有潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，但植物细胞能表现出对潮霉素的抗性，因此，培养基中需加入潮霉素进行筛选，并以此为特性进行筛选，将筛选出的愈伤组织经过再分化（细胞分化）形成丛芽，从而获得多个转基因玉米株系。a4株与野生型的X蛋白表达量基本相同，可能原因是a4株系玉米中导入目的基因或目的基因未表达。
（3）由图3可知，实验二的自变量是CO2浓度和植株类型。实验结果表明，在干旱条件和不同CO2浓度下，a1株系玉米的相对生物量均比野生型玉米更高，从光合作用的角度分析，其原因是：干旱条件下，与野生型玉米相比，a1株系玉米超量表达P蛋白，对水分和CO2的利用率更高，光合效率更高。
（4）针对吗啉反义寡核苷酸是一种RNA剪接抑制剂，提出假说1和假说2，为验证上述假说，可分别从受精后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA，逆转录形成cDNA。若假说1成立，即实验组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去，对照组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去，使用上图所示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为实验组有目的条带，对照组无目的条带，即AD正确。若要证明假说2成立，即RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切下去，即选择图示引物3和4进行PCR可得到电泳条带。
【点睛】熟知基因工程的操作流程及其相关原理是解答本题的关键，能正确图中的信息并能结合所学正确作答是解答本题的另一关键，基因工程的应用也是本题的考查点。
(2022届江苏省扬州市高三3月调研) 端粒是真核生物线性染色体末端的一段复合结构，端粒DNA会随细胞分裂而缩短（如图），直到细胞不能再分裂。相关叙述错误的是（ ）

A. 组成端粒的主要成分是DNA和蛋白质
B. 子链5'端引物水解后不能补齐，导致端粒DNA缩短
C. 染色体复制后，每条染色体的4个端粒都缩短
D. 可通过修复缩短的端粒DNA，延长细胞寿命
【答案】C
【解析】
【分析】1、癌细胞的主要特征：失去接触抑制，能无限增殖；细胞形态结构发生显著改变；细胞表面发生变化，细胞膜上的糖蛋白等物质减少，细胞间的黏着性降低，细胞易扩散转移。
2、端粒酶能结合到端粒子上，以自身的RNA为模板合成端粒子DNA的一条链，可见端粒酶是一种逆转录酶。
3、端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，实质上是一重复序列，作用是保持染色体的完整性。细胞分裂一次，端粒就缩短一点，所以端粒其长度反映细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。
【详解】A、端粒是真核生物线性染色体末端的一段复合结构，所以组成端粒的主要成分是DNA和蛋白质，A正确；
B、DNA的合成必需有引物才可以，但是DNA合成后引物需要被切除，所以子链5'端引物水解后不能补齐，导致端粒DNA缩短，B正确；
C、分析图示可知，染色体复制后，只是新合成的DNA链缩短了，并不是所有端粒都缩短，C错误；
D、可通过修复缩短的端粒DNA，使细胞能够继续分裂，延长细胞寿命，D正确。
故选C。
(2022届江苏省扬州市高三3月调研) 23. 科研人员通过敲除里氏木霉基因组中去乙酰化酶基因（HDAC），探究组蛋白乙酰化对纤维素酶基因表达的影响，其主要过程如下图。请据图回答问题。

（1）PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入_____。在最后一个循环结束后通常还需要维持72℃7min，其目的是_____。
（2）引物设计是PCR的关键，本研究中引物R1的5'端添加与引物Fc互补的序列，其目的是_____。在PCR5中加入的引物是_____。
（3）在原生质体转化过程中，加人适量的CaCl2和PEG溶液，其目的是_____。涂布时，涂布器用_____法灭菌后将原生质体接种到含_____的固体培养基上筛选。
（4）为探究敲除基因HDAG后对纤维素酶基因（CBHI、EGLI）和纤维素酶基因激活因子基因XYR1转录的影响，研究中先提取_____，再利用荧光RT-PCR技术检测，结果如下图。依据结果可以得出的结论是_____。

【答案】（1） ①. Taq酶、dNTP（、缓冲液、Mg2+）等 ②. 使子链充分延伸（或充分反应，获得更多的完整目的片段，或获得更多的完整目的片段）
（2） ①. 便于H1和GR拼接（便于PCR4时形成H1-GR融合基因） ②. R2和FG
（3） ①. 促进外源DNA分子进入原生质体（或使原生质体变成感受态） ②. 灼烧灭菌（或酒精引燃） ③. 新霉素
（4） ①. （培养到第5天的）两类菌株细胞的总RNA（或总RNA） ②. 敲除基因HDAC使细胞中组蛋白去乙酰化酶缺乏，细胞中组蛋白乙酰化程度高，可以显著提高纤维素酶基因的表达
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
PCR反应体系中含有缓冲液、模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物和Taq酶。为了使子链充分延伸（或充分反应，获得更多的完整目的片段，或获得更多的完整目的片段）在最后一个循环结束后通常还需要维持72℃7min。
【小问2详解】
为了便于H1和GR拼接（便于PCR4时形成H1-GR融合基因），引物R1的5'端添加与引物Fc互补的序列，引物R2和FG进行PCR5才能敲除乙酰化酶基因（HDAC）。
【小问3详解】
CaCl2和PEG溶液能促进外源DNA分子进入原生质体（或使原生质体变成感受态），所以在原生质体转化过程中，加人适量的CaCl2和PEG溶液。涂布时，涂布器用灼烧灭菌（或酒精引燃）法灭菌后将原生质体接种到含新霉素的固体培养基上筛选，因为重组载体含有新霉素抗性基因。
【小问4详解】
通过提取（培养到第5天的）两类菌株细胞的总RNA（或总RNA），来研究敲除基因HDAG后对纤维素酶基因（CBHI、EGLI）和纤维素酶基因激活因子基因XYR1转录的影响。据图分析可知，敲除基因HDAC使细胞中组蛋白去乙酰化酶缺乏，细胞中组蛋白乙酰化程度高，可以显著提高纤维素酶基因的表达。
【点睛】本题主要考查基因工程的相关知识，要求考生能掌握基因工程的基本工具和操作步骤，明确PCR技术的原理的方法，理清图示过程，并能从图示中获取与目的基因、载体相关的有效信息是解答本题的关键。
(江苏省南京师大附中2021-2022学年高三下学期开学考试)14. 囊性纤维病的诊断阵列是表面结合有单链DNA探针的特殊滤纸（其中“0”处放置正常基因的探针，“1～10”处放置不同突变基因的探针）。将#1～#3 待测个体 DNA 用有色分子标记，然后将诊断阵列浸泡在溶解有单链标记DNA 的溶液中，检测结果如下图所示。下列叙述正确的是（ ）

A. 诊断阵列可应用于产前诊断中染色体的筛查
B. 若#2与#3婚配，则后代携有突变基因的概率为100%
C. 诊断阵列上放置不同病毒的基因探针可诊断人体感染病毒的遗传物质类型
D. 将标记的待测双链DNA 分子直接与诊断阵列混合后即可完成诊断
【答案】B
【解析】
【分析】1、囊性纤维病是一种常染色体隐性遗传病，若正常基因用“A” 表示，则图中“1~10”对应的致病基因可表示为“a1~a10” 。
2、根据DNA探针的使用原理，结合图像可推知： #1的基因型是AA， #2的基因型是Aa4，#3的基因型是a2a4。
【详解】A、囊性纤维病是基因突变引起的疾病，所以诊断阵列不能用于染色体的筛查，A错误；
B、由分析可知，#2的基因型是Aa4，#3的基因型是a2a4，则后代的基因型为Aa2、Aa4、a2a4、a4a4，即携有突变基因的概率为100%，B正确；
C、若将诊断阵列上放置不同病毒的基因探针，根据碱基互补配对原则，可诊断病毒的类型，但是不能诊断病毒的遗传物质类型，即不能诊断出是DNA病毒还是RNA病毒，C错误；
D、DNA分子杂交的原理是利用碱基互补配对原则，与单链DNA探针特异性的结合，所以要将待测双链DNA分子加热，形成单链DNA分子才可以与诊断阵列混合后即可完成诊断，D错误。
故选B。
(江苏省南京师大附中2021-2022学年高三下学期开学考试)19. 载体是基因工程中携带外源 DNA 片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正确的是（ ）

A. 重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体
B. 载体A和载体 B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C. 必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间
D. 培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
【答案】AB
【解析】
【分析】分析题图：图中重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体。
【详解】A、重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A正确；
B、作为运载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点(便于目的基因的插入)、复制原点(便于目的基因的扩增)及标记基因(便于筛选含有目的基因的受体细胞)等，因此载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确；
C、培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A 的启动子和终止子之间，C错误；
D、培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D错误。
故选AB。
(江苏省南京师大附中2021-2022学年高三下学期开学考试)24. 人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后， 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是________，在 R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程具体需要________种酶，它们分别是________。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是__________ 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，F7与R扩增产物的受体细胞不再有荧光。若基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于________，理由是_______。
【答案】（1） ①. SalⅠ ②. EcoRⅠ ③. 6（六） ④. Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶
（2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
（3） ①. 引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 ②. 根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
【解析】
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、限制酶选择原则：(1)根据目的基因两端的限制酶识别和切割位点确定限制酶种类具体原则：应选择切点位于目的基因两端的，不能位于目的基因内部，防止破坏目的基因，同时为避免目的基因和质粒自身环化或随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。(2)根据质粒特点确定限制酶种类具体原则：①保证切割的黏性末端与目的基因的相同，以便两者能够连接。②保证切割后的质粒至少保留一个标记基因，以便进行筛选；保留复制原点，以便在受体细胞中维持稳定和表达；若题图中已标出启动子、终止子和T-DNA片段的位置，则切点应位于启动子和终止子之间，或位于T-DNA片段中。
【小问1详解】
观察载体的部分结构的图示，荧光蛋白基因的左侧为终止子，为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧，而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切点，分别是Mun I、EcoR I和Xho I限制酶的切点，但因为用EcoR I会破坏荧光蛋白基因，所以只能用Mun I和Xho I限制酶切割，扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换位于Mun I和Xho I限制酶切割位点之间的片段，并能与左侧的荧光蛋白基因片段和右侧的P片段连接起来。由于F1~F7中有Xho I限制酶切割位点，所以需寻找能代替Xho I限制酶，且切割后的产物能与Xho I限制酶切割后的产物连接的限制酶，而Sal I限制酶就符合这一要求，所以在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是Sal I ；而调控序列及启动子中含有Mun I的切割位点，所以需寻找能代替Mun I限制酶，且切割后的产物能与Mun I限制酶切割后的产物连接的限制酶，而EcoR I限制酶就符合这一要求；所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR I。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要Taq酶、Sal I、EcoR I、Xho I、Mun I和DNA连接酶，共6种酶。
【小问2详解】
将构建载体导入除去BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含F1 ~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，说明F1 ~F6与R扩增产物含完整的启动子，荧光蛋白基因表达；含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，说明F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不能表达。
【小问3详解】
向培养液中添加适量的雌激素，雌激素能诱导启动子发挥作用。构建的载体含有 BCL11A 基因，导入构建载体的受体细胞能合成 BCL11A 蛋白。含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，说明F1~F4与R扩增产物上均有 BCL11A 蛋白的结合位点(调控启动子，荧光蛋白基因不表达)，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，说明F5~F6与R扩增产物上均无结合位点(启动子完整，荧光蛋白基因能表达)，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识点，要求考生掌握基因表达载体的构建过程，掌握目的基因的检测与鉴定原理，并能结合题意进行分析作答，难度较大。
(江苏省南京市金陵中学2021-2022学年高三3月学情调研)19. 荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当 Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。相关叙述错误的是（ ）

A. 引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B. Taq酶催化子链从3'端向5'端延伸，需dNTP作为原料
C. 若某次PCR反应共产生52个等长DNA，则需加入6个荧光探针
D. 反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
【答案】BC
【解析】
【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；
B、根据图示中引物延伸的方向可以确定，Taq酶可以催化子链沿着5’→3’方向延伸，需dNTP作为原料，B错误；
C、TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，若某次PCR反应共产生52个等长的DNA，则至少扩增六次，其余为不等长的DNA，根据每扩增一条链就有一个荧光分子生成，则需加入26=64个荧光探针，C错误；
D、题干中提出“加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，且加入的原料具有荧光标记，故“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，D正确。
故选BC。
(江苏省南京市金陵中学2021-2022学年高三3月学情调研)24. 采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为______。
（2）利用下图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_______酶切割质粒，酶切后的载体和目的基因片段，通过______酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞，应在筛选平板培养基添加_______，从平板上长出的菌落中提取质粒利用Sau3AI进行酶切，最多可以得到______种大小不同的DNA片段。

限制酶
BamHⅠ
XmaⅠ
BclⅠ
SmaⅠ
Sau3AⅠ
识别序列及切割位点
-G↓GATCC-
-C↓CCGGG-
-T↓GATCA-
-CCC↓GGG-
-↓GATC-

（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是______。研究者进一步获得了转YCF1基因的雄性不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的______（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的______（部位）进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。

（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是___________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________。
【答案】（1）基因组文库
（2） ①. Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ限制酶 ②. DNA 连接
③. 四环素和氨苄青霉素
④. 1

（3） ①. 农杆菌转化法
②. 避免目的基因在自然界中的扩散
（4） ①. 耐性 ②. 茎、叶
（5） ①. YCFI 可通过主动运输将 Cd 离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 ②. 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物具有优势
【解析】
【分析】基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA 片段克隆到某种载体上而形成的集合。基因组文库根据DNA 来源又分为核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。据图 1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因植株的茎、叶中 Cd 含量高于野生型。
【小问1详解】
当基因未知，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为基因组文库。
【小问2详解】
质粒是环状DNA，可以用限制性核酸内切酶切割，结合目的基因的平末端和-CTAG粘性末端可知，质粒上应用SmaⅠ和BclⅠ进行酶切，以形成平末端和-GATC的互补粘性末端，这样酶切后的质粒可以和图示目的基因进行连接；DNA连接酶可以使载体和目的基因连接，形成重组质粒；为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞，应在筛选平板培养基添加四环素和氨苄青霉素，以筛选重组质粒；重组质粒为环状，且含有1个Sau3AⅠ的酶切位点（-↓GATC-），因此若用Sau3AI进行酶切，最多可以得到1种大小不同的DNA片段。
【小问3详解】
对于植物而言，将目的基因转入植物细胞，常用农杆菌转化法；雄性不育杨树株系，其花粉对其它植株没有干扰，因此可以避免目的基因在自然界中的扩散。
【小问4详解】
据图1可知，与野生型植株相比，转基因植株的地下部、地上部、整个植株均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2可知，转基因植株茎、叶中的Cd含量比野生型的高很多，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
【小问5详解】
YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植物吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境；相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的 Cd，木材也方便运输、利用，作为 Cd 污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。
(江苏省南京市六校联合体2021-2022学年高三下学期期初调研测试)24. 抗体分子含有两条短肽和两条长肽链，科研人员将小鼠编码抗体（抗禽流感病毒HA抗原）可变区的基因片段与人编码抗体恒定区的基因片段整合，构建图1所示表达载体（HindⅢ等表示不同限制酶的切割位点，EcoRV识别序列和切割位点是GAT↓ATC），导入中国仓鼠卵巢细胞后，筛选能够稳定表达的细胞株，成功获得大量嵌合抗体（图2）。请根据资料回答下列问题：

（1）为构建人鼠嵌合抗体基因表达载体，需要对编码抗体不同片段的基因进行重组，为此需从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取________，经逆转录得到________用于PCR扩增，并分别与人抗体的恒定区DNA序列拼接。
（2）在PCR反应体系中需加入模板、________、Taq酶、引物、缓冲液等，扩增过程中高温处理的目的是________。若利用PCR技术扩增某基因片段时消耗了126个引物分子，则该过程扩增了________次。
（3）图1所示表达载体中除标注出的结构外还必须有________，图中①是________识别和结合的部位。构建该基因表达载体时，先将人抗体的长链、短链基因部分序列分别与相应鼠抗体的可变区序列整合后插入到两个启动子的下游，这过程需要用到多种限制酶，如获得鼠抗体长链可变区基因用________酶切；图中⑤和⑥用________（填“T4DNA”或“E·coliDNA”）连接酶连接。
（4）将重组质粒导人中国仓鼠卵巢细胞后，可采用________技术检验基因是否成功转录。通过基因工程技术成功表达并组装出有生物学活性的嵌合抗体，该嵌合抗体的优点是________。
【答案】（1） ①. 鼠抗体mRNA（或mRNA或鼠抗体可变区mRNA） ②. 鼠抗体cDNA（或cDNA或鼠抗体可变区cDNA）
（2） ①. 4种脱氧核苷酸（4种dNTP） ②. 使DNA变性（使DNA两条链分开、获得DNA单链） ③. 6
（3） ①. 复制原点 ②. RNA聚合酶 ③. HindIII和KpnI ④. T4DNA
（4） ①. 分子杂交 ②. 减少发生免疫排斥反应
【解析】
【分析】基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定高效地表达。为了实现基因工程的目标，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获得、重组DNA的形成，重组DNA导入受体细胞也称（宿主）细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
小问1详解】
基因工程的第一步即是从目标个体中提取目的基因，获得目的基因，可以通过mRNA逆转录得到相应的DNA；从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取鼠抗体mRNA（或mRNA、鼠抗体可变区mRNA），经逆转录得到鼠抗体cDNA（或cDNA、鼠抗体可变区cDNA）用于PCR扩增。
【小问2详解】
PCR是体外进行DNA复制的过程，在PCR反应体系中需加入模板、4种脱氧核苷酸（4种dNTP）、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、引物及缓冲液等；高温处理，是DNA 变性，以利于DNA复制的正常进行，温度降低后，可复性；第一次复制需要2个引物，经复制后得4个，消耗2个；第二次复制需要4个引物，经复制后得8个，消耗4个；以此类推2+4+8+16+32+64=126，即进行了6次扩增。
小问3详解】
构建表达载体时，质粒除了图示结构外还需有复制原点；由图可知，从①启动子，说明①是RNA聚合酶结合位点，可以驱动相关基因转录；又图可知，③为鼠长链可变区基因，因此将鼠抗体长链基因经HindⅢ和KpnⅠ双酶切，以获得相应的黏性末端。⑤和⑥经EcoRV切开，为粘性末端，用T4DNA连接酶进行连接。
【小问4详解】
将重组质粒导人中国仓鼠卵巢细胞后，可采用分子杂交技术检验基因是否成功转录，根据碱基互补配对原理，将特定序列的DNA单链与转录成功的mRNA杂交。鼠抗体注射到人体会引起免疫应答，通过基因工程技术成功表达并组装出有生物学活性的嵌合抗体，减少发生免疫排斥反应的可能。
【点睛】本题以图片信息的形式考查嵌合抗体的制备过程，同时与传统的抗体相比较，要求学生有一定的分析推理能力。
(江苏省南通市海门中学2021-2022学年高三下学期期初考试)23. 乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的两个关键酶。利用反义DNA技术（原理如图1），可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点，下图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义表达载体的结构示意图。


（1）图2中的2A11为特异性启动子，则该2A11应在番茄的________（器官）中启动基因的转录。从该器官中提取________为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，以进行拼接构成融合基因。
（2）合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamH I和EcoR I的酶切位点，ACC合成酶基因两端含Kpn I和Sau3A I的酶切位点，这四种限制酶及其识别序列和切割位点如下图：
限制性核酸内切酶
识别序列和切割位点
限制性核酸内切酶
识别序列和切割位点
BamH I
G↓GATCC
Kpn I
GGTAC↓C
EcoR I
G↓AATTC
Sau3A I
↓GATC
先用限制酶________分别对ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因进行切割后，再将它们拼接成融合基因，相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶________进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。载体上卡那霉素抗性基因的作用是________。
（3）为了获得耐运储存、宜储存的番茄，应将融合基因________（填“正向”或“反向”）插入启动子2A11的下游，原因是________，从而抑制乙烯的合成。在检测该融合基因是否整合到番茄植株的染色体DNA上时，________（填“能”或“不能”）用放射性物质标记的ACC合成酶基因片段做探针进行检测，理由是________。
【答案】（1） ①. 果实 ②. （总）RNA
（2） ①. BamH1和Sau3AI ②. EcoRI和KpnI ③. 便于重组DNA的筛选
（3） ①. 反向 ②. 只有反向插入，转录出的mRNA碱基序列才跟目的基因转录出的mRNA形成互补双链RNA，使目的基因不能表达 ③. 不能 ④. 番茄细胞内本来存在ACC合成酶基因，能与ACC合成酶基因探针发生分子杂交
【解析】
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定:分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、分析题意和题图：番茄细胞中原有靶基因控制合成的ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的两为反义基因转录成的RNA可与靶基因转录出的mRNA形成RNA双链，使靶mRNA不能与核糖体结合或被RNA酶降解，从而阻止个关键酶。图1所示了ACC氧化酶和ACC合成酶的合成，影响细胞中乙烯的合成，使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2所示的基因表达载体的组成包括复制原点启动子终止子、标记基因和目的基因，目的基因插入点在启动子和终止子之间。
【小问1详解】
乙烯具有促进果实成熟的作用，据图2可知，2A11为特异启动子，推测2A11应在番茄的果实组织中启动转录过程；反转录的模板是RNA，因此应从番茄成熟果实中提取RNA为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，以进行拼接构成融合基因。
【小问2详解】
因为合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamH I和EcoR I的酶切位点，ACC合成酶基因两端含Kpn I和Sau3A I的酶切位点，而限制酶BamH I和Sau3A I切出的黏性末端相同，可将ACC 氧化酶基因和ACC合成酶基因拼接成融合基因，最后对相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶EcoR I和Kpn I进行切割，以确保融合基因能够插入载体中；载体上卡那霉素抗性基因作为标记基因，其作用是便于重组DNA的筛选。
【小问3详解】
为了获得耐运储存、宜储存的番茄，应将融合基因反向插入启动子2A11的下游，因为只有反向插入，转录出的mRNA碱基序列才能跟目的基因转录出的mRNA形成互补双链RNA，导致mRNA不能与核糖体结合，不能进行翻译，使目的基因不能表达出两种酶，从而抑制乙烯的合成；在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时不能用放射性物质标记的ACC氧化合成酶基因片段作探针进行检测，因为番茄细胞内本来就存在ACC合成酶基因，能与ACC合成酶基因探针发生分子杂交。
【点睛】本题以乙烯的合成为情境，考查基因工程的相关知识。解答本题的关键是结合题干信息和题图，弄清反义基因是如何形成的以及反义mRNA和靶mRNA实质上是分别由靶基因的两条链为模板转录而来，再根据基因工程的相关知识进行作答。
(江苏省苏州市、张家港市2021-2022学年高三下学期开学生考试)23. 家禽的谷物饲料中富含纤维素，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，降低了家禽对饲料的吸收与利用。乳酸杆菌是动物胃肠道中的优势有益菌之一，枯草芽孢杆菌可产生降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码。研究人员将W基因转入乳酸杆菌，规模化生产后将其添加于饲料，以提高家禽的养殖效率。
（1）乳酸杆菌与家禽的种间关系属于____________，组成纤维素的单体是____________，枯草芽孢杆菌产生的纤维素降解酶是一种____________（选填“胞外”或“胞内”）酶。
（2）要在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中的质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙链为转录模板链。

①启动子往往具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____________（填字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子 B．乳酸杆菌启动子 C．农杆菌启动子
②下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。
限制酶
EcoRI
BamHI
KpnI
MfeI
HindⅢ
识别序列及切割位点





为获得能正确表达W基因的重组质粒，应选用限制酶____________切割图1中的质粒，选用限制酶____________切割图2中含W基因的DNA片段。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含_____________的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
（3）为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示菌种。所得部分菌液接种于固体鉴定培养基上，另取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如下表所示。
菌种
酶活性相对值
乳酸杆菌
未检出
X
未检出
导入了重组质粒的乳酸杆菌
0.96
①表中的X应为_____________。
②在配制固体鉴定培养基时，除加入无机盐、刚果红、维生素、氮源外，还需要添加_____________。导入了重组质粒的乳酸杆菌在此培养基上应出现_____________。
【答案】（1） ①. 互利共生 ②. 葡萄糖 ③. 胞外
（2） ①. B ②. MfeI、HindⅢ ③. EcoRI、HindⅢ ④. 氨苄青霉素
（3） ①. 导入普通质粒的乳酸杆菌 ②. 纤维素、琼脂、水 ③. 以菌落为中心的透明圈
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取，（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
已知乳酸杆菌是动物胃肠道中的优势有益菌之一，增强家禽的消化能力，故乳酸杆菌与家禽的种间关系属于互利共生。纤维素属于多糖，其单体是葡萄糖，枯草芽孢杆菌产生的纤维素降解酶需要分泌到细胞外降解纤维素，是一种胞外酶。
【小问2详解】
研究人员将W基因转入，规模化生产后将其添加于饲料，以提高家禽的养殖效率。要在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中的质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙链为转录模板链。
①启动子往往具有物种特异性，W基因虽是枯草芽孢杆菌体内的，但要想在乳酸杆菌体内表达，要在图1质粒中插入W基因的上游选择乳酸杆菌启动子。
②分析表格中几种限制酶的识别序列及其切割位点，可知MfeI和EcoRI形成的黏性末端相同，分析图1、图2中相关限制酶的酶切位点，可知应选用限制酶MfeI、HindⅢ切割图1中的质粒，选用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图2中含W基因的DNA片段。质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含氨苄青霉素的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
【小问3详解】
①根据单一变量原则，表中的X应为导入普通质粒的乳酸杆菌。
②在配制固体鉴定培养基时，除加入无机盐、刚果红、维生素、氮源外，还需要添加纤维素作唯一碳源，琼脂作凝固剂和水。导入了重组质粒的乳酸杆菌可产生降解纤维素的酶，分解培养基中的纤维素，故在此培养基上出现以菌落为中心的透明圈。
【点睛】本题较为综合，考查基因工程和微生物培养的相关知识。
(江苏省泰州市2021-2022学年高三第一次调研测试)13. 引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，相关叙述正确的是（ ）
A. 引物的碱基数量越少则退火温度越低、目标DNA获得率越高
B. 根据需要可在引物的5’端添加限制酶识别序列、点突变序列等
C. 两种引物的退火温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合
D. 引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增
【答案】B
【解析】
【分析】PCR技术：
1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
2、原理：DNA复制。
3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。
4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A错误；
B、根据需要可在引物的5’端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，B正确；
C、两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；
D、引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC过高，不利用退火 ，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。
故选B。
(江苏省泰州市2021-2022学年高三第一次调研测试)24. 图1表示CRISPR/Cas9基因编辑的主要作用机理，通过对靶基因的剪切和DNA自我修复可实现靶基因的定点突变。图2是FANCM基因结构示意图，FANCM蛋白能阻止减数分裂过程中交叉互换的发生。科研人员通过构建CRISPR/Cas9重组表达载体，以生菜嫩叶作外植体，经农杆菌转化，培育出FANCM基因的突变纯合新品种。请回答下列问题：

（1）组成FANCM基因外显子和内含子的基本组成单位是____________。根据图2靶序列设计的gRNA中相应序列是5'-____________-3'。
（2）构建CRISPR/Cas9重组表达载体时主要利用的工具酶有____________。研究中需要将gRNA和Cas9基因序列均插入到Ti质粒的T-DNA内部，其目的是____________。
（3）科研人员将CRISPR/Cas9重组表达载体导入农杆菌时，为提高导入成功率，常利用CaCl2处理农杆菌，其目的是____________。将转化的农杆菌接种到液体培养基中，在220r·min、28℃条件下摇床培养10～12h，其目的是____________。
（4）科研人员通过对生菜细胞中FANCM基因测序确定突变株，下表是野生型生菜和实验获得的生菜植株（T0）的相关测序结果。
野生型生菜
5'-AAAGCTCCTTTCAGCTCATGGTATACAACCAGCATTTGAT-3'
T植株
5'-AAAGCTCCTTTCAGCTCATGGTATACAACCAGCATTTGAT-3'
5'-AAAGCTCCTTTCATCATGGTATACAACCAGCATTTGAT-3'
①T0植株发生的基因突变类型是____________。若T0植株连续自交两代，则F2中突变纯合体占比为____________。
②获得的FANCM基因突变纯合体在遗传育种中的应用价值是____________。
【答案】（1） ①. 脱氧核苷酸 ②. UUGUAUACCAUGAGCUGAAAGG-
（2） ①. DNA连接酶和限制酶 ②. T-DNA可以插入到受体细胞
（3） ①. 使农杆菌成为感受态，易于接受环境中的DNA分子 ②. 使农杆菌恢复常态，易于大量培养增殖
（4） ①. 缺失 ②. 3/8
③. 增加杂交育种过程中基因重组的频率，产生更多新品种，加速生菜育种进程
【解析】
【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
2、基因突变：是由于碱基对的增添、缺失或替换导致基因结构发生改变。
【小问1详解】
外显子和内含子属于基因的结构，基本组成单位是脱氧核苷酸；根据碱基互补配对的原则（A-U、T-A、G-C、C-G），所以gRNA中相应序列是5'-UUGUAUACCAUGAGCUGAAAGG-3'。
【小问2详解】
构建基因表达载体需要的酶有限制酶和DNA连接酶；由于T-DNA可以插入到受体细胞中，所以需要将gRNA和Cas9基因序列均插入到Ti质粒的T-DNA内部
【小问3详解】
CaCl2处理农杆菌，可以使农杆菌成为感受态，易于接受环境中的DNA分子；转化的农杆菌接种到液体培养基中，在220r·min、28℃条件下摇床培养10～12h可以使农杆菌恢复常态，易于大量培养增殖。
【小问4详解】
①分析表格中的数据，T0植株比T植株少了2个碱基，所以是基因突变中的缺失；T0植株含有一个正常基因和一个突变基因，用Aa表示，杂交后代AA：Aa：aa=1:2:1，F1自交，aa及突变型植株的比例为1/2×1/4+1/4=3/8。
②FANCM蛋白阻止交叉互换的发生，降低重组频率，与野生型相比，FANCM基因突变的植株，重组频率提高，因此基因突变纯合体的作用是增加杂交育种过程中基因重组的频率，产生更多新品种，加速生菜育种进程。
【点睛】本题考查基因工程、基因突变和分离定律的知识，结合题干将基因工程和图中操作过程相联系，分析解答，掌握分离定律的相关计算。
(江苏省徐州市七中2021-2022学年高三2月学情调研)18. 为了分析模板DNA链的核苷酸序列，在4组反应体系中加入放射性标记的引物、单链DNA模板、DNA聚合酶、dNTP以及特定的ddNTP(双脱氧核苷酸），ddNTP可以取代相应的dNTP，终止DNA子链的延伸，反应后得到不同长度的DNA片段混合物，再进行凝胶电泳放射自显影测序，得到如下结果。下列叙述正确的是（ ）


A. 构成dNTP的五碳糖是核糖，构成ddNTP的五碳糖是脱氧核糖
B. 引物链与模板链配对后，DNA聚合酶从引物的3’端开始延伸子链
C. 上述过程的原理是碱基互补配对，不需要加入解旋酶
D. 据图分析模板链由5’ →3’的碱基序列是-CTGACTTCGACAA
【答案】BD
【解析】
【分析】PCR技术：
1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；
2、原理：DNA复制；
3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物；
4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；
5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、构成dNTP的五碳糖是脱氧核糖，A错误；
B、引物的作用是定位目的基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点。引物链与模板链配对后，DNA聚合酶从引物的3’端开始延伸子链，B正确；
C、上述过程的原理是DNA复制，C错误；
D、加入ddNTP可以终止DNA子链的延伸，所以根据电泳图上显影位置距起点的距离知道片段的长短，离起点近的是最早被终止的片段末端，以此类推，可知与模板结合的链上碱基序列依次是-GACTGAAGCTGTT-，根据碱基互补配对原则，可知模板链由5’ →3’的碱基序列是-CTGACTTCGACAA，D正确。
故选BD。
【点睛】
(江苏省徐州市七中2021-2022学年高三2月学情调研)24. 脑心肌炎病毒（EMCV，RNA病毒）是引起人、猪脑炎和心肌炎的病原体。为研制疫苗，科研人员按下图流程培育转基因酵母菌，来生产BMCV的衣壳蛋白VP1。其中，受体酵母菌是组氨酸合成缺陷型，HIS4基因表达的酶催化组氨酸的合成，C418是一种抗生素。请回答下列问题：


（1）过程①是通过RT-PCR获得目的基因，下列3种引物中，过程①应选择的是______________。
a．5'-GGAATTCGCCACCATCCGAGTCAAACGCTGAA-3'
b．5'-TCGTCGACCATCGATAGCCACTCGCCTAACGCC-3'
c．5'-ATTTGCGCCGCTCACTCTAGCATCAAGACT-3'
（2）PCR技术应用非常广泛，可用于扩增目的基因，制作探针，引入定点突变，定量检测DNA等。完成下列有关PCR技术和相关应用的问题：
①PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会因为_______________，最终都会导致反应效率降低。退火温度过高则会因_________导致目标产物的量减少。
②不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50~1：100，在PCR反应的最初10~15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物_____________个。因为双链DNA和单链DNA的______________不同，可通过_____________将其分离。
（3）过程③将质粒2导入大肠杆菌的目的是_____________。
（4）过程⑤将质粒2线性化时使用的是_____________（限制酶），过程⑥线性DNA需整合到酵母细胞的染色体DNA中目的基因才能______________。
（5）线性DNA整合到酵母细胞染色体DNA时，可能是单拷贝整合，也可能是多拷贝整合。过程⑦先将酵母菌培养在缺乏_____________的培养基中，筛选获得导入目的基因的酵母菌；后将筛选出的酵母菌接种于含2mg·L-1G418的培养基中进行培养，选择生长良好的酵母菌再转接到含4mgLG418的培养基中继续培养，其目的是_____________L。
（6）研究人员用兔抗EMCV血清与酵母细胞生产的VP1蛋白进行抗原—抗体免疫反应试验，其目的是_______________________________________。
【答案】（1）a、c （2） ①. DNA双链不能充分解开，导致模板减少，最终都会导致反应效率降低 ②. 引物不能与模板充分配对 ③. （211-2）a ④. 相对分子质量（碱基数量）不同 ⑤. 电泳法
（3）让其在大肠杆菌中复制
（4） ①. 限制酶salⅠ ②. 稳定遗传并表达
（5） ①. 组氨酸 ②. 筛选出目的基因多拷贝整合的酵母菌
（6）检测酵母细胞生产的VP1与EMCV的VP1的抗原性（结构）是否一致。
【解析】
【分析】多聚酶链式反应扩增DNA片段：
1.PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2.PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
3.结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
题图分析：①是通过RT-PCR获得目的基因，②是构建基因表达载体，③是将表达载体导入大肠杆菌细胞进行扩增，④是提取扩增了的表达载体，⑤是将质粒环状DNA切割形成线性DNA分子，⑥是将线性DNA分子导入酵母菌，使其整合至酵母菌的染色体DNA上，进行表达，⑦是筛选出的产VP1的酵母菌。
【小问1详解】
RT-PCR过程以RNA为模板合成DNA，是逆转录过程，需要的工具酶有逆转录酶、热稳定性高的DNA聚合酶。a、b、c三个引物分别含EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ识别位点，SalⅠ会破坏质粒的启动子，所以过程②构成基因表达载体需要使用的是EcoRⅠ、NotⅠ，所以过程①选用引物a、c。
【小问2详解】
①PCR过程中，温度的控制至关重要，若变性温度过低，则DNA双链不能充分解开，导致模板减少，最终都会导致反应效率降低；若退火温度过高，则会导致引物不能与模板充分配对（模板与引物结合效率低），导致目标产物的量减少。
②不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50～1：100，在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，若只有一条模板链，则10次循环后，产生DNA数量为210，每条DNA为两条链，故10次循环后的数量为210+1，所用引物需减去模板链的数量，则a个模板DNA扩增个循环后限制性引物数量=（211-2）a个。由于双链DNA和单链DNA的相对分子质量（碱基数量）不同，故可用电泳法将其分离。
【小问3详解】
过程③将质粒2导入大肠杆菌的目的是让其在大肠杆菌中复制，该过程需要用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。
【小问4详解】
过程⑤将质粒2线性化时使用的是salⅠ，其在质粒上有2个酶切位点，可以将其切割成直链DNA，便于与酵母菌DNA整合；过程⑥线性DNA需整合到到酵母细胞的染色体DNA中目的基因才能稳定遗传并表达。
【小问5详解】
由于受体酵母菌是组氨酸合成缺陷型，HIS4基因表达的酶催化组氨酸的合成，所以过程⑦先将酵母菌培养在缺乏组氨酸的培养基中进行筛选，筛选导入目的基因的酵母菌；后将筛选出的酵母菌接种于含2mg•L-1G418的培养基中进行培养，选择生长良好的酵母菌再转接到含4mg•L-1G418的培养基中进行培养，由于多基因拷贝其对抗生物的抗性更强，所以其目是筛选出目的基因多拷贝整合的酵母菌。
【小问6详解】
研究人员用兔抗EMCV血清与酵母细胞生产的VP1蛋白进行抗原抗体免疫反应试验，其目的是检测酵母细胞生产的VP1与EMCV的VP1的抗原性（结构）是否一致。
【点睛】熟知基因工程的原理和操作流程是解答本题的关键，正确辨析图示的信息是解答 本题的前提，掌握PCR扩增技术相关的原理和计算是解答本题的另一关键。
(江苏省盐城市阜宁中学2021-2022学年高三下学期第三月考)15. 热启动PCR可提高扩增效率，其基本方法是：进行反应之前将TaqDNA聚合酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内，而是将样品加热，待温度升到70度以上时，再将上述试剂加入，开始PCR反应，下列叙述正确的有（ ）
A. Taq酶最适催化温度范围为50—60℃
B. 与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C. 两条子链合成一定都是从端向端延伸
D. PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了TaqDNA聚合酶的特异性
【答案】BC
【解析】
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；原理是DNA复制；条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
【详解】A、Taq酶最适催化温度范围为60—70℃，即延伸时的温度，A错误；
B、分析题意可知，热启动PCR进行反应之前将TaqDNA聚合酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内，故可减少反应起始时引物错配形成的产物，B正确；
C、DNA分子两条链反向平行，PCR扩增时引物加到3'端，复制时子链只能是从5′端向到3'端延伸，C正确；
D、PCR产物DNA碱基序列的特异性是碱基互补配对的结果，不能体现TaqDNA聚合酶的特异性，D错误。
故选BC。
(江苏省盐城市阜宁中学2021-2022学年高三下学期第三月考)17. 2020年5月22日，在世界权威医学期刊《柳叶刀》杂志在线刊登了中国陈薇团队研发的重组腺病毒疫苗I期人体（108位志愿者）试验临床数据结果：安全、能诱导免疫反应。重组腺病毒疫苗是一种重组的基因工程产品，用不会使人体致病的腺病毒作为载体，把克隆出来的编码新冠病毒S蛋白（介导新冠病毒感染细胞的成分）基因装入载体腺病毒，注入人体，进入人体细胞，表达出S蛋白，刺激人体产生针对新冠病毒的免疫应答。相关叙述正确的是（ ）
A. 重组腺病毒疫苗包括S蛋白基因、启动子、终止子和标记基因等
B. 重组腺病毒疫苗只能使人体产生体液免疫
C. 重组腺病毒疫苗引发的体液免疫中有吞噬细胞、T细胞的参与
D. 重组腺病毒疫苗引起免疫反应后相应淋巴细胞增多，细胞周期将变长
【答案】AC
【解析】
【分析】编码新冠病毒的S蛋白不具有感染性，但可以引起机体产生特异性免疫，腺病毒不会使人致病，可将克隆出来的编码新冠病毒S蛋白（介导新冠病毒感染细胞的成分）基因装入载体腺病毒，注入人体，进入人体细胞，表达出S蛋白，刺激人体产生针对新冠病毒的免疫应答。
【详解】A、基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括目的基因（S蛋白基因）、启动子、终止子和标记基因等，A正确；
B、由于病毒需要寄生在细胞内，且S蛋白是在细胞内合成的，所以重组腺病毒疫苗能使人体产生体液免疫和细胞免疫，B错误；
C、重组腺病毒疫苗引发的体液免疫中有吞噬细胞（处理抗原）、T细胞（释放淋巴因子）的参与，C正确；
D、重组腺病毒疫苗引起免疫反应后相应淋巴细胞增多，细胞周期将变短，D错误。
故选AC。
【点睛】
(江苏省盐城市阜宁中学2021-2022学年高三下学期第三月考)18. 苯丙酮尿症（PKU）是一种由致病基因决定的氨基酸代谢病，常造成新生儿神经系统损害而智力低下。图1是某家庭中该病的遗传系谱图，为避免再生下患儿，该家庭成员去医院进行了基因检测，已知被检测的PKU基因为142bp（bp表示碱基对）。检测人员用特定限制酶酶切部分家庭成员（III—1、III—2、III—3）的PKU基因，产生了大小不同的几种片段，结果如图2所示。下列叙述不正确的是（ ）

A. 苯丙酮尿症是单基因遗传病，由一个基因决定
B. 若III—2与III—3近亲结婚，生一个患病孩子的概率是六分之一
C. III—1的每个PKU基因中均有2个该特定限制酶的酶切位点
D. 可以在患者家系中调查该遗传病的发病率
【答案】ABD
【解析】
【分析】据图分析，图1中Ⅱ-1和Ⅱ-2正常，而他们的儿子Ⅲ-1有病，说明苯丙酮尿症为隐性遗传病；又因为Ⅰ-1有病，而其儿子Ⅱ-2正常，说明该致病基因不可能在X染色体上，因此该病为常染色体隐性遗传病。设该病由A、a基因控制，则Ⅲ-1的基因型为aa，Ⅲ-2的基因型为AA或Aa，Ⅲ-3的基因型为Aa，结合图2结果分析，Ⅲ-1的PKU基因（aa）被限制酶切割后产生50 bp和42 bp两种长度的片段，Ⅲ-3的PKU基因（Aa）被限制酶切割后产生100bp、50 bp和42 bp三种长度的片段，说明A基因酶切后产生100bp和42bp两种长度的片段，a基因酶切后产生50bp和42bp两种长度的片段，故可推出Ⅲ-2的基因型为AA。
【详解】A、结合分析可知，苯丙酮尿症是单基因遗传病，单基因遗传病是由一对等位基因决定的，A错误；
B、由分析可知，Ⅲ-2的基因型为AA，Ⅲ-3的基因型为Aa，若两者结婚，生一个患病孩子（aa）的概率是0，B错误；
C、根据题意分析，已知被检测的Ⅲ-1的PKU基因为142bp，限制酶切割后产生50 bp和42 bp两种长度的片段，142-50-42=50bp，说明50 bp的片段有2个，即切割后产生了三个片段，因此III-1的每个PKU基因中均具有2个该特定限制酶的酶切位点，C正确；
D、调查遗传病的发病率应在人群中随机取样，D错误。
故选ABD。
(江苏省盐城市阜宁中学2021-2022学年高三下学期第三月考)22. 黄瓜为雌雄同株异花植物，同一植株上既有雌花也有雄花，雌花率影响黄瓜产量。研究人员利用黄瓜纯合雌雄同株品系甲培育出全雌株（只有雌花）品系乙。为确定全雌性状形成的分子机制，研究人员进行了如下实验。
（1）品系甲与品系乙杂交，获得的F1表现为全雌，说明全雌为___________性状。将F1与品系甲杂交，获得的子代表现型及比例为___________，表明该相对性状由一对等位基因控制。研究人员发现给品系甲施加乙烯，也可以增加雌花的比例。以上事实说明性状是_________的结果。
（2）进一步研究发现控制全雌性状的基因位于3号染色体上，品系甲、乙3号染色体上部分基因情况如图所示，同时发现品系乙花蕾细胞中ASC基因的mRNA和MYB1基因的mRNA含量显著高于品系甲，而BCAT基因的mRNA无显著差异。

由上述结果推测，品系乙可能由于___________数量更多，从而使得相应蛋白质的大量表达，进而促进了雌花的发育。
（3）为进一步确定控制全雌性状的基因，研究人员利用CRISPR-Cas9 系统对相关基因进行编辑。该系统的核心组成包括gRNA和Cas9蛋白，gRNA可以识别并结合靶基因，引导Cas9蛋白对靶基因进行剪切，进而破坏靶基因结构。大致的实验过程如下
①由于品系乙难以被直接编辑，研究人员以品系甲为背景选育了转基因植株丙和丁。若植株丙中导入以ASC基因为靶基因设计的gRNA基因和Cas9蛋白合成基因，则植株丁中应导入以___________为靶基因设计的gRNA基因和Cas9蛋白合成基因。转入植株丙和丁的基因可随配子传递给子代，表达的CRISPR-Cas9系统可在受精卵中发挥基因编辑作用。
②将植株丙和植株丁分别与品系乙进行杂交，结果见表。

根据表结果，植株丙减数分裂后产生含有与不含有转入基因的配子的比例为___________，含有转入基因的配子形成受精卵后，细胞中的___________基因结构被破坏，表现为____，不含有转入基因的配子形成受精卵后，表现为___________。
植株丁与品系乙杂交结果为___________，说明MYB1基因不是控制全雌性状的基因。
【答案】 ①. 显性 ②. 全雌株：雌雄同株=1：1 ③. 基因与环境共同作用 ④. ASC或MYB1 ⑤. MYB1 ⑥. 1：1 ⑦. ASCa 和ASCb ⑧. 雌雄同株 ⑨. 雌株 ⑩. F1均表现为全雌株
【解析】
【分析】1、生物的性状由基因决定，但受环境影响；基因型与表现型的关系为：表现型=基因型+环境。
【详解】（1）品系甲与品系乙为雌雄同株，二者杂交得F1全为全雌，说明全雌为显性性状。若该性状由一等位基因控制，则F1与品系甲即隐形纯合子杂交，子代显隐性比例为1：1，即全雌：雌雄同株=1：1。给品系甲施加乙烯，可以增加雌花的比例，说明生物的性状由基因控制，但受环境影响，即生物性状是基因与环境共同作用的结果。
（2）根据题意分析，品系乙中ASC基因与MYB1基因数量多于品系甲，且两种基因表达量也多于甲，说明品系乙的全雌性状可能是由于ASC或MYB1基因数量更多，表达相应的蛋白质量更多，从而促进了雌花的发育。
（3）①进一步确定控制全雌性状的基因是ASC或MYB1，若植株丙中导入以ASC基因为靶基因设计的gRNA基因和Cas9蛋白合成基因，则植株丁中应导入以MYB1为靶基因设计的gRNA基因和Cas9蛋白合成基因。
②植株丙为转基因杂合子，减数分裂后产生含有转入基因（专一切除ASC基因）与不含有的配子的比例为1：1。含有转入基因的配子形成受精卵后，根据题中信息可知，丙中导入以ASC基因为靶基因设计的gRNA基因和Cas9蛋白合成基因，所以gRNA基因和Cas9蛋白破坏了细胞中的ASC基因，即细胞中的ASCa 和ASCb基因结构被破坏，表现为雌雄同株。不含有转入基因的配子形成受精卵后，细胞中仍含有ASC基因，表现为全雌株。因此子代雌雄同株和全雌株的比例为1：1，说明ASC基因控制全雌性状。
植株丁也为转基因杂合子，减数分裂后产生含有转入基因（专一切除MYB1基因）与不含有的配子的比例为1：1，两种配子形成受精卵后，MYB1基因被破坏，若MYB1基因对全雌性状无影响，则子代为全雌表现型。
【点睛】本题主要考查基因分离定律，要求学生掌握基因分离定律的实质和常见的分离比，能够根据题意和实验结果进行分析、归纳、综合并解决新情境下遗传规律的问题。
(江苏省扬州高邮市2021-2022学年高三下学期期初学情调研)24. 香兰素是从香荚兰豆中提取的天然香料， 因产量低而价格昂贵。近年来的生产实践中常用拟无枝酸菌生产香兰素， 但香兰素在香兰素脱氢酶的作用下会进一步降 解。科研人员拟通过CRISPR-Cas9系统（由一条单链向导RNA和核酸内切酶Cas9组成），敲除拟无枝酸菌的香兰素脱氢酶基因（VDH），以提高香兰素的产量。图1是选择VDH基因中特定位点进行切割的示意图，图2是设计CRISPR-Cas9系统向导RNA中的识别序列，并构建可用于敲除VDH 基因的质粒的主要过程。请回答下列问题：


（1）核酸内切酶Cas9可催化_______________键的水解。利用CRISPR-Cas9系统敲除VDH基因的内部大片段属于_____________________（变异类型）。
（2）图2中，过程A使用的4种引物序列如下：
引物 1 5'-GAGTCGAAGCTTTTTTTGAGAGCTCGTCCCACGACG-3'
引物 2 5' -GGTCGTTGATGTCCACTTCTCGTCGTCGAG-3'
引物 3 5' -AGAAGTGGACATCAACGACCAGACGGTCAAC-3'
引物 4 5' -CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTGCGAGCACCTGGAGAAGG-3'
①利用PCR1和PCR2分别扩增VDH基因的部分片段，获得VDH基因上游和下游同源臂（VDH-F和VDH-R），这两个PCR不能放在同一系统中同时进行，这是因为________________。
②PCR3反应系统中加入的引物有_______________，此外还应加入模板DNA（VDH-F和VDH-R） 、Mg2+、缓冲液、______________等，适宜条件下扩增得到VDH-F和VDH-R的融合片段。
（3）图2中，完成过程B需要加入的酶有______________。将质粒2导入拟无枝酸菌前，用__________处理使菌株处于感受态，导入后将菌液利用______________法接种到添加___________________的选择培养基中，培养获得多株转化菌株。
（4）通过筛选获得的转化菌株需要从个体水平进行生产性能测试。请写出基本思路_______。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯键 ②. 基因突变
（2） ①. ①引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，导致扩增完整的VDH基因 ②. 引物1和引物4 ③. Taq酶、4种脱氧核苷酸（ dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等
（3） ①. Hind III和 DNA连接酶 ②. Ca2+（或CaCl2） ③. 稀释涂布平板（或平板划线法） ④. 安普霉素
（4）将菌株接种到适合培养基中，置于温度等适宜条件下培养，一段时间后取样检测培养液中香兰素的浓度
【解析】
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，所利用的原理为DNA分子的复制，因此PCR技术一般用于基因扩增。PCR技术：①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸台成技术；②原理：DNA复制；③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶（Taq酶）；④方式：以指数的方式扩增，即约2n；⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。
【小问1详解】
核酸内切酶Cas9的作用位点是磷酸二酯键，能催化其水解。由1可知，敲除VDH基因的过程是去除VDH基因部分碱基，使其失去功能的过程，属于基因突变。
【小问2详解】
引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，导致扩增完整的VDH基因，因此，在利用PCR1和PCR2分别扩增VDH基因的部分片段，获得VDH基因上游和下游同源臂（VDH-F和VDH-R）时，PCR1和PCR2不能放在同一系统中同时进行。引物1和引物4含有共同的片段-AAGCTT-，将其加入PCR3中得到的VDH-F和VDH-R具有相同的位点-AAGCTT-，在适宜条件下能进行片段融合，PCR反应系统中，需要Taq酶、4种脱氧核苷酸（ dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、缓冲液等维持PCR反应顺利进行。
【小问3详解】
图2是重组质粒构建过程，过程B需要Hind III和 DNA连接酶。将质粒2导入拟无枝酸菌前，需要用Ca2+（或CaCl2）处理使菌株，改变其细胞壁通透性，使其处于感受态。导入重组质粒后，通常采用稀释涂布平板法将菌液到含有安普霉素的选择培养基中培养，以获得多株转化菌株。
【小问4详解】
将菌株接种到适合培养基中，置于温度等适宜条件下培养，一段时间后取样检测培养液中香兰素的浓度，可实现筛选所得菌转从个体水平进行的生产性能测试。
【点睛】掌握PCR原理、过程及注意事项，掌握基因工程操作过程，能熟练地从题中提取有效信息并结合PCR和基因工程相关知识综合分析，是解题的关键。
(江苏省扬州中学2021-2022高三下学期3月月考)13. 甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌，它可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是（ ）
A. 用两种酶切割目的基因和质粒，可防止目的基因反向连接和质粒的自身环化
B. 常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中
C. 与大肠杆菌相比，甲醇酵母作受体菌所表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近
D. 与其它酵母菌相比，甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化
【答案】B
【解析】
【分析】基因工程通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获得、重组DNA的形成，重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合 ）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心，其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
【详解】A、用两种酶切割目的基因和质粒，可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化，A叙述正确；
B、常用感受制备感受态细胞的方法，将目的基因导入微生物细胞，B错误；
C、与大肠杆菌做受体相比，甲醇酵母为真核生物，表达出的胶原蛋白经过内质网和高尔基体的加工，所以与人体产生的胶原蛋白结构更相近，C正确；
D、与其他酵母菌相比，甲醇酵母可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少，便于目的蛋白的分离和纯化，D正确。
故选B。
【点睛】
(江苏省扬州中学2021-2022高三下学期3月月考)24. 某地中海贫血（TDT）是单基因病，严重时可能危及生命。人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合B CL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对TDT患者进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

（1）图中启动子是_______________识别和结合位点，且启动子是具有方向性的，目的基因只有正确插入启动子和终止子之间才能正确表达。在表达载体中绿色荧光蛋白基因作为___________，要使绿色荧光蛋白基因表达出来，图b中还缺启动子，请判断即将插入的启动子方向_____________（填“向左”“向右”）。
（2）PCR 扩增 γ基因上游不同DNA 片段的原理是__________________，为使PCR 反应体系中的模板解链为单链，需要满足的条件是_____________________。
（3）将扩增后的产物定向插入载体指导绿色荧光蛋白基因表达，需要在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在R末端添加的序列所对应的限制酶应为_______________，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________________。
（4）从产物扩增到载体构建完成的整个过程中，除限制酶外，还必须用到的工具酶有DNA连接酶和_____________________，其中前者催化形成的化学键是_______________。
（5）将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____________________。
（6）向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于_________________________。
【答案】（1） ①. RNA聚合酶 ②. 标记基因 ③. 向左
（2） ①. DNA双链复制 ②. 加热(至90-95℃)
（3） ①. EcoRI ②. Sall
（4） ①. 耐高温的DNA聚合酶 ②. 磷酸二酯键
（5）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
（6）引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
【解析】
【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7 以及R位置均为引物，故扩 增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列。
2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶MunI识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRI识别并切割后的黏性末端相同，限制酶XhoI识别并切割后的黏性末端与限制酶SalI识别并切割后的黏性末端相同。
【小问1详解】
启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于基因的转录。绿色荧光蛋白基因作为表达载体中的标记基因。要使绿色荧光蛋白基因表达出来，图b中还缺启动子，即将插入的启动子方向向左。
【小问2详解】
PCR扩增的原理是DNA双链复制。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，利用DNA的高温变性加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA解链变为单链。
【小问3详解】
据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun I识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR I识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR I。在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalI。
【小问4详解】
D从产物扩增到载体构建完成的整个过程中，除限制酶外，还必须用到的工具酶有DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶，DNA连接酶作用的对象是磷酸二酯键。
【小问5详解】
只有扩增产物中含有完整启动子，荧光蛋白基因才能表达，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。
【小问6详解】
向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A 蛋白，BCL11A 蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上，含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【点睛】对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第=步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解诀本题的关键。
(江苏省扬州中学2021-2022学年高三下学期开学检测)24. R－loop是一种由RNA－DNA杂合链和单链DNA组成的特殊核酸结构，在原核和真核生物的基因组中分布广泛且普遍存在，在很多关键的生物学过程中发挥重要功能。科学家通过研究发现细胞内的某些蛋白可以识别R－Loop 结构，并促进一类特定物质——RNase H的合成来降解 R－Loop 结构，从而阻止了它们的积累和持久存在。RNase H中主要包括RNase H1和H2，具有特异性降解DNA－RNA杂交链中的RNA部分的能力 ，
（1）请根据材料写出R－loop结构中的碱基对___________________。在高等动物细胞的核基因表达过程中，能产生R－loop的过程为_____________，该结构的存在使DNA分子的稳定性__________________（填“增大”或“降低”或“保持不变”）。
（2）假定R－loop 结构中 DNA 单链含有 4000 个碱基， 其中A 和T 占该链碱基总数的 30%，则该R－loop 结构中的碱基G 和C 共有_______________个。
（3）根据RNase H1和H2的功能推测，它们最可能属于下列哪种物质：___（填字母）。
A. 脱氧核糖核酸酶 B. 核糖核酸酶 C. 蛋白酶 D. 端粒酶
（4）①研究发现，患者神经元细胞中基因表达效率较正常的神经元细胞要降低，这是因为R-loop结构的形成影响了遗传信息的_____________ 和 ______________________。

②R-loop结构中嘌呤碱基总数________________（填“等于”“不一定等于”）嘧啶碱基总数，原因是
________________________________。
（5）2019年，科学家报道了GADD45A蛋白能够识别并结合细胞内的R－Loop结构，作为R－Loop结构的探测器，能够募集去甲基化酶TET1，从而介导CpG岛（DNA上富含CpG二核苷酸的一些区域称为CpG岛，CpG表示胞嘧啶（C）－磷酸（p）－鸟嘌呤（G））的去甲基化，促进相关基因的转录，从而改变表现型。已知表观遗传是指生物体基因的碱基序列不变，而基因表达与表现型发生可遗传变化的现象。TET1 作用于R－Loop 结构后引起的表现型变化_______（答“是”或者“不是”）属于可遗传变异，请说明原因____________________________。近年来，研究发现肿瘤抑制基因 TCF21 的启动子区域（DNA 上起始转录的位点）存在 CpG 岛的结构，且肿瘤细胞内的 TCF21 基因启动子区域的甲基化水平明显高于正常细胞。请结合题干材料分析， 简要阐述R－Loop 结构对人体也有益处的理由_______。
【答案】（1） ①. A-U、T-A、G-C、C-G ②. 转录 ③. 降低
（2）8400 （3）B
（4） ①. 转录
②. 翻译
③. 不一定等于 ④. 单链RNA中嘌呤碱基总数与嘧啶碱基总数不一定相等
（5） ①. 不是 ②. 可遗传变异是由遗传物质改变引起，去甲基化并未改变基因的碱基序列 ③. R-Loop结构通过结合GADD45A并且募集去甲基化酶TET1，从而介导TCF21基因的启动子去甲基化，促进肿瘤抑制基因TCF21的表达
【解析】
【分析】分析题干信息可知R-loop结构是一种三链RNA-DNA 杂合片段，是在DNA的双链中不小心结合了与模板链互补的RNA，因此这种异常结构的形成可能和转录过程RNA未正常脱离有关。
【小问1详解】
R－loop是一种由RNA－DNA杂合链和单链DNA组成的特殊核酸结构，推测R－loop结构中的碱基对A-U、T-A、G-C、C-G。R-loop结构是产生的RNA与DNA模板链形成了稳定的杂合链，因此该结构应该是转录形成RNA过程时形成的产物；该结构的存在使DNA单链分子不能与互补链碱基互补配对，故该结构的存在使DNA分子的稳定性降低。
【小问2详解】
R-loop结构包含两条DNA单链和一条mRNA单链，因此基本组成单位是脱氧核苷酸和核糖核苷酸。由于该结构中DNA单链含有4000个碱基，其中A 和T 占该链碱基总数的30%，则C和G含有70%，因此一条DNA单链上C和G的总和为2800个，由于碱基的互补配对原则，另一条DNA单链和mRNA单链上也分别有C和G碱基2800个，所以该结构G 和C 共有2800×3=8400个。
小问3详解】
RNase H1和H2可以降解DNA－RNA杂交链中的RNA部分的能力 ，维护基因组稳定性，表明其可以水解异常的RNA，说明其最可能是核糖核酸酶，B正确。
【小问4详解】
①根据题干信息“R－loop是一种由RNA－DNA杂合链和单链DNA组成的特殊核酸结构”，由于产生的RNA与DNA模板链形成了稳定的杂合链，导致该片段中DNA模板链的互补链只能以单链状态存在，R-Ioop结构的形成会影响遗传信息的转录和翻译。
②R-Ioop结构是一种三链RNA-DNA杂合片段，其中双链DNA中的嘌呤碱基总数一定等于嘧啶碱基总数，但单链RNA中嘌呤碱基总数与嘧啶碱基总数不一定相等，因此R-loop结构中嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基总数。
【小问5详解】
TET1 作用于 R-Loop 结构后引起的表现型变化不属于可遗传变异，因为可遗传变异是由遗传物质改变引起，而去甲基化并未改变基因的碱基序列。当基因发生甲基化，其甲基化的区域会影响转录进而影响基因的表达，而GADD45A蛋白能够识别并结合细胞内的R-Loop结构，募集去甲基化酶TET1，从而介导CpG岛的去甲基化，促进基因的转录，而肿瘤抑制基因TCF21的启动子区域存在CpG岛的结构，所以R-Loop结构通过结合GADD45A并且募集去甲基化酶TET1，从而介导TCF21基因的启动子去甲基化，促进肿瘤抑制基因TCF21的表达，抑制肿瘤，在这方面上对人体有益处。
【点睛】本题的难点是最后考查R-Loop 结构对人体是否有益处，需要学生结合题干中对GADD45A 蛋白与甲基化的基因之间的调控作用关系，分析肿瘤抑制因子的表达情况，逻辑关系较强，查考较难。
(江苏省仪征中学2021-2022学年高三下学期期初学情联合检测)18. 近年来，随着生活水平的提高，人们对饮用水的要求也越来越高，对水质中大肠杆菌的快速检测显得尤为重要。科研人员提取大肠杆菌的基因组DNA，并根据大肠杆菌菌群相对保守的uida基因序列，设计特异性引物，建立实时荧光定量PCR反应体系，成功检测出不同水域单位体积大肠杆菌uida基因数。荧光定量PCR技术的原理如图所示，其中每扩增一次，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。下列说法正确的是（ ）

（注：Ct值是指PCR扩增过程中，扩增产物的荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数）
A. PCR技术能扩增大肠杆菌基因组中uida保守基因片段是由人工合成的两种引物决定的
B. 探针完整时，有荧光，Taq酶延伸至探针处时切断探针，荧光消失
C. 大肠杆菌菌群中uida基因起始浓度越高，Ct值越大
D. 若用cDNA作模板，荧光定量PCR技术可用于检测某基因的表达水平
【答案】AD
【解析】
【分析】
1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸：
（1）变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链；
（2）复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；
（3）延伸：72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【详解】A、由题干可知，因根据大肠杆菌菌群相对保守的uida基因序列，设计的特异性引物，故提取大肠杆菌基因组DNA进行PCR扩增时，引物特异性地与uida基因模板进行碱基互补配对，使Taq酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，A正确；
B、PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的3'－5'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，B错误；
C、Ct值（循环阈值）的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，模板起始浓度越高，Ct值越小，C错误；
D、通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量，从而反映某基因的表达水平，D正确。
故选AD。
(江苏省仪征中学2021-2022学年高三下学期期初学情联合检测)24. 香兰素是从香荚兰豆中提取的天然香料， 因产量低而价格昂贵。近年来的生产实践中常用拟无枝酸菌生产香兰素， 但香兰素在香兰素脱氢酶的作用下会进一步降 解。科研人员拟通过CRISPR-Cas9系统（由一条单链向导RNA和核酸内切酶Cas9组成），敲除拟无枝酸菌的香兰素脱氢酶基因（VDH），以提高香兰素的产量。图1是选择VDH基因中特定位点进行切割的示意图，图2是设计CRISPR-Cas9系统向导RNA中的识别序列，并构建可用于敲除VDH 基因的质粒的主要过程。请回答下列问题：


（1）核酸内切酶Cas9可催化_______________键的水解。利用CRISPR-Cas9系统敲除VDH基因的内部大片段属于_____________________（变异类型）。
（2）图2中，过程A使用的4种引物序列如下：
引物 1 5'-GAGTCGAAGCTTTTTTTGAGAGCTCGTCCCACGACG-3'
引物 2 5' -GGTCGTTGATGTCCACTTCTCGTCGTCGAG-3'
引物 3 5' -AGAAGTGGACATCAACGACCAGACGGTCAAC-3'
引物 4 5' -CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTGCGAGCACCTGGAGAAGG-3'
①利用PCR1和PCR2分别扩增VDH基因的部分片段，获得VDH基因上游和下游同源臂（VDH-F和VDH-R），这两个PCR不能放在同一系统中同时进行，这是因为________________。
②PCR3反应系统中加入的引物有_______________，此外还应加入模板DNA（VDH-F和VDH-R） 、Mg2+、缓冲液、______________等，适宜条件下扩增得到VDH-F和VDH-R的融合片段。
（3）图2中，完成过程B需要加入的酶有______________。将质粒2导入拟无枝酸菌前，用__________处理使菌株处于感受态，导入后将菌液利用______________法接种到添加___________________的选择培养基中，培养获得多株转化菌株。
（4）通过筛选获得的转化菌株需要从个体水平进行生产性能测试。请写出基本思路_______。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯键 ②. 基因突变
（2） ①. ①引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，导致扩增完整的VDH基因 ②. 引物1和引物4 ③. Taq酶、4种脱氧核苷酸（ dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等
（3） ①. Hind III和 DNA连接酶 ②. Ca2+（或CaCl2） ③. 稀释涂布平板（或平板划线法） ④. 安普霉素
（4）将菌株接种到适合培养基中，置于温度等适宜条件下培养，一段时间后取样检测培养液中香兰素的浓度
【解析】
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，所利用的原理为DNA分子的复制，因此PCR技术一般用于基因扩增。PCR技术：①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸台成技术；②原理：DNA复制；③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶（Taq酶）；④方式：以指数的方式扩增，即约2n；⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。
【小问1详解】
核酸内切酶Cas9的作用位点是磷酸二酯键，能催化其水解。由1可知，敲除VDH基因的过程是去除VDH基因部分碱基，使其失去功能的过程，属于基因突变。
【小问2详解】
引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，导致扩增完整的VDH基因，因此，在利用PCR1和PCR2分别扩增VDH基因的部分片段，获得VDH基因上游和下游同源臂（VDH-F和VDH-R）时，PCR1和PCR2不能放在同一系统中同时进行。引物1和引物4含有共同的片段-AAGCTT-，将其加入PCR3中得到的VDH-F和VDH-R具有相同的位点-AAGCTT-，在适宜条件下能进行片段融合，PCR反应系统中，需要Taq酶、4种脱氧核苷酸（ dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、缓冲液等维持PCR反应顺利进行。
【小问3详解】
图2是重组质粒构建过程，过程B需要Hind III和 DNA连接酶。将质粒2导入拟无枝酸菌前，需要用Ca2+（或CaCl2）处理使菌株，改变其细胞壁通透性，使其处于感受态。导入重组质粒后，通常采用稀释涂布平板法将菌液到含有安普霉素的选择培养基中培养，以获得多株转化菌株。
【小问4详解】
将菌株接种到适合培养基中，置于温度等适宜条件下培养，一段时间后取样检测培养液中香兰素的浓度，可实现筛选所得菌转从个体水平进行的生产性能测试。
【点睛】掌握PCR原理、过程及注意事项，掌握基因工程操作过程，能熟练地从题中提取有效信息并结合PCR和基因工程相关知识综合分析，是解题的关键。