[高中生物一轮复习讲义   选修1]

第31讲 微生物的培养与应用

考点一 培养基及微生物的纯化培养技术

1．培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

(1)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。

(2)种类

①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。

②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。

③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。

④下表为某微生物培养基的成分举例

该培养基中可以为微生物提供碳源的是葡萄糖，此培养基为固体培养基，因此培养基中加入了琼脂。

2．无菌技术：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。常用方法如下图：

3．大肠杆菌的纯化培养

(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

①计算

②称量

③溶化

④灭菌

⑤倒平板

(2)纯化大肠杆菌

①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。

②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。

③常用的微生物接种方法有两种

a．平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落。

b．稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

④纯化微生物的接种方法的比较

4．菌种的保存方法

(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

考点二 微生物的筛选和计数

1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

(2)统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。

①统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数。

③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。

用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ，这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

(3)实验流程：

2．分解纤维素的微生物的分离

(1)纤维素酶

①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

②作用

(2)纤维素分解菌的筛选

①原理

②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

④实验流程

3．筛选微生物的两个实例比较

4．微生物两种计数方法的比较

考点三　微生物的筛选与鉴别

1．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

(2)作用

2．菌种筛选

(1)方法：刚果红染色法。

(2)原理

即：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

3．筛选流程

4．微生物的鉴别方法

(1)菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。

(2)指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。

(3)染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。

5．筛选微生物的三种方法

(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。

(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。

(3)鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。

6．选择培养基四种常见制备方法或实例

1．如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：

(1)图甲是利用________法进行微生物接种，图乙是利用________法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精消毒。

(2)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？

________________________________________________________________________

________________________________。

(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？___________________________。

(4)如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填“图甲”或“图乙”)。

[答案](1)平板划线　稀释涂布平板　接种环　涂布器　灼烧灭菌

(2)火焰附近存在着无菌区域

(3)避免培养过程产生的水分影响微生物的生长

(4)图乙

[解析]图甲和图乙分别是平板划线法和稀释涂布平板法，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器。由于在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。在微生物培养过程中会产生水，对微生物的生长造成影响，故需要倒置培养。

2．牛奶是微生物生长的良好培养基。牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物。为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：

(1)巴氏消毒的方法是_____________________________________________________，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是________。

(2)取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是下图中的________。

(3)图中所示方法为稀释培养法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为________个，运用这种方法统计的结果往往较实际值________(填“偏大”或“偏小”)，原因是_______________________________________________________________________。

(4)从生牛奶取样培养得到的菌落中，混有各种杂菌，从中检测大肠杆菌的方法是在培养基中加入________，菌落具有______________________特征的可以认定为大肠杆菌。

[答案](1)70～75 ℃煮30分钟(或80 ℃煮15分钟)　牛奶的营养成分不被破坏　(2)B　(3)3.4×106　偏小　个别菌落可能是由2个或多个细菌形成的　(4)伊红—美蓝　(金属光泽的紫)黑色

3．莠去津是一种含氮农药，在土壤中不易降解，为修复被其污染的土壤，可按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。请据图回答：(已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明)

(1)由图推断，从A瓶到C瓶液体培养的过程称为________，目的是______________。

(2)在将C瓶菌种接种到固体培养基之前通常要进行________，将菌种接种到固体培养基的方法有平板划线法和________法，从图中看本实验采用的是________(填“前者”或“后者”)。

(3)一段时间后，培养基出现无透明圈和有透明圈两种菌落，我们筛选的目的菌是________菌落中的细菌，该菌落生长所需的氮元素主要来源于________。

(4)为弄清固体培养基中的非目的菌来自C瓶菌种还是培养基，应如何设置对照组？____________。

[答案](1)选择培养　初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并增加其数量

(2)梯度稀释　稀释涂布平板　后者

(3)有透明圈　莠去津

(4)配制的培养基灭菌后不接种菌种，与实验组放在相同条件下培养

[解析](1)图中从A瓶到C瓶液体培养过程为选择培养，目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并增加其数量。(2)将菌种接种到固体培养基的方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种，由图中固体培养基上的菌落分布比较均匀可知，该接种方法是稀释涂布平板法，包括梯度稀释操作和涂布平板操作。(3)根据题目信息“莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明”可知，能够降解莠去津的目的菌分解莠去津，使菌落周围出现透明圈，因此可以选择菌落周围存在透明圈的细菌。由于培养基中只有莠去津一种氮源，因此分解莠去津的微生物所需的氮源主要由莠去津提供。(4)为弄清固体培养基中的非目的菌来自C瓶菌种还是培养基，应设置灭菌后不接种菌种的空白培养基，与实验组放在相同条件下培养，若培养基上无菌落出现，则非目的菌一定来自C瓶菌种，若培养基上出现菌落，则说明非目的菌可能来自培养基。

4．高温淀粉酶在大规模工业生产中是极为重要的酶制剂。研究者从热泉中筛选出了能高效产生高温淀粉酶的嗜热菌。其筛选过程如图所示。

(1)进行①过程的目的是________嗜热菌培养液；②过程所使用的接种方法是________。

(2)Ⅰ、Ⅱ号培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是________；对培养基常用________方法进行灭菌。对于空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能________，如果要检测灭菌是否彻底，可以采用的方法是：将灭菌过的培养基在适宜的温度下放置一段时间，________________。

(3)部分嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈；应挑出透明圈________(填“大”或“小”)的菌落，接种到Ⅱ号培养基。

[答案](1)稀释　稀释涂布平板法　(2)先调节pH，后灭菌　高压蒸汽灭菌　损伤DNA的结构　观察培养基上是否有菌落产生　(3)淀粉酶　大

[解析](1)分析题图可知，①过程是梯度稀释，目的是对样品进行稀释；②过程是用稀释涂布平板法进行接种。(2)培养基配制和灭菌时应先调节pH，然后再进行灭菌，如果先灭菌再调节pH时，又会污染培养基；紫外线对DNA分子有损伤作用，且能使蛋白质变性，所以常用来作为对空气灭菌的方法；检测灭菌效果的方法就是将灭菌过的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。(3)能分解淀粉的嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放淀粉酶，分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，透明圈越大淀粉酶的活性越强，所以要从中挑出透明圈大的菌落，接种到Ⅱ号培养基上。

5．欲从土壤中筛选出能产生脲酶的微生物并予以纯化计数，采用了如图所示的基本操作流程。请回答下列问题：

(1)取得土样后应先用________(填试剂)对土壤进行梯度稀释，然后将稀释液涂布在平面培养基上，这种选择培养基在营养组成上的重要特点是__________________。在这样的培养基上长出的细菌________(填“一定”或“不一定”)都能产生脲酶。若在平板中加入酚红，目的菌落出现的变化是__________________。

(2)若要对相应微生物进行计数，一个稀释度应涂布2到3个平板，并计算________。若稀释度不够高，所得的数据与实际值比较应________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。经涂布获得的菌落可以采用平板划线法进一步纯化，每次划线后接种环必须________，才能再次用于划线。获得的纯化菌种可以保存在试管中，塞上棉塞或盖上封口膜，不能密封，原因是______________________。

[答案](1)无菌水　氮源只有尿素　不一定　菌落周围出现红圈　(2)平均值　偏小　灼烧　细菌有氧呼吸需要气体流通

6．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：

(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用________________法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于

________________________________________________________________________；

使用法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是

________________________________________________________________________。

(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？

________________________________________________________________________。

[答案](1)苯酚　A　稀释涂布平板

(2)④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基加入苯酚作为碳源　稀释涂布平板法或平板划线　防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基

(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作