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生物选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序课前预习ppt课件
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这是一份生物选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序课前预习ppt课件，共55页。PPT课件主要包含了限制性内切核酸酶，DNA连接酶，学习目标，目的基因的筛选与获取，目的基因的筛选和获取，体内DNA复制，PCR技术，总结PCR技术，基因表达载体的构建，难点剖析等内容，欢迎下载使用。
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术所需的三种基本工具：
1.运用归纳与概括、模型与建模等方法,分析基因工程操作的四个步骤。2.通过对基因工程案例的分析,理解基因工程基本操作程序的常用方法和基本原理。3.尝试用PCR技术扩增目的基因,并通过琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR产物。
基因工程培育抗虫棉的思路：
一、目的基因的筛选与获取
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
基因工程的基本操作程序
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）与生物药物相关的基因（胰岛素、干扰素基因）与毒物降解相关的基因与工业用酶相关的基因等
根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
1．筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。(2)实例：
Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程
苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）,破坏昆虫的消化系统来杀死棉铃虫
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
随着测序技术的发展，以及序列数据库、序列比对工具等的应用，越来越多的基因的 为人们所知。
明确了目的基因后，该如何获得它？
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
获取一个目的基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？
2、DNA复制的特点:
①模板： ②原料： ③能量: ④酶 ：
解旋酶，DNA聚合酶等
②合成子链（DNA聚合酶）以每一条母链为模板，以游离的将4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，在DNA聚合酶的作用下合成与母链互补的1条子链。
▲子链的合成方向：5'端→3'端 因为DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。
【自主学习·合作探究】5min阅读P77—79相关内容，思考讨论：1.PCR的全称、操作环境、原理、目的、基本组分和条件以及各条件的作用是什么？2.PCR的反应过程是如何进行的？
PCR与DNA的体内复制是否完全相同？
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
一.目的基因的筛选与获取---利用PCR获取和扩增目的基因
PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR扩增仪（PCR仪）
（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。
▲子链的合成方向：5'端→3'端
引物：1.有 种引物，且只能结合在DNA母链的3’端2.作为复制的起始点，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
注意：DNA聚合酶可重复使用，引物需不断加入
耐高温的DNA聚合酶
（2）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR循环，以_____方式扩增， 可以扩增出 个DNA片段。
（3）鉴定：完成后，常采用 来鉴定PCR的产物。
PCR技术 vs DNA复制
体外(主要在PCR扩增仪内)
DNA在高温下变性解旋
都需要：模板、4种脱氧核苷酸、酶、引物
半保留复制、边解旋边复制
半保留复制、全解旋再复制
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成DNA再进行扩增。
双链DNA(cDNA)
（1）引物是一小段能与 DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸。
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。引物与目的基因模板链的 端结合。
从子链的5′端向3′端延伸
①全称：②操作环境：③原理：④前提：⑤条件：⑥过程：⑦优点：
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
可以在短时间内大量扩增目的基因（以指数形式扩增）
已知目的基因两端的核苷酸序列（为了合成2种引物）
（模板DNA、4种游离脱氧核苷酸、引物（2种）、耐高温的DNA聚合酶）
DNA解链（超过90℃）
引物结合到DNA模板链（50℃左右）
DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成（72℃左右）
6.下列属于PCR技术所需条件的是（ ） ①单链的核苷酸序列引物 ②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核苷酸 ④核糖核苷酸 ⑤DNA连接酶 ⑥耐高温的DNA聚合酶 ⑦限制酶 A.①②③⑤B.①②③⑥ C.①②③⑥⑦ D.①②③⑤⑥
5.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关 PCR的叙述，错误的是（ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解旋不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶和4种核糖核苷酸
1.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 ( ) 2.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 ( ) 3.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。 ( )4.PCR中，模板链上碱基G和C的比例越高，DNA 变性解链的温度越高（ ）
获得目的基因后直接转入受体吗？
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
基因工程第二步：基因表达载体的构建
位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段(RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录)
位于基因下游的一段有特殊序列的DNA片段(终止转录)
鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞
目的基因必须插入到 与 之间。
DNA复制的起始位点。
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
载体≠表达载体的区别：表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
基因表达载体中启动子、终止子的来源：①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的:已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。②如果目的基因是通过人工方法合成的:则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
基因表达载体构建模式图
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
1.目的基因应该插入到载体的哪个部位？如果目的基因插入到标记基因或复制原点中，该基因表达载体还能用么？如何避免这种现象？
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，才能保证目的基因的正常转录。（2）目的基因、启动子、终止子、复制原点等各个结构都不得含有限制酶识别序列，否则会影响表达载体的构建。
目的基因与目的基因连接
2.使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与质粒结合的这一种重组DNA？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的随意连接？
如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因内部不含图中限制酶识别序列，为使该基因与该质粒构建重组质粒，切割目的基因和质粒时应该选择哪两种酶？A、NdeⅠ和BamHⅠB、NdeⅠ和XbaⅠC、XbaⅠ和BamHⅠD、EcRⅠ和KpnⅠ
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间。（2） 限制酶切割时不能破坏启动子、终止子、复制原点等结构。
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
将目的基因导入受体细胞的方法
1.花粉管通道法（我国独创）
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
将目的基因导入植物细胞
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的植物细胞，并且将其整合到该植物细胞的染色体DNA上
含目的基因的重组Ti质粒
Ti质粒上的T-DNA可以整合到受体细胞的染色体DNA上
该过程经过_______次拼接、_______次导入？(1)第一次拼接：__________________________________________________ 第二次拼接：__________________________________________________(2)第一次导入：__________________________________________________ 第二次导入：___________________________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞
将目的基因导入动物细胞
①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
原理：使用Ca2+处理可使受体细胞处于一种能吸收周围 环境中DNA分子的生理状态。（感受态细胞）
原核生物（大肠杆菌）作为受体细胞有哪些优点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
将重组好的表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
将目的基因导入微生物细胞
显微注射法(以受精卵作为受体细胞)
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
在转基因生物的培育过程中，可以从哪些层次对目的基因进行检测与鉴定？
1、检测转基因生物是否插入了目的基因
方法：PCR技术、DNA分子杂交技术
基本思路：1.制作出与目的基因序列相同DNA片段，并用同位素进行标记（基因探针）2.提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA。
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
方法：PCR技术、分子杂交技术
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：
抗原与抗体的特异性结合
通常以目的基因的表达产物(蛋白质)作抗原,制备相应抗体,利用抗原与抗体特异性结合的原理检测。
提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
植物叶片饲喂害虫（抗虫接种实验）
转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出mRNA
目的基因是否翻译形成蛋白质
PCR技术、DNA分子杂交技术
PCR技术、分子杂交技术
2.下列关于基因工程的叙述，正确的是( )A.DNA连接酶能使两碱基间形成氢键连接起来B.质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体C.限制性酶能够特异性识别并切烟草花叶病毒遗传物质D.农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组，然后将重组DNA分子导入植物受体细胞
1.下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是( )A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增 B.具有启动子，作为肽链合成的起始信号C.具有标记基因，有利于目的基因的初步检测D.具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
3.土壤农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T-DNA片段可转入植物的基因组中。利用农杆菌的Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是( )A.目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏TDNAB.用Ca2+处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞C.Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNAD.T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物细胞的染色体上
4.基因工程为植物育种提供了技术保障。如图为植物育种的过程(字母代表相应的物质或结构,数字代表过程或方法)。下列说法正确的是A①过程需要的酶有限制酶和DNA聚合酶 B.②过程常用的方法是农杆菌转化法C.③④过程为脱分化和再分化,该过程没有体现植物细胞的全能性D.转基因生物DNA上是否插人目的基因，可用抗原-抗体杂交技术检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术所需的三种基本工具：
1.运用归纳与概括、模型与建模等方法,分析基因工程操作的四个步骤。2.通过对基因工程案例的分析,理解基因工程基本操作程序的常用方法和基本原理。3.尝试用PCR技术扩增目的基因,并通过琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR产物。
基因工程培育抗虫棉的思路：
一、目的基因的筛选与获取
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
基因工程的基本操作程序
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）与生物药物相关的基因（胰岛素、干扰素基因）与毒物降解相关的基因与工业用酶相关的基因等
根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
1．筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。(2)实例：
Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程
苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）,破坏昆虫的消化系统来杀死棉铃虫
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
随着测序技术的发展，以及序列数据库、序列比对工具等的应用，越来越多的基因的 为人们所知。
明确了目的基因后，该如何获得它？
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
获取一个目的基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？
2、DNA复制的特点:
①模板： ②原料： ③能量: ④酶 ：
解旋酶，DNA聚合酶等
②合成子链（DNA聚合酶）以每一条母链为模板，以游离的将4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，在DNA聚合酶的作用下合成与母链互补的1条子链。
▲子链的合成方向：5'端→3'端 因为DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。
【自主学习·合作探究】5min阅读P77—79相关内容，思考讨论：1.PCR的全称、操作环境、原理、目的、基本组分和条件以及各条件的作用是什么？2.PCR的反应过程是如何进行的？
PCR与DNA的体内复制是否完全相同？
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
一.目的基因的筛选与获取---利用PCR获取和扩增目的基因
PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR扩增仪（PCR仪）
（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。
▲子链的合成方向：5'端→3'端
引物：1.有 种引物，且只能结合在DNA母链的3’端2.作为复制的起始点，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
注意：DNA聚合酶可重复使用，引物需不断加入
耐高温的DNA聚合酶
（2）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR循环，以_____方式扩增， 可以扩增出 个DNA片段。
（3）鉴定：完成后，常采用 来鉴定PCR的产物。
PCR技术 vs DNA复制
体外(主要在PCR扩增仪内)
DNA在高温下变性解旋
都需要：模板、4种脱氧核苷酸、酶、引物
半保留复制、边解旋边复制
半保留复制、全解旋再复制
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成DNA再进行扩增。
双链DNA(cDNA)
（1）引物是一小段能与 DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸。
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。引物与目的基因模板链的 端结合。
从子链的5′端向3′端延伸
①全称：②操作环境：③原理：④前提：⑤条件：⑥过程：⑦优点：
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
可以在短时间内大量扩增目的基因（以指数形式扩增）
已知目的基因两端的核苷酸序列（为了合成2种引物）
（模板DNA、4种游离脱氧核苷酸、引物（2种）、耐高温的DNA聚合酶）
DNA解链（超过90℃）
引物结合到DNA模板链（50℃左右）
DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成（72℃左右）
6.下列属于PCR技术所需条件的是（ ） ①单链的核苷酸序列引物 ②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核苷酸 ④核糖核苷酸 ⑤DNA连接酶 ⑥耐高温的DNA聚合酶 ⑦限制酶 A.①②③⑤B.①②③⑥ C.①②③⑥⑦ D.①②③⑤⑥
5.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关 PCR的叙述，错误的是（ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解旋不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶和4种核糖核苷酸
1.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 ( ) 2.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 ( ) 3.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。 ( )4.PCR中，模板链上碱基G和C的比例越高，DNA 变性解链的温度越高（ ）
获得目的基因后直接转入受体吗？
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
基因工程第二步：基因表达载体的构建
位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段(RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录)
位于基因下游的一段有特殊序列的DNA片段(终止转录)
鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞
目的基因必须插入到 与 之间。
DNA复制的起始位点。
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
载体≠表达载体的区别：表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
基因表达载体中启动子、终止子的来源：①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的:已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。②如果目的基因是通过人工方法合成的:则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
基因表达载体构建模式图
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
1.目的基因应该插入到载体的哪个部位？如果目的基因插入到标记基因或复制原点中，该基因表达载体还能用么？如何避免这种现象？
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，才能保证目的基因的正常转录。（2）目的基因、启动子、终止子、复制原点等各个结构都不得含有限制酶识别序列，否则会影响表达载体的构建。
目的基因与目的基因连接
2.使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与质粒结合的这一种重组DNA？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的随意连接？
如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因内部不含图中限制酶识别序列，为使该基因与该质粒构建重组质粒，切割目的基因和质粒时应该选择哪两种酶？A、NdeⅠ和BamHⅠB、NdeⅠ和XbaⅠC、XbaⅠ和BamHⅠD、EcRⅠ和KpnⅠ
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间。（2） 限制酶切割时不能破坏启动子、终止子、复制原点等结构。
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
将目的基因导入受体细胞的方法
1.花粉管通道法（我国独创）
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
将目的基因导入植物细胞
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的植物细胞，并且将其整合到该植物细胞的染色体DNA上
含目的基因的重组Ti质粒
Ti质粒上的T-DNA可以整合到受体细胞的染色体DNA上
该过程经过_______次拼接、_______次导入？(1)第一次拼接：__________________________________________________ 第二次拼接：__________________________________________________(2)第一次导入：__________________________________________________ 第二次导入：___________________________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞
将目的基因导入动物细胞
①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
原理：使用Ca2+处理可使受体细胞处于一种能吸收周围 环境中DNA分子的生理状态。（感受态细胞）
原核生物（大肠杆菌）作为受体细胞有哪些优点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
将重组好的表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
将目的基因导入微生物细胞
显微注射法(以受精卵作为受体细胞)
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
在转基因生物的培育过程中，可以从哪些层次对目的基因进行检测与鉴定？
1、检测转基因生物是否插入了目的基因
方法：PCR技术、DNA分子杂交技术
基本思路：1.制作出与目的基因序列相同DNA片段，并用同位素进行标记（基因探针）2.提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA。
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
方法：PCR技术、分子杂交技术
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：
抗原与抗体的特异性结合
通常以目的基因的表达产物(蛋白质)作抗原,制备相应抗体,利用抗原与抗体特异性结合的原理检测。
提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
植物叶片饲喂害虫（抗虫接种实验）
转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出mRNA
目的基因是否翻译形成蛋白质
PCR技术、DNA分子杂交技术
PCR技术、分子杂交技术
2.下列关于基因工程的叙述，正确的是( )A.DNA连接酶能使两碱基间形成氢键连接起来B.质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体C.限制性酶能够特异性识别并切烟草花叶病毒遗传物质D.农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组，然后将重组DNA分子导入植物受体细胞
1.下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是( )A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增 B.具有启动子，作为肽链合成的起始信号C.具有标记基因，有利于目的基因的初步检测D.具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
3.土壤农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T-DNA片段可转入植物的基因组中。利用农杆菌的Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是( )A.目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏TDNAB.用Ca2+处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞C.Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNAD.T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物细胞的染色体上
4.基因工程为植物育种提供了技术保障。如图为植物育种的过程(字母代表相应的物质或结构,数字代表过程或方法)。下列说法正确的是A①过程需要的酶有限制酶和DNA聚合酶 B.②过程常用的方法是农杆菌转化法C.③④过程为脱分化和再分化,该过程没有体现植物细胞的全能性D.转基因生物DNA上是否插人目的基因，可用抗原-抗体杂交技术检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
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