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人教版 (2019)选择性必修3第3章 基因工程第1节 重组DNA技术的基本工具学案设计
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这是一份人教版 (2019)选择性必修3第3章 基因工程第1节 重组DNA技术的基本工具学案设计，共18页。学案主要包含了基因工程的概念，DNA重组技术的基本工具，DNA的粗提取与鉴定等内容，欢迎下载使用。
必备知识·夯实双基
一、基因工程的概念
1．操作场所：__生物体外__。
2．操作技术：__转基因__等技术。
3．操作结果：赋予生物新的__遗传特性__，创造出更符合人们需要的新的__生物类型__和生物产品。
4．操作水平：__DNA分子__水平。
二、DNA重组技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自__原核生物__。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定__核苷酸序列__，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__断开。
(3)结果：产生__黏性末端__或__平末端__。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__。
(2)种类[填表]
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)质粒
①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于__真核细胞的细胞核__或__原核细胞拟核DNA__之外，并具有__自我复制__能力的环状双链DNA分子。
②质粒适于作基因运载体的特点
Ⅰ．质粒分子上有一个至多个__限制酶切割__位点，供外源DNA片段插入其中。
Ⅱ．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中__进行自我复制__，或__整合到受体DNA上__，随
__受体细胞DNA__同步复制。
Ⅲ．人工改造的质粒常带有__标记基因__，便于__重组DNA分子的筛选__。
(2)噬菌体、动植物病毒等。
三、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
(1)__DNA__不溶于酒精，__蛋白质__溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于__2ml/L的NaCl__溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇__二苯胺__试剂会呈现蓝色。
2．实验步骤
(1)称取30g洋葱，切碎，加入10mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中垫__纱布__，将研磨液过滤到烧杯中，__4__ ℃处理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的__酒精__溶液，静置2～3min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
(4)取两支20ml的试管编号A、B，各加入2ml/L的__NaCl__溶液5mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4mL的__二苯胺试剂__。混匀后，将试管置于__沸水__中加热5min。
↓
(5)结果观察：A试管__不变蓝__，B试管__变蓝色__。
┃┃学霸记忆__■
1．基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
4．E．cliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。
5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
8．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
9．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
┃┃活学巧练__■
1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。(√)
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。(×)
3．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。(×)
4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。(√)
5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。(×)
6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。(√)
思考：
1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E．cliDNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
3．细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
4．如何检测(重组)质粒是否导入受体细胞？
提示：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
课内探究·名师点睛
知识点
限制性内切核酸酶(限制酶)—“分子手术刀”
1．作用特点
①切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，从而达到保护自身的目的。
②专一性：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2．作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
①黏性末端：错位切，在识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，产生的是黏性末端，如下图。
②平末端：平切，沿着识别序列的中心轴线切开，产生的是平末端，如下图。
3．限制酶的识别序列和切割末端的判断
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如右图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；eq \b\lc\(\a\vs4\al\c1(CCAGG,GGTCC))以eq \b\lc\(\a\vs4\al\c1(A,T))为轴，两侧碱基互补对称。
(2)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
┃┃典例剖析__■
典例1 下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是( A )
A．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
B．限制酶的活性受温度、pH的影响，总有一个最合适的条件
C．限制酶能破坏相邻脱氧核苷酸之间的化学键
D．限制酶不只存在于原核生物中，其合成场所是核糖体
解析：限制酶只能够识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列，不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列，A项错误；同其他的酶一样，限制酶同样受温度和pH的影响，而且具有发挥最大催化效率的最适温度和最适pH，B项正确；限制酶催化的是特定部位磷酸二酯键的断裂，属于水解反应，C项正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化，也有来自真核生物的，其本质是蛋白质，在核糖体上合成，D项正确。
┃┃变式训练__■
1．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHⅠ、EcRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列应该为( D )
A．BamHⅠ和EcRⅠ；末端互补序列为—AATT—
B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列为—GATC—
C．EcRⅠ和HindⅢ；末端互补序列为—AATT—
D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列为—GATC—
解析：A项中BamHⅠ切割出来的末端序列为—GATC—，EcRⅠ切割出来的末端序列为—AATT—，两者不能互补黏合；B项中HindⅢ切割出来的末端序列为—AGCT—，与BamHⅠ切割出的末端序列不能互补黏合；同理可推出C项所示两种限制酶所切割出来的末端也不能互补黏合，只有D项所示两种限制酶所切割出来的末端才能互补黏合。
知识点
与DNA分子相关的几种酶的分析
1．限制酶与DNA连接酶的比较
2．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
3．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位图解
(1)作用于磷酸二酯键的酶：限制酶(a断开)、DNA连接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a断开)。
(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶。
知识贴士
氢键的形成是由于分子间的作用力，其断裂与重新形成均与限制酶、DNA连接酶无关。
┃┃典例剖析__■
典例2 下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是( B )
A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接
解析：DNA连接酶和DNA聚合酶都能催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。
┃┃变式训练__■
2.1972年伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。下列相关叙述正确的是( B )
A．不同的DNA分子必须用同一种限制酶切割，才能产生相同的黏性末端
B．DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键
C．当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是平末端
D．限制酶和DNA连接酶的作用部位不同
解析：有些限制酶的识别序列不同，但可以产生相同的黏性末端，A项错误；DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键，B项正确；当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，C项错误；限制酶和DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，D项错误。
知识点
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．载体的功能
(1)作为运载工具将目的基因转运到宿主细胞内。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2．常用的载体——质粒
(1)存在场所：细菌、真菌等生物的细胞质。
(2)本质：环状DNA分子。
(3)特点：含有标记基因。
(4)载体必须具备的条件
①能在受体细胞内稳定保存并大量复制。
②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，以便进行筛选。
④载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
知识贴士
基因工程中的载体与载体蛋白的区别
┃┃典例剖析__■
典例3 作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( A )
A．能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对受体细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
解析：作为载体必须能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便受体细胞能进行正常的生命活动，D错误。
┃┃变式训练__■
3．下列关于质粒运载体的说法，正确的是( A )
①使用质粒运载体是为了把目的基因导入受体细胞并使之在受体细胞中稳定存在
②质粒运载体只能与目的基因重组后进入细胞
③质粒运载体可能是根据细菌或者病毒的DNA改造的
④质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则
⑤质粒运载体只有把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达
⑥没有限制酶就无法使用质粒运载体
A．①④⑥ B．②③④
C．①②⑤D．③④⑥
解析：使用质粒运载体是为了把目的基因导入受体细胞，并使目的基因在宿主细胞中稳定保存，①正确；质粒运载体本身也可以进入细胞，不是与目的基因重组后才能进入细胞，②错误；质粒运载体可能是根据细菌DNA改造的，而病毒没有质粒，③错误；质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则，这是基因工程设计的原理之一，④正确；质粒运载体将目的基因导入受体细胞并稳定存在即可表达，不一定要把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达，⑤错误；质粒是环状DNA分子，将目的基因与质粒重组需要使用限制酶，因此没有限制酶就无法使用质粒运载体，⑥正确，综上所述①④⑥正确，故选A。
知识点
DNA的粗提取与鉴定
1．实验材料的选取
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。
2．方法步骤
(1)粗提取DNA
(2)鉴定DNA
特别提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质和脂质。
(2)不用哺乳动物的血液作为实验材料，这是因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，不含DNA。
(3)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(4)沉淀DNA时必须用冷酒精。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
┃┃典例剖析__■
典例4 下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( B )
A．该实验不能选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料
B．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它不溶于2ml·L－1的NaCl溶液
C．该实验中加入体积分数为95%的预冷酒精可用来析出DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热
解析：由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不能作为提取DNA的材料，A正确；DNA可溶解在2ml·L－1的NaCl溶液中，B错误；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此提取DNA时，加入预冷的、体积分数为95%的酒精溶液可以除去蛋白质、析出DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会呈现蓝色，D正确。
┃┃变式训练__■
4．在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述不正确的是( D )
A．实验材料选择错误的组别是丙
B．沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁
C．甲组实验现象差的原因是25℃的酒精溶液对DNA的凝集效果差
D．乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂
解析：鸡血、菜花细胞中都含有DNA，而猪是哺乳动物，其成熟的红细胞中不含DNA，A项正确；甲、乙、丁的实验材料中都含有DNA，但乙为植物，将植物细胞放入蒸馏水中时，植物细胞不会吸水涨破，且DNA应该用二苯胺鉴定，而不能用双缩脲试剂鉴定，因此沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁，但因为25℃的酒精溶液对DNA的凝集效果差，所以甲组蓝色浅，B、C项正确，D项错误。
指点迷津·拨云见日
选择限制酶的方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。
知识贴士
不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
┃┃典例剖析__■
典例5 利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如下图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是( D )
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
解析：构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A项正确；分析图甲，HindⅢ的酶切位点在第二个EcRⅠ的酶切位点的左侧，因此用EcRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B项正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcRⅠ的酶切位点，因此用EcRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条DNA单链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C项正确；用EcRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可正向连接或反向连接，不止能产生一种重组DNA，D项错误。
解疑答惑
从社会中来⇨P70
提示：用到的“分子工具”：限制性内切核酸酶、DNA连接酶、载体。限制性内切核酸酶的特征：准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。DNA连接酶的特征：能将目的基因连接到载体上。载体的特征：能将目的基因导入受体细胞中。
旁栏思考1⇨P71
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是其在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，限制酶就是一种防御性工具。当外源DNA入侵时，原核生物会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，从而保护自身的作用。
旁栏思考2⇨P72
提示：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E．cliDNA连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到的，称为T4DNA连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键(在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成)，那么，二者的差别主要表现如下：
(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。
此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。
思考·讨论⇨P73
1．提示：“剪刀”代表限制酶，“透明胶条”代表DNA连接酶。
2．提示：如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选择不对(也可能是其他原因)。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一定要具有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端；否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
3．提示：不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
探究·实践⇨P74
结果分析与评价
1．提示：观察提取的DNA颜色：如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺法鉴定：二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新提取。
2．提示：本实验提取的DNA粗制品中有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3．提示：本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
进一步探究
提示：DNA纯化常用方法：将DNA黏稠物再溶解，继续用物质的量浓度为2ml/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解，以免损失。用3～4层纱布进行过滤(或离心)，滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积分数为95%的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。
此外，还有许多其他方法。例如，添加质量分数为25%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24∶1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液。可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于酚层中，这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。
练习与应用⇨P74
一、概念检测
1．C 提示：DNA连接酶的作用是连接两个DNA分子片段，既能连接黏性末端，也能连接平末端，形成磷酸二酯键。DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
2．A 提示：基因工程中使用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。
二、拓展应用
1．提示：细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
2．提示：(1)限制酶XbaⅠ。因为限制酶XbaⅠ切割B片段产生的黏性末端与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的黏性末端相同。
(2)识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
训练巩固·课堂达标
1．下列叙述符合基因工程概念的是( B )
A．在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因与质粒重组后导入大肠杆菌，获得能产生人的干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后，其DNA整合到细菌DNA上
解析：基因工程又叫重组DNA技术，是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程不能在生物细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，A不符合基因工程的概念；将人的干扰素基因与质粒重组后导入大肠杆菌，获得能产生人的干扰素的菌株，B符合基因工程的概念；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株，属于诱变育种，C不符合基因工程的概念；自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌，并将自身DNA整合到细菌DNA上，属于基因重组，D不符合基因工程的概念。
2．下列关于限制性内切核酸酶(限制酶)的叙述，正确的是( C )
A．均来源于原核生物
B．识别序列均由6个核苷酸组成
C．特异性表现在识别和切割两个方面
D．也可识别RNA分子的特定核苷酸序列
解析：限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，B错误；限制酶能识别特定的核苷酸序列，并切割特定核苷酸之间的磷酸二酯键，C正确；限制酶可识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，不能识别RNA分子的特定核苷酸序列，D错误。
3．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是( B )
A．图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精
B．图①和图③都需要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持其结构完整
C．若图③操作后接图②操作，则DNA会留在滤液中
D．若图④操作后接图②操作，则DNA会留在纱布上
解析：DNA不溶于酒精，95%的冷酒精凝集效果最佳，所以图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精，以便除去溶于酒精的杂质，提取含杂质较少(或较纯净)的DNA，A正确；图①玻璃棒沿逆时针方向搅拌，目的是提取出含杂质较少的DNA，图③玻璃棒沿逆时针方向搅拌，目的是加速细胞吸水破裂，B错误；图③操作是加入蒸馏水，破碎细胞，图②操作是过滤，获取含DNA的滤液，使DNA留在滤液中，C正确；图④操作是去除滤液中杂质，析出DNA，图②操作是过滤，将DNA留在纱布上，D正确。
4．(不定项)以下关于基因工程的操作工具，说法错误的是( ABD )
A．限制酶可以切割DNA和RNA
B．DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来
C．载体的作用是将目的基因导入受体细胞使之稳定存在并表达
D．切割质粒的限制酶均能特异性地识别6个核苷酸
解析：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割位点上切割DNA分子，A错误；DNA连接酶的作用是将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来，B错误；载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达，C正确；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，D错误。
新课程标准
核心素养
1．简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3．进行DNA的粗提取与鉴定。
1．科学思维——模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。
2．社会责任——关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生了基因工程。
知识导图
种类
比较
E．cliDNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
__大肠杆菌__
__T4噬菌体__
特点
只能连接__黏性末端__
既可以连接黏性末端，又可以连接__平末端__
项目
限制酶
DNA连接酶
不同点
作用
使特定部位的磷酸二酯键断裂
在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键
应用
用于提取目的基因和切割载体
用于基因表达载体的构建
关系
种类
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
催化形成磷酸二酯键
不
同
点
模板
不需要模板
需要以DNA的一条链为模板
作用
过程
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键
作用
结果
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
用途
基因工程等
DNA复制
基因工程中的载体
载体蛋白
来源
细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒
细胞膜上的蛋白质
作用
将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制
运载要进出细胞的某些物质
试管编号
A(对照组)
B(实验组)
步骤1
2ml·L－1的NaCl溶液5mL
2ml·L－1的NaCl溶液5mL
步骤2
不进行任何处理
加丝状物或沉淀物
步骤3
加4mL二苯胺试剂，混匀
加4mL二苯胺试剂，混匀
步骤4
沸水浴5min
沸水浴5min
实验现象
溶液不变蓝色
溶液逐渐变为蓝色
实验结论
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
组别
实验材料
提取核物质时
加入的溶液
去除杂质时加入的溶液
DNA鉴定时
加入的试剂
甲
鸡血
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(25℃)
二苯胺
乙
菜花
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(冷却)
双缩脲试剂
丙
猪血
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(冷却)
二苯胺
丁
鸡血
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(冷却)
二苯胺
必备知识·夯实双基
一、基因工程的概念
1．操作场所：__生物体外__。
2．操作技术：__转基因__等技术。
3．操作结果：赋予生物新的__遗传特性__，创造出更符合人们需要的新的__生物类型__和生物产品。
4．操作水平：__DNA分子__水平。
二、DNA重组技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自__原核生物__。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定__核苷酸序列__，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__断开。
(3)结果：产生__黏性末端__或__平末端__。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__。
(2)种类[填表]
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)质粒
①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于__真核细胞的细胞核__或__原核细胞拟核DNA__之外，并具有__自我复制__能力的环状双链DNA分子。
②质粒适于作基因运载体的特点
Ⅰ．质粒分子上有一个至多个__限制酶切割__位点，供外源DNA片段插入其中。
Ⅱ．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中__进行自我复制__，或__整合到受体DNA上__，随
__受体细胞DNA__同步复制。
Ⅲ．人工改造的质粒常带有__标记基因__，便于__重组DNA分子的筛选__。
(2)噬菌体、动植物病毒等。
三、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
(1)__DNA__不溶于酒精，__蛋白质__溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于__2ml/L的NaCl__溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇__二苯胺__试剂会呈现蓝色。
2．实验步骤
(1)称取30g洋葱，切碎，加入10mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中垫__纱布__，将研磨液过滤到烧杯中，__4__ ℃处理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的__酒精__溶液，静置2～3min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
(4)取两支20ml的试管编号A、B，各加入2ml/L的__NaCl__溶液5mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4mL的__二苯胺试剂__。混匀后，将试管置于__沸水__中加热5min。
↓
(5)结果观察：A试管__不变蓝__，B试管__变蓝色__。
┃┃学霸记忆__■
1．基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
4．E．cliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。
5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
8．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
9．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
┃┃活学巧练__■
1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。(√)
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。(×)
3．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。(×)
4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。(√)
5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。(×)
6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。(√)
思考：
1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E．cliDNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
3．细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
4．如何检测(重组)质粒是否导入受体细胞？
提示：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
课内探究·名师点睛
知识点
限制性内切核酸酶(限制酶)—“分子手术刀”
1．作用特点
①切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，从而达到保护自身的目的。
②专一性：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2．作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
①黏性末端：错位切，在识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，产生的是黏性末端，如下图。
②平末端：平切，沿着识别序列的中心轴线切开，产生的是平末端，如下图。
3．限制酶的识别序列和切割末端的判断
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如右图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；eq \b\lc\(\a\vs4\al\c1(CCAGG,GGTCC))以eq \b\lc\(\a\vs4\al\c1(A,T))为轴，两侧碱基互补对称。
(2)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
┃┃典例剖析__■
典例1 下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是( A )
A．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
B．限制酶的活性受温度、pH的影响，总有一个最合适的条件
C．限制酶能破坏相邻脱氧核苷酸之间的化学键
D．限制酶不只存在于原核生物中，其合成场所是核糖体
解析：限制酶只能够识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列，不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列，A项错误；同其他的酶一样，限制酶同样受温度和pH的影响，而且具有发挥最大催化效率的最适温度和最适pH，B项正确；限制酶催化的是特定部位磷酸二酯键的断裂，属于水解反应，C项正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化，也有来自真核生物的，其本质是蛋白质，在核糖体上合成，D项正确。
┃┃变式训练__■
1．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHⅠ、EcRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列应该为( D )
A．BamHⅠ和EcRⅠ；末端互补序列为—AATT—
B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列为—GATC—
C．EcRⅠ和HindⅢ；末端互补序列为—AATT—
D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列为—GATC—
解析：A项中BamHⅠ切割出来的末端序列为—GATC—，EcRⅠ切割出来的末端序列为—AATT—，两者不能互补黏合；B项中HindⅢ切割出来的末端序列为—AGCT—，与BamHⅠ切割出的末端序列不能互补黏合；同理可推出C项所示两种限制酶所切割出来的末端也不能互补黏合，只有D项所示两种限制酶所切割出来的末端才能互补黏合。
知识点
与DNA分子相关的几种酶的分析
1．限制酶与DNA连接酶的比较
2．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
3．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位图解
(1)作用于磷酸二酯键的酶：限制酶(a断开)、DNA连接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a断开)。
(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶。
知识贴士
氢键的形成是由于分子间的作用力，其断裂与重新形成均与限制酶、DNA连接酶无关。
┃┃典例剖析__■
典例2 下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是( B )
A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接
解析：DNA连接酶和DNA聚合酶都能催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。
┃┃变式训练__■
2.1972年伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。下列相关叙述正确的是( B )
A．不同的DNA分子必须用同一种限制酶切割，才能产生相同的黏性末端
B．DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键
C．当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是平末端
D．限制酶和DNA连接酶的作用部位不同
解析：有些限制酶的识别序列不同，但可以产生相同的黏性末端，A项错误；DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键，B项正确；当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，C项错误；限制酶和DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，D项错误。
知识点
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．载体的功能
(1)作为运载工具将目的基因转运到宿主细胞内。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2．常用的载体——质粒
(1)存在场所：细菌、真菌等生物的细胞质。
(2)本质：环状DNA分子。
(3)特点：含有标记基因。
(4)载体必须具备的条件
①能在受体细胞内稳定保存并大量复制。
②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，以便进行筛选。
④载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
知识贴士
基因工程中的载体与载体蛋白的区别
┃┃典例剖析__■
典例3 作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( A )
A．能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对受体细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
解析：作为载体必须能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便受体细胞能进行正常的生命活动，D错误。
┃┃变式训练__■
3．下列关于质粒运载体的说法，正确的是( A )
①使用质粒运载体是为了把目的基因导入受体细胞并使之在受体细胞中稳定存在
②质粒运载体只能与目的基因重组后进入细胞
③质粒运载体可能是根据细菌或者病毒的DNA改造的
④质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则
⑤质粒运载体只有把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达
⑥没有限制酶就无法使用质粒运载体
A．①④⑥ B．②③④
C．①②⑤D．③④⑥
解析：使用质粒运载体是为了把目的基因导入受体细胞，并使目的基因在宿主细胞中稳定保存，①正确；质粒运载体本身也可以进入细胞，不是与目的基因重组后才能进入细胞，②错误；质粒运载体可能是根据细菌DNA改造的，而病毒没有质粒，③错误；质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则，这是基因工程设计的原理之一，④正确；质粒运载体将目的基因导入受体细胞并稳定存在即可表达，不一定要把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达，⑤错误；质粒是环状DNA分子，将目的基因与质粒重组需要使用限制酶，因此没有限制酶就无法使用质粒运载体，⑥正确，综上所述①④⑥正确，故选A。
知识点
DNA的粗提取与鉴定
1．实验材料的选取
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。
2．方法步骤
(1)粗提取DNA
(2)鉴定DNA
特别提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质和脂质。
(2)不用哺乳动物的血液作为实验材料，这是因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，不含DNA。
(3)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(4)沉淀DNA时必须用冷酒精。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
┃┃典例剖析__■
典例4 下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( B )
A．该实验不能选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料
B．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它不溶于2ml·L－1的NaCl溶液
C．该实验中加入体积分数为95%的预冷酒精可用来析出DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热
解析：由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不能作为提取DNA的材料，A正确；DNA可溶解在2ml·L－1的NaCl溶液中，B错误；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此提取DNA时，加入预冷的、体积分数为95%的酒精溶液可以除去蛋白质、析出DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会呈现蓝色，D正确。
┃┃变式训练__■
4．在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述不正确的是( D )
A．实验材料选择错误的组别是丙
B．沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁
C．甲组实验现象差的原因是25℃的酒精溶液对DNA的凝集效果差
D．乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂
解析：鸡血、菜花细胞中都含有DNA，而猪是哺乳动物，其成熟的红细胞中不含DNA，A项正确；甲、乙、丁的实验材料中都含有DNA，但乙为植物，将植物细胞放入蒸馏水中时，植物细胞不会吸水涨破，且DNA应该用二苯胺鉴定，而不能用双缩脲试剂鉴定，因此沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁，但因为25℃的酒精溶液对DNA的凝集效果差，所以甲组蓝色浅，B、C项正确，D项错误。
指点迷津·拨云见日
选择限制酶的方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。
知识贴士
不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
┃┃典例剖析__■
典例5 利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如下图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是( D )
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
解析：构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A项正确；分析图甲，HindⅢ的酶切位点在第二个EcRⅠ的酶切位点的左侧，因此用EcRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B项正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcRⅠ的酶切位点，因此用EcRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条DNA单链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C项正确；用EcRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可正向连接或反向连接，不止能产生一种重组DNA，D项错误。
解疑答惑
从社会中来⇨P70
提示：用到的“分子工具”：限制性内切核酸酶、DNA连接酶、载体。限制性内切核酸酶的特征：准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。DNA连接酶的特征：能将目的基因连接到载体上。载体的特征：能将目的基因导入受体细胞中。
旁栏思考1⇨P71
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是其在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，限制酶就是一种防御性工具。当外源DNA入侵时，原核生物会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，从而保护自身的作用。
旁栏思考2⇨P72
提示：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E．cliDNA连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到的，称为T4DNA连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键(在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成)，那么，二者的差别主要表现如下：
(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。
此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。
思考·讨论⇨P73
1．提示：“剪刀”代表限制酶，“透明胶条”代表DNA连接酶。
2．提示：如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选择不对(也可能是其他原因)。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一定要具有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端；否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
3．提示：不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
探究·实践⇨P74
结果分析与评价
1．提示：观察提取的DNA颜色：如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺法鉴定：二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新提取。
2．提示：本实验提取的DNA粗制品中有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3．提示：本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
进一步探究
提示：DNA纯化常用方法：将DNA黏稠物再溶解，继续用物质的量浓度为2ml/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解，以免损失。用3～4层纱布进行过滤(或离心)，滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积分数为95%的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。
此外，还有许多其他方法。例如，添加质量分数为25%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24∶1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液。可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于酚层中，这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。
练习与应用⇨P74
一、概念检测
1．C 提示：DNA连接酶的作用是连接两个DNA分子片段，既能连接黏性末端，也能连接平末端，形成磷酸二酯键。DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
2．A 提示：基因工程中使用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。
二、拓展应用
1．提示：细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
2．提示：(1)限制酶XbaⅠ。因为限制酶XbaⅠ切割B片段产生的黏性末端与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的黏性末端相同。
(2)识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
训练巩固·课堂达标
1．下列叙述符合基因工程概念的是( B )
A．在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因与质粒重组后导入大肠杆菌，获得能产生人的干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后，其DNA整合到细菌DNA上
解析：基因工程又叫重组DNA技术，是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程不能在生物细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，A不符合基因工程的概念；将人的干扰素基因与质粒重组后导入大肠杆菌，获得能产生人的干扰素的菌株，B符合基因工程的概念；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株，属于诱变育种，C不符合基因工程的概念；自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌，并将自身DNA整合到细菌DNA上，属于基因重组，D不符合基因工程的概念。
2．下列关于限制性内切核酸酶(限制酶)的叙述，正确的是( C )
A．均来源于原核生物
B．识别序列均由6个核苷酸组成
C．特异性表现在识别和切割两个方面
D．也可识别RNA分子的特定核苷酸序列
解析：限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，B错误；限制酶能识别特定的核苷酸序列，并切割特定核苷酸之间的磷酸二酯键，C正确；限制酶可识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，不能识别RNA分子的特定核苷酸序列，D错误。
3．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是( B )
A．图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精
B．图①和图③都需要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持其结构完整
C．若图③操作后接图②操作，则DNA会留在滤液中
D．若图④操作后接图②操作，则DNA会留在纱布上
解析：DNA不溶于酒精，95%的冷酒精凝集效果最佳，所以图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精，以便除去溶于酒精的杂质，提取含杂质较少(或较纯净)的DNA，A正确；图①玻璃棒沿逆时针方向搅拌，目的是提取出含杂质较少的DNA，图③玻璃棒沿逆时针方向搅拌，目的是加速细胞吸水破裂，B错误；图③操作是加入蒸馏水，破碎细胞，图②操作是过滤，获取含DNA的滤液，使DNA留在滤液中，C正确；图④操作是去除滤液中杂质，析出DNA，图②操作是过滤，将DNA留在纱布上，D正确。
4．(不定项)以下关于基因工程的操作工具，说法错误的是( ABD )
A．限制酶可以切割DNA和RNA
B．DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来
C．载体的作用是将目的基因导入受体细胞使之稳定存在并表达
D．切割质粒的限制酶均能特异性地识别6个核苷酸
解析：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割位点上切割DNA分子，A错误；DNA连接酶的作用是将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来，B错误；载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达，C正确；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，D错误。
新课程标准
核心素养
1．简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3．进行DNA的粗提取与鉴定。
1．科学思维——模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。
2．社会责任——关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生了基因工程。
知识导图
种类
比较
E．cliDNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
__大肠杆菌__
__T4噬菌体__
特点
只能连接__黏性末端__
既可以连接黏性末端，又可以连接__平末端__
项目
限制酶
DNA连接酶
不同点
作用
使特定部位的磷酸二酯键断裂
在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键
应用
用于提取目的基因和切割载体
用于基因表达载体的构建
关系
种类
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
催化形成磷酸二酯键
不
同
点
模板
不需要模板
需要以DNA的一条链为模板
作用
过程
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键
作用
结果
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
用途
基因工程等
DNA复制
基因工程中的载体
载体蛋白
来源
细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒
细胞膜上的蛋白质
作用
将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制
运载要进出细胞的某些物质
试管编号
A(对照组)
B(实验组)
步骤1
2ml·L－1的NaCl溶液5mL
2ml·L－1的NaCl溶液5mL
步骤2
不进行任何处理
加丝状物或沉淀物
步骤3
加4mL二苯胺试剂，混匀
加4mL二苯胺试剂，混匀
步骤4
沸水浴5min
沸水浴5min
实验现象
溶液不变蓝色
溶液逐渐变为蓝色
实验结论
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
组别
实验材料
提取核物质时
加入的溶液
去除杂质时加入的溶液
DNA鉴定时
加入的试剂
甲
鸡血
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(25℃)
二苯胺
乙
菜花
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(冷却)
双缩脲试剂
丙
猪血
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(冷却)
二苯胺
丁
鸡血
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(冷却)
二苯胺
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