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新高考生物一轮复习讲练课件：第37讲 基因工程的基本工具与操作程序（含解析）
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这是一份新高考生物一轮复习讲练课件：第37讲 基因工程的基本工具与操作程序（含解析），共60页。PPT课件主要包含了素养目标，遗传性状，核苷酸序列，磷酸二酯键，黏性末端，2DNA连接酶，稳定保存，限制酶切割位点，NaCl溶液，molL等内容，欢迎下载使用。
一、重组DNA技术的基本工具1.基因工程的概念理解
2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶(限制酶)
一种特定的脱氧核苷酸序列
具有专一性①限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成;后者是双链序列。②判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°,同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。 不是氢键③限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。④在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次此DNA分子。
(3)基因进入受体细胞的载体 不仅仅是质粒
3.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理
旁栏边角1.(选择性必修3,第72页,“旁栏思考”)DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
2.(选择性必修3,第74页,“拓展应用1”)为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子?
提示 不是。DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
提示 细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA,是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。
易错辨析基于对重组DNA技术的基本工具的理解,判断下列表述是否正确。(1)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。( )(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。( )(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。( )(4)E.cli DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。( )(5)当作载体的质粒DNA分子上应至少含一个限制酶切割位点。( )(6)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中,使之稳定存在并表达。( )
二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取(1)筛选合适的目的基因①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变 或获得 等的基因。主要是指 的基因。②筛选目的基因的方法:从相关的已知 清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 (2)利用PCR获取和扩增 ①原理: 。
引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
维持反应体系pH稳定
③过程:PCR过程包括 、复性和 三步
(3)结果:DNA分子以 扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。(4)说明①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的 ,又可为DNA的合成提供能量。 ②引物既可以是DNA单链,也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时,也需要引物,一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲溶液中一般都要添加Mg2+。
(5)PCR技术和DNA复制的比较
2.基因表达载体的构建 基因工程的核心内容(1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中 ,并且可以 给下一代。 ②使目的基因能够 和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
(3)基因表达载体的构建过程
3.将目的基因导入受体细胞
提醒导入目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
旁栏边角1.(选择性必修3,第79页,“思考”改编)PCR可以扩增mRNA吗?利用PCR扩增目的基因时,为什么要用2种不同的引物?
提示 不可以,因为PCR是用DNA双链作模板的,不能直接用单链RNA作PCR,必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再作PCR。DNA是两条反向平行的双链,而复制时只能从固定的方向(模板链的3'端)开始,所以引物的碱基序列是不同的。
2.(选择性必修3,第80页,“正文”改编)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶?是否只能用同一种限制酶?
提示 选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端,可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。
易错辨析基于对基因工程的基本操作程序的理解,判断下列表述是否正确。(1)用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。( )(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。( )(3)将目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。( )(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。( )(5)应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。( )
长句应答1.为什么不直接把目的基因导入受体细胞,而要用载体?
提示 游离的DNA片段进入受体细胞,一般会被直接分解,就算可以进行转录并翻译成蛋白质,游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体,由于载体可以在细胞内复制,随着细胞分裂,载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样,基因工程才有意义。
2.新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测原理是什么?
提示 新型冠状病毒核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒的医疗检测用品,它的工作原理是通过提取病人样本中的RNA,进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大,最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性,那么就可以认为样本中存在病毒(已经感染),反之表明样本中没有病毒(未感染)。
考向探究考向1结合基因工程所需工具酶,考查科学实践中的探究能力1.(2022辽宁抚顺一模)某质粒分子其中一条链的部分核苷酸序列为—CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA—,限制酶EcRⅠ在单链上的识别序列为—GAATTC—。下列叙述正确的是( )A.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定位点断开DNAB.用EcRⅠ酶切割该质粒,至少会产生2个片段C.与其互补片段相比,该单链片段中A与T的和所占比例较大D.一个该质粒复制n次,得到的双链都是新合成的质粒有(2n-1)个
答案 A 解析 限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,A项正确;质粒是环状的,该质粒只有一个EcRⅠ酶切割位点,用EcRⅠ酶切割该质粒,会产生1个片段,B项错误;与其互补片段相比,该单链片段中的A和T与互补链中的A和T碱基配对,是互补的,它们所占比例一样,C项错误;一个该质粒复制n次,含母链的质粒有2个,其余都是新合成的质粒,得到的双链都是新合成的质粒有(2n-2)个,D项错误。
考向2结合载体的作用及特点,考查科学思维的能力2.(2022山东兰山模拟)下图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点,下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述,错误的是( )A.若通过PCR技术提取该目的基因应该选用引物甲和引物丙B.构建基因表达载体,可选用BamHⅠ剪切C.构建基因表达载体时为了防止目的基因和质粒的自身环化,可以选用BclⅠ和HindⅢ剪切D.在导入目的基因的受体细胞中,四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因不能同时表达
答案 B 解析 PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合,沿相反的方向合成子链,故所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙,A项正确;构建基因表达载体时,应至少保留一个完整的标记基因,便于目的基因的检测和筛选,图1中BamHⅠ同时切割两种标记基因,不能选用BamHⅠ剪切,B项错误;图2中目的基因左侧只能用BclⅠ切割,而质粒上没有目的基因右侧Sau3A的切点,两者都有HindⅢ的切点,为了防止目的基因与质粒自身环化,应选用BclⅠ和HindⅢ剪切质粒和目的基因,C项正确;在构建基因表达载体时,使用BclⅠ和HindⅢ 2种限制酶切割质粒,氨苄青霉素抗性基因被破坏,不能表达,四环素抗性基因能表达,D项正确。
3.(2022江西模拟)下图1所示为用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段示意图;图2所示为三种质粒示意图。图中AP为氨苄青霉素抗性基因,Tc为四环素抗性基因。EcRⅠ、PvuⅠ等为限制酶及其切割的位点。复制原点是在基因组上复制起始的一段序列,是指质粒在受体细胞中复制时的起点。
(1)组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架共同含有的元素是 。 (2)图2中质粒A、质粒C能否作为目的基因最理想的运载体? (填“能”或“否”),请说明理由。 。 (3)重组质粒成功导入受体细胞的概率一般为10-7,用质粒B构建重组质粒,为了筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌,在导入完成后,将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养,大肠杆菌在两种培养基中的生长状况不可能的是 ,可能性最大的是 。 (4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物,则需要将重组质粒导入山羊的 (细胞)中。
答案 (1)C、H、O、P(2)否 质粒A缺少标记基因;质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时,复制原点会被限制酶切割,会影响重组质粒的自主复制(3)在含四环素的培养基上能正常生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长 在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长(4)受精卵
解析 (1)脱氧核糖和磷酸交替连接构成DNA片段D的基本骨架,脱氧核糖由C、H、O 3种元素组成,组成磷酸的元素是H、P、O;磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架,磷脂分子是由C、H、O、N、P组成;可见,组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架共同含有的元素是C、H、O、P。(2)分析图2可知,质粒A缺少标记基因,质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时,复制原点会被限制酶切割,进而影响重组质粒的自主复制,所以质粒A、质粒C均不能作为目的基因最理想的运载体。
(3)用质粒B构建重组质粒,当用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割时, Tc(四环素抗性基因)遭到破坏,而AP(氨苄青霉素抗性基因)结构完好,因此在重组质粒导入完成后,将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养,大肠杆菌在两种培养基中的生长状况不可能的是在含四环素的培养基上能正常生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长。因重组质粒成功导入受体细胞的概率一般为10-7,所以可能性最大的是在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物,则需要将重组质粒导入山羊的受精卵中。
考向3DNA的提取和鉴定4.(2022贵州遵义模拟)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图,相关叙述正确的是( )A.图1中溶液a是物质的量浓度为0.14 ml/L的NaCl溶液B.图2所示实验操作中有一处明显错误,可能导致试管2中蓝色变化不明显C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白质等杂质不溶D.图2中的试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
答案 B 解析 图1中的溶液a是研磨液的上清液,A项错误;图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面,可能导致加热不充分,试管2中蓝色变化不明显,B项正确;图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白质等杂质能溶于酒精,C项错误;图2中的试管1起对照作用,目的是证明在沸水浴条件下,物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色,而DNA遇二苯胺出现蓝色,D项错误。
方法突破1.与DNA有关的几种酶的比较
2.图解限制酶的选择原则
3.DNA的粗提取与鉴定实验中的注意事项
考向探究考向1结合目的基因的筛选与获取,考查科学思维能力1.(2022福建上杭一中一模)Kisspeptin(Kp)是脊椎动物的一种肽类激素,对下丘脑分泌促性腺激素释放激素(GnRH)的神经元有活化作用。研究者为探究Kp、GnRH以及GnRH受体的相关基因在下丘脑和垂体中的表达情况,提取下丘脑和垂体中的RNA,采用RT-PCR扩增DNA(RT是反转录)进行检测。下列叙述错误的是( )A.RT-PCR过程需要的酶有反转录酶、耐高温的DNA聚合酶B.PCR扩增时能以相关基因的mRNA的核苷酸序列为依据设计引物C.检测RT-PCR的产物可采用DNA分子杂交和荧光分子杂交技术D.可检测到Kp、GnRH、GnRH受体相关基因均在下丘脑中表达量最高
答案 D 解析 RT-PCR是指以RNA为模板通过逆转录合成cDNA,并对cDNA进行PCR扩增的过程,所以RT-PCR过程需要的酶有反转录酶、耐高温的DNA聚合酶,A项正确;PCR扩增时,引物要与目的基因结合,根据碱基互补配对原则,引物也能与目的基因的mRNA结合,所以能以相关基因的mRNA的核苷酸序列为依据设计引物,B项正确;RT-PCR的产物是DNA,检测RT-PCR的产物可根据碱基互补配对原则,采用DNA分子杂交和荧光分子杂交技术,C项正确;根据题意,Kp和GnRH的受体基因在下丘脑中表达量会比较高,但GnRH受体基因应该是在性腺中的表达较高,因为性腺细胞才是GnRH的靶细胞,D项错误。
考向2结合基因表达载体的构建,考查科学实践能力2.(2022天津南开中学联考)右图为基因表达载体的模式图,下列有关基因工程中载体的说法,错误的是( )A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B.基因表达载体的构建并不一定相同C.图中启动子位于目的基因的首端,是核糖体识别和结合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
答案 C 解析 由于受体细胞有植物、动物、微生物之分,以及目的基因导入受体细胞的方法不同,因此基因表达载体的构建也会有所差别,不可能是千篇一律的;启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于目的基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA。
考向3结合将目的基因导入不同受体细胞的操作,考查科学实践能力3.(2022适应性考试辽宁卷)菊花是一种双子叶植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长,还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述错误的是( )A.受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞B.将目的基因GNA插入Ti质粒的T-DNA上构建表达载体C.菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞D.应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
答案 A 解析 据题意可知,要想获得转GNA基因菊花,应选择菊花的体细胞作为受体细胞,A项错误;基因工程中构建表达载体时,由于T-DNA可以转移到受体细胞内,可以将目的基因GNA插入Ti质粒的T-DNA上,B项正确;菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞,有利于目的基因成功导入,C项正确;已知雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长,故应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度,D项正确。
考向4结合目的基因的检测与鉴定,考查生命观念4.(2022山西太原模拟)核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA片段)导入动物体细胞内,通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防或治疗相应疾病的一类新型疫苗。研究表明核酸疫苗不仅具有良好的免疫原性与安全性,且由于核酸更易于修饰与改造,较以往蛋白疫苗具有更大的灵活性和更广阔的应用前景。请回答下列问题。
(1)研发DNA疫苗时,构建含有病原体抗原基因表达载体的过程中需要用到的工具酶有 。 (2)图中所用的载体是 ,构建基因表达载体的目的是 ,基因表达载体中,驱动病原体抗原基因转录的结构为 。 (3)mRNA疫苗可以由计算机设计、制造并通过高速机器大批量生产。目前用于制造疫苗的RNA有两种,非复制型mRNA和自我扩增型mRNA,从图中可以看出,自我扩增型mRNA的优点是可在细胞内 。mRNA常被包裹在脂质体颗粒中注射到相关人员的手臂肌肉中,脂质体颗粒的作用是 。
(4)病毒核酸检测试剂盒通常以病毒独特的基因序列为检测靶标。PCR扩增时每一个循环分为 3步,使靶标DNA序列呈指数增加。每一个扩增出来的DNA序列都与预先加入的一段荧光标记 结合,产生荧光信号,扩增出来的靶标DNA序列越多,累积的荧光信号就越强。在没有病毒的样本中,因为没有靶标DNA序列扩增,所以就检测不到荧光信号。
答案 (1)限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶(2)质粒 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用 启动子(3)大量复制,提高蛋白质合成效率 保护mRNA,防止其被酶降解 (4)变性、复性、延伸 探针
解析 (1)构建基因表达载体的过程中需要用到的工具酶有限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶。(2)图中所用的质粒可以充当运载体,构建基因表达载体可以使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体中的启动子可以驱动目的基因的转录。(3)从图中可以看出,自我扩增型mRNA可在细胞内大量复制,提高蛋白质合成效率。mRNA常被包裹在脂质体颗粒中注射到相关人员的手臂肌肉中,其中的脂质体颗粒可以保护mRNA,防止其被酶降解。(4)PCR扩增时每一个循环分为变性、复性、延伸3步,使靶标DNA序列呈指数增加。每一个扩增出来的DNA序列都与预先加入的一段荧光标记探针结合,产生荧光信号,扩增出来的靶标DNA序列越多,累积的荧光信号就越强。
方法突破1.目的基因的获取方法(1)利用PCR获取和扩增目的基因。(2)人工合成目的基因①反转录法:主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:目的基因的mRNA 双链DNA(目的基因)
②化学合成法:依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:
(3)从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA,以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
2.启动子≠起始密码子,终止子≠终止密码子(1)启动子是位于基因首端的一段特殊序列,它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列,作用是使转录过程停止。(2)起始密码子和终止密码子均位于mRNA上,分别控制翻译过程的启动和终止。3.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
PCR技术知识储备1.PCR技术的过程
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)原理①PCR原理:DNA热变性原理。
(2)方法步骤①PCR扩增 使挂在管壁上的液体全部甩下准备➡移液➡混合➡离心➡反应②鉴定PCR产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
(3)使用提示①为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②该实验所需材料可以直接从公司购买,缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。③在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。④在进行操作时,一定要戴好一次性手套。⑤观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
专项突破典例.(2020江苏)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcRⅠ酶切为例)。
请据图回答问题。(1)步骤Ⅰ用的EcRⅠ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到90 ℃是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。 A.5'-AACTATGCG----AGCCCTT-3'B.5'-AATTCCATG----CTGAATT-3'C.5'-GCAATGCGT----TCGGGAA-3'D.5'-TTGATACGC----CGAGTAC-3'
答案 (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列(2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸(3)②④(4)B解析 (1)由图可知,EcRⅠ将DNA分子切出两个黏性末端,可判断EcRⅠ是一种限制性内切核酸(或限制)酶;限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成磷酸二酯键;PCR扩增DNA的过程包括变性、复性和延伸,高温90 ℃变性是为了破坏碱基对之间的氢键,获得DNA单链,TaqDNA聚合酶能够催化以DNA为模板的DNA子链沿引物的3'端延伸。
(3)引物是一小段单链DNA,引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对,可作为DNA复制的起始点,子链的延伸方向为5'→3'。据题图分析,结合已知序列可知,能与片段F左边配对的引物为④,与右边配对的引物为②,故步骤Ⅲ选用的PCR引物应为②④。(4)对PCR产物测序,得到了片段F的完整序列,由于片段F具有被限制酶EcRⅠ剪切的黏性末端,EcRⅠ识别的序列是GAATTC,且在G与A之间切割,所以5'端应该是AATTC,3'端是GAATT。
专项训练1.(2022湖北)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生,以下措施中有效的是( )A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间D.提高复性的温度
答案 D 解析 增加模板DNA的量可以提高反应速度,但不能有效减少非特异条带的产生,A项不符合题意;延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程,但对于延伸中的配对影响不大,故不能有效减少反应非特异条带的产生,B、C两项不符合题意;非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低,造成引物与模板的结合位点增加,故可通过提高复性的温度来减少反应非特异条带的产生,D项符合题意。
2.(2022湖北开学考试)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量,其原理是:在PCR反应体系中加入引物的同时,加入与某条模板链互补的荧光探针,当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如下图)。下列说法不正确的是( )A.该技术的原理是DNA的体外复制,需要用到解旋酶和Taq酶B.该技术需要用到一对引物,且引物之间的碱基序列不能互补C.该技术中DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链D.若循环次数相同,荧光值越高,证明新冠病毒感染程度越高
答案 A 解析 PCR技术用的原理是DNA的体外复制,其中双链解聚靠的是高温,不需要解旋酶,A项错误;PCR技术用到的引物之间的碱基序列不能互补,以免影响引物与模板链的结合,B项正确;DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链,C项正确;循环次数相同时,荧光值越高,证明感染的新冠病毒越多,感染程度越高,D项正确。
3.(2022江苏连云港模拟)常用的PCR技术有实时荧光定量PCR、RT-PCR、重叠延伸PCR等,其中重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因的合理改造,过程如下图所示。回答下列问题。
(1)PCR定点突变需要设计的引物是 ;②过程获得突变产物AD,需要使用的引物是 。 (2)在第一阶段,为获得产物AB和产物CD,必须将引物a、b和引物c、d置于不同反应系统中,这是因为 。 (3)新冠病毒常用“荧光RT-PCR技术”进行检测。①“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有 、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。 ②用 向微量离心管中依次加入各组分,稍微进行 ,使反应液集中在微量离心管底部,将微量离心管放入PCR仪,设定好PCR仪的循环程序,进行PCR反应。
(4)在检测过程中,随着PCR的进行,反应产物不断累积,“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加。可通过荧光强度的变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。①“平台期”出现的最可能的原因是 。
②理论上,在检测过程中有荧光标记的“杂交双链”出现,则说明检测结果呈 (填“阴”或“阳”)性,但为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本,检测时都出现了上述形态的曲线,但甲的A点比乙的A点明显左移。请对这种结果做出科学合理的解释(试剂盒合格且正常,操作过程规范且准确)。
答案 (1)引物b和引物c 引物a和引物d (2)引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对,在一个反应系统中配对后失效 (3)逆(反)转录酶、热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 微量移液器 离心 (4)试剂盒中的原料、引物和探针数量一定,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链”不再增加 阳 甲样本中的新冠病毒含量更高,达到阈值所需的循环数更少解析 (1)由题图中信息可知,定点突变位点在引物b和引物c的结合位点处,而引物a与引物b是合成产物AB的引物,引物c和引物d是合成产物CD的引物,因此需要设计引物b和引物c,使它们不发挥作用才可以得到突变产物AD;②过程获得突变引物AD是由产物AB上链延伸与CD下链延伸得到的,因此需要使用的引物是引物a和引物d。
一、重组DNA技术的基本工具1.基因工程的概念理解
2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶(限制酶)
一种特定的脱氧核苷酸序列
具有专一性①限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成;后者是双链序列。②判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°,同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。 不是氢键③限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。④在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次此DNA分子。
(3)基因进入受体细胞的载体 不仅仅是质粒
3.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理
旁栏边角1.(选择性必修3,第72页,“旁栏思考”)DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
2.(选择性必修3,第74页,“拓展应用1”)为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子?
提示 不是。DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
提示 细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA,是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。
易错辨析基于对重组DNA技术的基本工具的理解,判断下列表述是否正确。(1)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。( )(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。( )(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。( )(4)E.cli DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。( )(5)当作载体的质粒DNA分子上应至少含一个限制酶切割位点。( )(6)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中,使之稳定存在并表达。( )
二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取(1)筛选合适的目的基因①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变 或获得 等的基因。主要是指 的基因。②筛选目的基因的方法:从相关的已知 清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 (2)利用PCR获取和扩增 ①原理: 。
引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
维持反应体系pH稳定
③过程:PCR过程包括 、复性和 三步
(3)结果:DNA分子以 扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。(4)说明①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的 ,又可为DNA的合成提供能量。 ②引物既可以是DNA单链,也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时,也需要引物,一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲溶液中一般都要添加Mg2+。
(5)PCR技术和DNA复制的比较
2.基因表达载体的构建 基因工程的核心内容(1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中 ,并且可以 给下一代。 ②使目的基因能够 和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
(3)基因表达载体的构建过程
3.将目的基因导入受体细胞
提醒导入目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
旁栏边角1.(选择性必修3,第79页,“思考”改编)PCR可以扩增mRNA吗?利用PCR扩增目的基因时,为什么要用2种不同的引物?
提示 不可以,因为PCR是用DNA双链作模板的,不能直接用单链RNA作PCR,必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再作PCR。DNA是两条反向平行的双链,而复制时只能从固定的方向(模板链的3'端)开始,所以引物的碱基序列是不同的。
2.(选择性必修3,第80页,“正文”改编)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶?是否只能用同一种限制酶?
提示 选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端,可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。
易错辨析基于对基因工程的基本操作程序的理解,判断下列表述是否正确。(1)用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。( )(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。( )(3)将目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。( )(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。( )(5)应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。( )
长句应答1.为什么不直接把目的基因导入受体细胞,而要用载体?
提示 游离的DNA片段进入受体细胞,一般会被直接分解,就算可以进行转录并翻译成蛋白质,游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体,由于载体可以在细胞内复制,随着细胞分裂,载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样,基因工程才有意义。
2.新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测原理是什么?
提示 新型冠状病毒核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒的医疗检测用品,它的工作原理是通过提取病人样本中的RNA,进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大,最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性,那么就可以认为样本中存在病毒(已经感染),反之表明样本中没有病毒(未感染)。
考向探究考向1结合基因工程所需工具酶,考查科学实践中的探究能力1.(2022辽宁抚顺一模)某质粒分子其中一条链的部分核苷酸序列为—CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA—,限制酶EcRⅠ在单链上的识别序列为—GAATTC—。下列叙述正确的是( )A.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定位点断开DNAB.用EcRⅠ酶切割该质粒,至少会产生2个片段C.与其互补片段相比,该单链片段中A与T的和所占比例较大D.一个该质粒复制n次,得到的双链都是新合成的质粒有(2n-1)个
答案 A 解析 限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,A项正确;质粒是环状的,该质粒只有一个EcRⅠ酶切割位点,用EcRⅠ酶切割该质粒,会产生1个片段,B项错误;与其互补片段相比,该单链片段中的A和T与互补链中的A和T碱基配对,是互补的,它们所占比例一样,C项错误;一个该质粒复制n次,含母链的质粒有2个,其余都是新合成的质粒,得到的双链都是新合成的质粒有(2n-2)个,D项错误。
考向2结合载体的作用及特点,考查科学思维的能力2.(2022山东兰山模拟)下图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点,下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述,错误的是( )A.若通过PCR技术提取该目的基因应该选用引物甲和引物丙B.构建基因表达载体,可选用BamHⅠ剪切C.构建基因表达载体时为了防止目的基因和质粒的自身环化,可以选用BclⅠ和HindⅢ剪切D.在导入目的基因的受体细胞中,四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因不能同时表达
答案 B 解析 PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合,沿相反的方向合成子链,故所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙,A项正确;构建基因表达载体时,应至少保留一个完整的标记基因,便于目的基因的检测和筛选,图1中BamHⅠ同时切割两种标记基因,不能选用BamHⅠ剪切,B项错误;图2中目的基因左侧只能用BclⅠ切割,而质粒上没有目的基因右侧Sau3A的切点,两者都有HindⅢ的切点,为了防止目的基因与质粒自身环化,应选用BclⅠ和HindⅢ剪切质粒和目的基因,C项正确;在构建基因表达载体时,使用BclⅠ和HindⅢ 2种限制酶切割质粒,氨苄青霉素抗性基因被破坏,不能表达,四环素抗性基因能表达,D项正确。
3.(2022江西模拟)下图1所示为用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段示意图;图2所示为三种质粒示意图。图中AP为氨苄青霉素抗性基因,Tc为四环素抗性基因。EcRⅠ、PvuⅠ等为限制酶及其切割的位点。复制原点是在基因组上复制起始的一段序列,是指质粒在受体细胞中复制时的起点。
(1)组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架共同含有的元素是 。 (2)图2中质粒A、质粒C能否作为目的基因最理想的运载体? (填“能”或“否”),请说明理由。 。 (3)重组质粒成功导入受体细胞的概率一般为10-7,用质粒B构建重组质粒,为了筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌,在导入完成后,将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养,大肠杆菌在两种培养基中的生长状况不可能的是 ,可能性最大的是 。 (4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物,则需要将重组质粒导入山羊的 (细胞)中。
答案 (1)C、H、O、P(2)否 质粒A缺少标记基因;质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时,复制原点会被限制酶切割,会影响重组质粒的自主复制(3)在含四环素的培养基上能正常生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长 在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长(4)受精卵
解析 (1)脱氧核糖和磷酸交替连接构成DNA片段D的基本骨架,脱氧核糖由C、H、O 3种元素组成,组成磷酸的元素是H、P、O;磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架,磷脂分子是由C、H、O、N、P组成;可见,组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架共同含有的元素是C、H、O、P。(2)分析图2可知,质粒A缺少标记基因,质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时,复制原点会被限制酶切割,进而影响重组质粒的自主复制,所以质粒A、质粒C均不能作为目的基因最理想的运载体。
(3)用质粒B构建重组质粒,当用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割时, Tc(四环素抗性基因)遭到破坏,而AP(氨苄青霉素抗性基因)结构完好,因此在重组质粒导入完成后,将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养,大肠杆菌在两种培养基中的生长状况不可能的是在含四环素的培养基上能正常生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长。因重组质粒成功导入受体细胞的概率一般为10-7,所以可能性最大的是在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物,则需要将重组质粒导入山羊的受精卵中。
考向3DNA的提取和鉴定4.(2022贵州遵义模拟)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图,相关叙述正确的是( )A.图1中溶液a是物质的量浓度为0.14 ml/L的NaCl溶液B.图2所示实验操作中有一处明显错误,可能导致试管2中蓝色变化不明显C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白质等杂质不溶D.图2中的试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
答案 B 解析 图1中的溶液a是研磨液的上清液,A项错误;图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面,可能导致加热不充分,试管2中蓝色变化不明显,B项正确;图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白质等杂质能溶于酒精,C项错误;图2中的试管1起对照作用,目的是证明在沸水浴条件下,物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色,而DNA遇二苯胺出现蓝色,D项错误。
方法突破1.与DNA有关的几种酶的比较
2.图解限制酶的选择原则
3.DNA的粗提取与鉴定实验中的注意事项
考向探究考向1结合目的基因的筛选与获取,考查科学思维能力1.(2022福建上杭一中一模)Kisspeptin(Kp)是脊椎动物的一种肽类激素,对下丘脑分泌促性腺激素释放激素(GnRH)的神经元有活化作用。研究者为探究Kp、GnRH以及GnRH受体的相关基因在下丘脑和垂体中的表达情况,提取下丘脑和垂体中的RNA,采用RT-PCR扩增DNA(RT是反转录)进行检测。下列叙述错误的是( )A.RT-PCR过程需要的酶有反转录酶、耐高温的DNA聚合酶B.PCR扩增时能以相关基因的mRNA的核苷酸序列为依据设计引物C.检测RT-PCR的产物可采用DNA分子杂交和荧光分子杂交技术D.可检测到Kp、GnRH、GnRH受体相关基因均在下丘脑中表达量最高
答案 D 解析 RT-PCR是指以RNA为模板通过逆转录合成cDNA,并对cDNA进行PCR扩增的过程,所以RT-PCR过程需要的酶有反转录酶、耐高温的DNA聚合酶,A项正确;PCR扩增时,引物要与目的基因结合,根据碱基互补配对原则,引物也能与目的基因的mRNA结合,所以能以相关基因的mRNA的核苷酸序列为依据设计引物,B项正确;RT-PCR的产物是DNA,检测RT-PCR的产物可根据碱基互补配对原则,采用DNA分子杂交和荧光分子杂交技术,C项正确;根据题意,Kp和GnRH的受体基因在下丘脑中表达量会比较高,但GnRH受体基因应该是在性腺中的表达较高,因为性腺细胞才是GnRH的靶细胞,D项错误。
考向2结合基因表达载体的构建,考查科学实践能力2.(2022天津南开中学联考)右图为基因表达载体的模式图,下列有关基因工程中载体的说法,错误的是( )A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B.基因表达载体的构建并不一定相同C.图中启动子位于目的基因的首端,是核糖体识别和结合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
答案 C 解析 由于受体细胞有植物、动物、微生物之分,以及目的基因导入受体细胞的方法不同,因此基因表达载体的构建也会有所差别,不可能是千篇一律的;启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于目的基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA。
考向3结合将目的基因导入不同受体细胞的操作,考查科学实践能力3.(2022适应性考试辽宁卷)菊花是一种双子叶植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长,还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述错误的是( )A.受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞B.将目的基因GNA插入Ti质粒的T-DNA上构建表达载体C.菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞D.应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
答案 A 解析 据题意可知,要想获得转GNA基因菊花,应选择菊花的体细胞作为受体细胞,A项错误;基因工程中构建表达载体时,由于T-DNA可以转移到受体细胞内,可以将目的基因GNA插入Ti质粒的T-DNA上,B项正确;菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞,有利于目的基因成功导入,C项正确;已知雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长,故应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度,D项正确。
考向4结合目的基因的检测与鉴定,考查生命观念4.(2022山西太原模拟)核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA片段)导入动物体细胞内,通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防或治疗相应疾病的一类新型疫苗。研究表明核酸疫苗不仅具有良好的免疫原性与安全性,且由于核酸更易于修饰与改造,较以往蛋白疫苗具有更大的灵活性和更广阔的应用前景。请回答下列问题。
(1)研发DNA疫苗时,构建含有病原体抗原基因表达载体的过程中需要用到的工具酶有 。 (2)图中所用的载体是 ,构建基因表达载体的目的是 ,基因表达载体中,驱动病原体抗原基因转录的结构为 。 (3)mRNA疫苗可以由计算机设计、制造并通过高速机器大批量生产。目前用于制造疫苗的RNA有两种,非复制型mRNA和自我扩增型mRNA,从图中可以看出,自我扩增型mRNA的优点是可在细胞内 。mRNA常被包裹在脂质体颗粒中注射到相关人员的手臂肌肉中,脂质体颗粒的作用是 。
(4)病毒核酸检测试剂盒通常以病毒独特的基因序列为检测靶标。PCR扩增时每一个循环分为 3步,使靶标DNA序列呈指数增加。每一个扩增出来的DNA序列都与预先加入的一段荧光标记 结合,产生荧光信号,扩增出来的靶标DNA序列越多,累积的荧光信号就越强。在没有病毒的样本中,因为没有靶标DNA序列扩增,所以就检测不到荧光信号。
答案 (1)限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶(2)质粒 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用 启动子(3)大量复制,提高蛋白质合成效率 保护mRNA,防止其被酶降解 (4)变性、复性、延伸 探针
解析 (1)构建基因表达载体的过程中需要用到的工具酶有限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶。(2)图中所用的质粒可以充当运载体,构建基因表达载体可以使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体中的启动子可以驱动目的基因的转录。(3)从图中可以看出,自我扩增型mRNA可在细胞内大量复制,提高蛋白质合成效率。mRNA常被包裹在脂质体颗粒中注射到相关人员的手臂肌肉中,其中的脂质体颗粒可以保护mRNA,防止其被酶降解。(4)PCR扩增时每一个循环分为变性、复性、延伸3步,使靶标DNA序列呈指数增加。每一个扩增出来的DNA序列都与预先加入的一段荧光标记探针结合,产生荧光信号,扩增出来的靶标DNA序列越多,累积的荧光信号就越强。
方法突破1.目的基因的获取方法(1)利用PCR获取和扩增目的基因。(2)人工合成目的基因①反转录法:主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:目的基因的mRNA 双链DNA(目的基因)
②化学合成法:依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:
(3)从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA,以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
2.启动子≠起始密码子,终止子≠终止密码子(1)启动子是位于基因首端的一段特殊序列,它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列,作用是使转录过程停止。(2)起始密码子和终止密码子均位于mRNA上,分别控制翻译过程的启动和终止。3.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
PCR技术知识储备1.PCR技术的过程
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)原理①PCR原理:DNA热变性原理。
(2)方法步骤①PCR扩增 使挂在管壁上的液体全部甩下准备➡移液➡混合➡离心➡反应②鉴定PCR产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
(3)使用提示①为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②该实验所需材料可以直接从公司购买,缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。③在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。④在进行操作时,一定要戴好一次性手套。⑤观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
专项突破典例.(2020江苏)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcRⅠ酶切为例)。
请据图回答问题。(1)步骤Ⅰ用的EcRⅠ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到90 ℃是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。 A.5'-AACTATGCG----AGCCCTT-3'B.5'-AATTCCATG----CTGAATT-3'C.5'-GCAATGCGT----TCGGGAA-3'D.5'-TTGATACGC----CGAGTAC-3'
答案 (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列(2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸(3)②④(4)B解析 (1)由图可知,EcRⅠ将DNA分子切出两个黏性末端,可判断EcRⅠ是一种限制性内切核酸(或限制)酶;限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成磷酸二酯键;PCR扩增DNA的过程包括变性、复性和延伸,高温90 ℃变性是为了破坏碱基对之间的氢键,获得DNA单链,TaqDNA聚合酶能够催化以DNA为模板的DNA子链沿引物的3'端延伸。
(3)引物是一小段单链DNA,引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对,可作为DNA复制的起始点,子链的延伸方向为5'→3'。据题图分析,结合已知序列可知,能与片段F左边配对的引物为④,与右边配对的引物为②,故步骤Ⅲ选用的PCR引物应为②④。(4)对PCR产物测序,得到了片段F的完整序列,由于片段F具有被限制酶EcRⅠ剪切的黏性末端,EcRⅠ识别的序列是GAATTC,且在G与A之间切割,所以5'端应该是AATTC,3'端是GAATT。
专项训练1.(2022湖北)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生,以下措施中有效的是( )A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间D.提高复性的温度
答案 D 解析 增加模板DNA的量可以提高反应速度,但不能有效减少非特异条带的产生,A项不符合题意;延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程,但对于延伸中的配对影响不大,故不能有效减少反应非特异条带的产生,B、C两项不符合题意;非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低,造成引物与模板的结合位点增加,故可通过提高复性的温度来减少反应非特异条带的产生,D项符合题意。
2.(2022湖北开学考试)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量,其原理是:在PCR反应体系中加入引物的同时,加入与某条模板链互补的荧光探针,当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如下图)。下列说法不正确的是( )A.该技术的原理是DNA的体外复制,需要用到解旋酶和Taq酶B.该技术需要用到一对引物,且引物之间的碱基序列不能互补C.该技术中DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链D.若循环次数相同,荧光值越高,证明新冠病毒感染程度越高
答案 A 解析 PCR技术用的原理是DNA的体外复制,其中双链解聚靠的是高温,不需要解旋酶,A项错误;PCR技术用到的引物之间的碱基序列不能互补,以免影响引物与模板链的结合,B项正确;DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链,C项正确;循环次数相同时,荧光值越高,证明感染的新冠病毒越多,感染程度越高,D项正确。
3.(2022江苏连云港模拟)常用的PCR技术有实时荧光定量PCR、RT-PCR、重叠延伸PCR等,其中重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因的合理改造,过程如下图所示。回答下列问题。
(1)PCR定点突变需要设计的引物是 ;②过程获得突变产物AD,需要使用的引物是 。 (2)在第一阶段,为获得产物AB和产物CD,必须将引物a、b和引物c、d置于不同反应系统中,这是因为 。 (3)新冠病毒常用“荧光RT-PCR技术”进行检测。①“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有 、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。 ②用 向微量离心管中依次加入各组分,稍微进行 ,使反应液集中在微量离心管底部,将微量离心管放入PCR仪,设定好PCR仪的循环程序,进行PCR反应。
(4)在检测过程中,随着PCR的进行,反应产物不断累积,“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加。可通过荧光强度的变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。①“平台期”出现的最可能的原因是 。
②理论上,在检测过程中有荧光标记的“杂交双链”出现,则说明检测结果呈 (填“阴”或“阳”)性,但为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本,检测时都出现了上述形态的曲线,但甲的A点比乙的A点明显左移。请对这种结果做出科学合理的解释(试剂盒合格且正常,操作过程规范且准确)。
答案 (1)引物b和引物c 引物a和引物d (2)引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对,在一个反应系统中配对后失效 (3)逆(反)转录酶、热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 微量移液器 离心 (4)试剂盒中的原料、引物和探针数量一定,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链”不再增加 阳 甲样本中的新冠病毒含量更高,达到阈值所需的循环数更少解析 (1)由题图中信息可知,定点突变位点在引物b和引物c的结合位点处,而引物a与引物b是合成产物AB的引物,引物c和引物d是合成产物CD的引物,因此需要设计引物b和引物c,使它们不发挥作用才可以得到突变产物AD;②过程获得突变引物AD是由产物AB上链延伸与CD下链延伸得到的,因此需要使用的引物是引物a和引物d。
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